Laboratorio de Ingeniera de Productos Biolgicos Marzo / 2017

Prctica No. 1

Prueba de efectividad de antibiticos en diferentes microorganismos

Objetivo general:

Trazar las lneas dosis-respuesta para la determinacin de la potencia de diferentes

antibiticos mediante las pruebas de valoracin microbiolgica especificadas en la FEUM
11va Ed.

Objetivos especficos:

Realizar las pruebas de valoracin microbiolgica de antibiticos (cilindro en placa y mtodo

turbidimtrico).
Analizar e interpretar los resultados obtenidos de las pruebas de valoracin microbiolgica
de antibiticos.

Introduccin

Los antibiticos son medicamentos utilizados para prevenir y tratar las infecciones bacterianas. La
resistencia a los antibiticos se produce cuando las bacterias mutan en respuesta al uso de estos
frmacos (OMS, 2017). La potencia o actividad de estos medicamentos se calcula comparando el
grado de inhibicin de microorganismos sensibles y especficos producida por concentraciones
conocidas del antibitico analizado y una sustancia de referencia. Para valorar microbiolgicamente
un antibitico, se pueden emplear dos mtodos: Mtodo cilindro-placa (mtodo de difusin en
agar) y mtodo turbidimtrico, ambos comparan la respuesta del microorganismo de prueba, frente
a una sustancia de referencia de actividad conocida y una muestra tratada en las mismas
condiciones.

Mtodo de cilindro en placa: Se basa en la difusin del antibitico desde un cilindro vertical, a travs
de una superficie con agar inoculado con el microorganismo de prueba. La difusin origina zonas de
inhibicin del microorganismo cuyo tamao (dimetro) est en relacin con la concentracin del
antibitico.

Mtodo turbidimtrico: Se basa en medir espectrofotomtricamente el crecimiento del

microorganismo de prueba en un medio de cultivo lquido que permite su rpido crecimiento y en
el que al adicionar concentraciones crecientes del antibitico se inhibe el crecimiento en forma
proporcional a la concentracin adicionada (MGA. 0100, FEUM 11va Ed. 2013).

Materiales y equipo

Antibiticos: Microorganismos:

Penicilina (1477 U/mg) Staphylococus aureus

Estreptomicina Bacillus subtilis
Tetraciclina

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Medios de cultivo : Diluyentes:

Medio para antibiticos No. 1 (agar y cido clorhdrico 0.1 N.

medio lquido). Solucin amortiguadora No. 1.
Medio para antibiticos No. 2.

Las siguientes tablas 0100.1 y 0100.2 describen el contenido de las soluciones amortiguadoras y de
los medios de cultivo.

Tablas tomadas de MGA. 0100 VALORACIN MICROBILGICA DE ANTIBITICOS, FEUM 11va Ed. 2013.

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Metodologa:

Preparacin de estndares

Para cada estndar de referencia en la tabla 0100.4 se indica el disolvente inicial, la concentracin
madre, diluyente final para construir las diluciones y la concentracin del punto medio para
construir la curva de tipo.

*Para preparar los estndares y sus diluciones primeramente debe preparar sus respectivos
diluyentes.

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Tablas tomadas de MGA. 0100 VALORACIN MICROBILGICA DE ANTIBITICOS, FEUM 11va Ed. 2013.

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Preparacin de diluyentes para preparar los estndares

1. Realice los clculos necesarios para obtener las siguientes soluciones.

Solucin amortiguadora No1. (Diluyente para penicilina)

Pesar 2.0 g de fosfato dibsico de potasio y 8.0 g de fosfato monobsico de potasio y disolver en un
litro de agua, ajustar el pH con cido fosfrico 18N o hidrxido de potasio 10N a pH 6.0 0.05),
esterilizar.

cido clorhdrico 0.1 N (Diluyente para tetraciclina)

Preparar 500 mL de solucin de cido clorhdrico 0.1N (pureza 36%, =1.18 g/mL).

Agua (Diluyente para y estreptomicina)

Soluciones adicionales

Solucin salina estril 500 mL (Para rede-suspender inculo).

Solucin de formaldehdo 12% preparar 100 mL (Para el mtodo turbidimtrico).

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Estndar de penicilina

1. Pesar la cantidad necesaria para obtener 500 mL de una solucin madre de concentracin
100 U/ml .
*Preparar primeramente la Solucin amortiguadora No. 1 y utilizar como disolvente tanto
para la preparacin del estndar como para las diluciones.
*Slo un equipo de los que analizar penicilina preparar el estndar y el otro equipo
preparar la solucin amortiguadora y lo compartirn.

Clculos para preparar solucin madre:

Datos

Estndar de Penicilina: 1477 U/mg

Concentracin final: 100 U/mL
Volumen final: 500 mL

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2. Realizar las diluciones con solucin amortiguadora No. 1 para preparar una curva de 5
puntos con concentraciones de penicilina de 0.2 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL y 2.0
U/mL.

Clculos:
Concentracin solucin madre= 100 U/mL
Concentraciones para la curva= 0.2 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL y 2.0 U/mL
Volumen final de diluciones=10 mL

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Estndar de tetraciclina

1. Pesar la cantidad necesaria para obtener 100 mL de una solucin de tetraciclina con
concentracin de 1 mg/mL.
* Primeramente preparar el disolvente cido clorhdrico 0.1N, utilizar como
disolvente para amabas soluciones madre.
*Ojo, las diluciones del estndar se hacen con agua.
*Slo un equipo de los que analizar tetraciclina preparar el estndar (solucin madre
1 y 2) y el otro equipo preparar el disolvente cido clorhdrico 0.1N.

Clculos:

Concentracin final: 1 mg/mL

Volumen: 100 mL

2. De la solucin madre anterior obtener 100 mL de una segunda solucin madre de

tetraciclina concentracin 10 g/mL

Clculos:

Concentracin solucin madre inicial: 1 mg/mL = 1000 g/ mL

Concentracin final segunda solucin madre =10 g/mL
Volumen final= 100 mL

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3. A partir de la segunda solucin madre realizar las diluciones con Agua para preparar
una curva de 5 puntos con concentraciones de tetraciclina de 0.1 g /mL, 0.15 g /mL,
0.24 g /mL, 0.5 g /mL y 1 g /mL
Clculos:
Concentracin solucin madre segunda solucin madre= 10 g/ mL
Concentraciones para la curva= 0.1 g /mL, 0.15 g /mL, 0.24 g /mL, 0.5 g /mL y 1 g
/mL
Volumen final de diluciones=10 mL

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Estndar de estreptomicina

1. Pesar la cantidad necesaria para obtener 100 mL de una solucin de estreptomicina con
concentracin de 1 mg/mL.
* Utilizar como disolvente Agua tanto para la solucin madre como para las
diluciones.

Clculos:

Concentracin final: 1 mg/mL

Volumen: 100 mL

2. A partir de la solucin madre realizar las diluciones para preparar una curva de 5 puntos
con concentraciones de estreptomicina de 10 g /mL, 20 g /mL, 30 g /mL, 40 g /mL
y 50 g /mL.
Clculos:
Concentracin solucin madre= 1000 g/mL
Concentraciones para la curva= 10 g /mL, 20 g /mL, 30 g /mL, 40 g /mL y 50 g/mL
Volumen final de diluciones=10 mL

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Preparacin del inculo

1. En un tubo de agar nutritivo sembrar el microorganismo de prueba en posicin inclinada e

incubarlo durante 24 h.
2. Al momento de utilizar, aadir solucin salina estril suficiente para obtener una solucin
ajustada al 25% de transmitancia a 580 nm.
*Un equipo preparar 500 mL de solucin salina estril.

Preparacin de medios de cultivo

1. Preparar los medios de cultivo (No. 1 y No. 2) a partir de las mezclas deshidratadas
comerciales siguiendo las indicaciones del fabricante (calcular la cantidad necesaria a
preparar conforme a lo sealado en la metodologa).

Preparacin de cilindros

1. Para obtener los cilindros deber cortar la cabeza de puntas para micro pipeta.

Mtodo de difusin en agar

Preparacin de las placas

1. Aadir 20 mL del medio No. 2 en cada caja Petri (1 caja por dilucin), y dejar solidificar.
2. Por cada 100 mL de medio No. 1, aadirle 0.1 mL de la suspensin del inculo ya ajustada a
25% de transmitancia a 580 nm (S. aureus o B. Subtilis segn sea el caso).
*No inocule todo el medio ya que necesitar aproximadamente 10 mL de medio sin inocular
para el mtodo turbidimtrico.
3. Aadir 10 mL del medio No. 1 inoculado sobre cada una de las cajas Petri gelificadas con
medio No 2. y dejar solidificar nuevamente.
4. Una vez solidificado, colocar dos cilindros equidistantemente sobre las placas gelificadas y
aadir 50 L de cada una de las diluciones de la curva de antibitico de prueba dentro del
mismo.
5. Incubar a 37 C por 24 h.
6. Medir el halo de inhibicin (dimetro) formado.

Resultados del mtodo difusin en agar

Antibitico: _____________ Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin
Cepa de prueba: 1 2 3 4 5
_______________________ [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

Halo de inh.(mm) Cilindro 1

Halo de inh. (mm) Cilindro 2
Promedio (mm)

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Mtodo turbidimtrico

*Realizar este ensayo por triplicado.

*Preparar un bao mara a 37 C dnde quepa su gradilla con los tubos correspondientes.

*Preparar una solucin de formaldehdo al 12% (un equipo preparara 100 mL y compartirn entre
el grupo).

1. En 5 tubos de ensaye colocar 9 mL de medio No. 1 inoculado adems incluir un tubo control
con 9 mL de medio No. 1 inoculado.
2. A cada tubo aadir 1 mL de las diluciones de la curva de antibitico estndar, al tubo control
aadir 1 mL de diluyente final sin antibitico segn sea el caso.
3. Colocar la gradilla en un bao mara (el tiempo de incubacin se detiene una vez que el tubo
de concentracin media se observa una turbiedad cercana al 50% de transmitancia, de 2 a
5 h).
4. Despus de la incubacin aadir 0.5 mL de formaldehdo al 12% en cada tubo.
5. Leer la transmitancia de cada tubo a una longitud de onda de 530 nm, utilizando como
blanco medio No. 1 sin inocular con 0.5 mL de formaldehdo, promediar los valores
obtenidos en cada tubo.

Resultados del mtodo turbidimtrico

Antibitico: _____________ Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin

Cepa de prueba: 1 2 3 4 5
_______________________ [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

Transmitancia% Tubo 1
Transmitancia% Tubo 2
Transmitancia% Tubo 3
Promedio

Tratamiento de los resultados obtenidos

*Se deben reportar los resultados de todos los equipos.

Mtodo de difusin en agar

Trazar la lnea dosis-respuesta usando la concentracin en microgramos por mililitro

(g/mL) o en unidades por mililitro (U/mL) en las ordenadas (escala logartmica) y el
promedio del dimetro de las zonas de inhibicin en las abscisas (escala milimtrica).
Haga un anlisis de la grfica anterior, discuta sus resultados y la utilidad de la grfica
obtenida.

Mtodo turbidimtrico

Trazar la lnea dosis-respuesta colocando los valores de la concentracin en la escala

logartmica y los valores de transmitancia en la escala milimtrica.
Haga un anlisis de la grfica anterior, discuta sus resultados y la utilidad de la grfica
obtenida.

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