Agrobiotecnologa

Curso 2016

Las plantas como biorreactores

Dra. Alicia M. Zelada

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires

Sumario
Las plantas como biorreactores
- Sistemas de expresin
- Las plantas como sistema alternativo
- Ventajas
- Costos comparativos entre distintos sistemas

Elementos a considerar en una estrategia

de expresin
- Nivel de expresin
- Sistemas de expresin integrativos
y no integrativos
- Optimizacin de costos de purificacin

Aplicaciones
- Expresin de antgenos para la produccin de vacunas
- Produccin de anticuerpos
Agrobiotecnologa - Produccin de protenas de inters farmacolgico
- Otras aplicaciones
Las plantas como
biorreactores
Referencias

1
 Las plantas como biorreactores

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Sistemas de expresin de protenas recombinantes

PROCARIOTA

Bacterias: E. coli

Plataformas
establecidas
Levaduras: Saccharomyces - Metilotrficas

Clulas animales
EUCARIOTAS

Clulas de insectos
Plataformas
emergentes
Animales transgnicos

Plantas

2
Limitaciones de las plataformas de produccin en
Bacterias, Levaduras y Clulas animales

El plegamiento de protenas de origen eucaritico

sintetizadas en bacterias puede ser incorrecto

Los costos para aumentar la escala de produccin

son altos en los tres casos

Requieren de personal tcnico especializado

Pueden causar grandes prdidas econmicas por

contaminacin en la lnea de produccin

Riesgo biolgico: presencia de contaminantes en

el producto final ENDOTOXINAS / PRIONES VIRUS

Algunas ventajas de la utilizacin de las plantas como

biorreactores

Permiten una alta produccin de biomasa

El aumento en la escala de la produccin es

sencillo y requiere bajos costos de inversin

No requieren de personal tcnico especializado

No implican riesgos de contaminacin con

patgenos animales o toxinas microbianas

3
Algunas ventajas de la utilizacin de las plantas como
biorreactores

Los mecanismos de sntesis y secrecin de

protenas y las modificaciones post-
traduccionales son las clulas eucariotas

Permiten el almacenamiento estable de la

protena recombinante en semillas y tubrculos

Gozan de una mayor aceptacin pblica respecto de la

manipulacin de animales.

Los costos de produccin de protenas recombinantes en

plantas son potencialmente menores que en otros sistemas

Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.

Estimacin de los costos de produccin en funcin

del nivel de expresin de IgA en distintos sistemas.

4
 Elementos a considerar
en una estrategia de expresin

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Factores a
considerar en el La produccin competitiva de protenas
diseo de una recombinantes en plantas requiere el diseo
estrategia de de estrategias de expresin que cumplan con
expresin en tres premisas fundamentales:
plantas

- Obtener altos niveles de expresin.

- Disminuir los costos de purificacin.

- Conseguir un producto de caractersticas

idnticas al sintetizado en el sistema de
. origen.

5
La expresin de la protena recombinante puede optimizarse
mediante diversas estrategias

Promotor 5UTR ar ss GEN KDEL Terminador transcripcional

Regulacin de los niveles de expresin ARNm

Eleccin de secuencias promotoras de la transcripcin adecuadas

(promotores tejido especficos, inducibles, constitutivos, etc.).

Utilizacin de secuencias reguladoras y regiones no traducidas 5 y 3 apropiadas.

Eliminacin de secuencias desestabilizantes del ARN mensajero o

incorporacin de secuencias que estabilicen el ARNm.

La expresin de la protena recombinante puede optimizarse

mediante diversas estrategias

Promotor 5UTR ar ss GEN KDEL Terminador transcripcional

Regulacin de los niveles de expresin de la protena

Optimizacin del uso de codones (vegetalizacin de la secuencia).

Utilizacin de secuencias seal para la localizacin en distintos

espacios subcelulares o extracelulares.

6
Sistemas de expresin en plantas

Sistemas de expresin en plantas

Integrativos y no integrativos

Plantas Plantas
transgnicas transplantmicas
nucleares (cloroplastos)
Integrativos
Expresin estable heredable a
la progenie

No integrativos
Expresin transitoria

Vectores
virales

7
 Sistemas de expresin integrativos
Plantas transgnicas nucleares

La estrategia Sistemas de expresin integrativos

a elegir debe
Plantas transgnicas nucleares
considerar Ventajas
las ventajas y - Expresin estable heredable por la progenie.
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamao
limitaciones de de la secuencia a introducir.
cada sistema - Modificacin postraduccional de protenas propia de clulas
eucariotas (glicosilacin-fosforilacin).
de expresin Limitaciones
- Niveles de expresin relativamente bajos.
- Niveles de expresin afectados por silenciamiento gnico
postranscripcional.

8
El nivel de La acertada eleccin y combinacin de las secuencias
expresin promotoras y reguladoras de la transcripcin y de la
traduccin puede determinar variaciones importantes
depende
en los niveles de expresin de la protena recombinante
de la utilizacin
adecuada de Contrucciones utilizadas para transformar Nivel de expresin
(% de la protena
las regiones plantas de Arabidopsis thaliana total soluble)

reguladoras Parc 5UTR ar ss G4 myc KDEL 3arc 10%

Parc W ss G4 myc KDEL 3arc 5%

Pphas 5UTR ar ss G4 myc KDEL 3arc 36%

P35S 5UTR ar ss G4 myc KDEL 3arc 1%

Adaptado de: Geert De Jaeger, Nat. Biotech. 2002.

Agrobiotecnologa Parc: promotor de arcelina de Phaseolus vulgaris.

Pphas: promotor de -faseolina de Phaseolus vulgaris.
Las plantas como W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
biorreactores ss: secuencia seal de envo a retculo endoplsmico.
KDEL: secuencia de retencin en retculo endoplsmico
G4 myc: secuencia que codifica un anticuerpo de simple cadena

Los costos
de purificacin
pueden
reducirse Rizosecrecin en cultivos hidropnicos y
explotando secrecin en clulas en cultivo.
caractersticas
Acumulacin en las semillas u otros rganos
propias de almacenamiento para la co-extraccin con
de las plantas productos convencionales como almidn o
aceites.

Protenas de fusin que facilitan su purificacin:

oleosinas-liquenasa termoestable

Agrobiotecnologa Produccin directa en las partes comestibles

de la planta.
Las plantas como
biorreactores

9
La rizosecrecin
El gen de inters se fusiona a una secuencia seal de
permite reducir . transporte al retculo endoplasmtico para direccionar
los costos de . el producto correspondiente a la va de secrecin.
purificacin Sitio de procesado de la seal

secuencia seal secuencia de inters

Inicio de la traduccin

La protena recombinante se obtiene por purificacin

a partir de la solucin hidropnica que circula en torno
a la rizsfera.

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Tomado de: Finer, J. Nat. Biotech., 1999.

Rizosecresin
La expresin de la xilanasa de Clostridium
de la xilanasa thermocellum se utiliz como un
de Clostridium modelo de produccin por rizosecrecin.
thermocellum Construccin utilizada para la
en tabaco transformacin de plantas de tabaco

transgnico p35SCaMV secuencia seal xilanasa

Planta no transformada Planta transgnica

Halo de
degradacin
del sustrato
generado
por la
xilanasa
rizosecretada

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores Tomado de: Borisjuk et al. Nat. Biotech., 1999.

Las plantas de tabaco se cultivaron en medio conteniendo

Remazol Brilliant Blue-xilano como sustrato para la xilanasa.

10
 Aumento del rendimiento de rizosecrecin por infeccin
con Agrobacterium rhizogenes

Las fusiones La protena de inters se fusiona a una oleosina,

a oleosinas protena que normalmente forma parte de los
cuerpos grasos de las semillas.
permiten
reducir los
Oleosina Gen de inters
costos de
purificacin Sitio de reconocimiento
para una proteasa

Cuerpos grasos

Agrobiotecnologa

Las plantas como Cuerpos proteicos

biorreactores

Adaptado de: www.sembiosys.com

11
La purificacin
a partir de los Purificacin de la protena recombinante
cuerpos a partir de los cuerpos grasos

grasos es
un proceso
sencillo

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

La produccin de hirudina fusionada a oleosinas en plantas

de Brassica napus permite purificar la protena activa
HIRUDINA: pptido presente en la saliva de la sanguijuela= actividad anticoagulante

Trypsin like serine protease

Tomado de: Parmenter, et al., Plant Mol. Biol., 1995.

12
Produccin de protenas fusionada a oleosinas en plantas de crtamo
(Carthamus tinctorius)- Tecnologa patentada por Sembiosys

Porqu crtamo?

CARTAMO: Oleaginosa altamente productiva cuya semilla puede ser almacenada por largos
periodos
CARTAMO es poco cultivada por lo cual es fcilmente separada de otras producciones de
crtamo
CARTAMO se autopoliniza y no tiene malezas emparentadas

Protenas en desarrollo

INSULINA Diabetes Ensayos clnicos Fase I y

II-2008
APOLIPROTENA A Enfermedades Ensayos preclnicos en
cardiovasculares modelos animales
OLEOSOMAS Esttica Comercializacin

Produccin de insulina humana fusionada a oleosinas en

plantas de crtamo (Carthamus tinctorius)
Izquierda: Separacin en PAGE-SDS de extractos proteicos totales de
plantas transformadas con la fusin oleosina/insulina y de la fraccin de
oleosinas de las mismas plantas. Wt: control no transformados; 4405-4, -
15 y 19: distintas fracciones de purificacin de muestras de plantas
transformadas. La flecha seala la posicin del estndar de insulina.

Abajo: Cambios temporales en los niveles de glucosa en ratones

tratados con placebo salino (cuadrados abiertos), extracto de
plantas no transformadas (crculos llenos), insulina humana
estndar (tringulos y crculos abiertos) e insulina derivada de
plantas que producen fusiones oleosina/insulina (cuadrados llenos).

Arriba: Anlisis comparativo por de insulina humana (hIN)

y de insulina fusionada a oleosina (OB-hIN) obtenidas por
separacin en cromatografa lquida de alto rendimiento.

13
Humanizacin Los patrones de N-glicosilacin en plantas difieren
de los presentes en mamferos.
de las
Esto puede alterar la inmugenicidad, resistencia a la
glicoprotenas degradacin proteoltica y actividad biolgica de la
recombinantes protena expresada, particularmente en anticuerpos.

Asn Asn
a -1,3 a-1,6
NAcGlc Fuc NAcGlc Fuc

NAcGlc NAcGlc

Glicanos complejos
Man Man
en mamferos
Man Man Man Man
Xyl
NAcGlc NAcGlc NAcGlc NAcGlc NAcGlc

Gal Gal Gal

Glicanos complejos
AcNeu AcNeu AcNeu
en plantas

Se estn ensayando diversas estrategias para humanizar

las glicoprotenas recombinantes expresadas en plantas:
Agrobiotecnologa
- Expresin de la (1,4)-galactosiltransferasa humana en plantas
Las plantas como transgnicas.
biorreactores - Retencin de la protena en el retculo endoplsmatico.
- Inactivacin de la a(1,3)-fucosiltransferasa y la (1,2)-xilosiltransferasa
de plantas.

La especie a Tabaco
utilizar debe Sistema de transformacin bien establecido.
Produccin de abundante biomasa.
seleccionarse
Papa
de acuerdo Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en tubrculos.
Procesamiento industrial de los tubrculos bien establecido.
con las Contenido proteico en tubrculos relativamente bajo.
necesidades Tomate
de produccin Consumo de los frutos crudos.
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en frutos.
de la protena Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido.
Contenido proteico en frutos relativamente bajo.
a sintetizar Cereales
Tecnologa de produccin ampliamente establecida.
Almacenamiento estable de la protena recombinante en las semillas.
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.
Alfalfa
Alto contenido proteico en hojas.
Agrobiotecnologa Produccin de biomasa abundante.

Las plantas como Lemna

biorreactores Alta eficiencia de proliferacin clonal.
Alta tasa de duplicacin de la biomasa.
Rizosecresin muy eficiente.

14
 Sistemas de expresin integrativos
Sistema de expresin en Lemna

Planta acutica comestible (Lemnaceae)

Rpido y flexible
Alta productividad debido alta tasa de crecimiento y altos niveles de
expresin (35-40% peso seco)
Bajos costos
Bioseguridad se realiza en confinamiento y no hay riesgo de
contaminacin con patgenos humanos

Sistemas de expresin integrativos

Sistema de expresin en Lemna

Lemna Gene TM Tecnologa de producin basada en Lemna

Protenas recombinantes para industria veterinaria y

farmaceutica
Vacunas recombinantes humanas y animales
Anticuerpos monoclonales
Aditivos como enzimas y probiticos

IFN-alpha2b
BLX-301, anti-CD20 non-Hodgkin's B-cell linfoma humanizado
BLX-155, a tromboltico

Los productos puede ser producidos:

Puro: el ingrediente activo puede ser purificado

Seco: las plantas pueden ser deshidratadas y presentadas
como cpsulas, tabletas o polvo
Fresco: puede ser utilizadas directamente para alimentacin

15
 Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplantmicas

La estrategia Sistemas de expresin integrativos

a elegir debe Plantas transplastmicas (cloroplastos)
considerar Ventajas
- Niveles de expresin potencialmente altos.
las ventajas y - Expresin estable heredable por la progenie.
limitaciones de - Ausencia de limitaciones importantes en el tamao
de la secuencia a introducir.
cada sistema - No hay efectos de posicin (transformacin por
recombinacin homloga).
de expresin - Ausencia de silenciamiento gnico.
- Introduccin de policistrones.
- Transferencia horizontal del transgn escasa o nula.
- Formacin de puentes disulfuro y menor complejidad de
proteasas
Limitaciones
- No existen mecanismos de glicosilacin.

16
 Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplastmicas (cloroplastos)

Protenas terapeuticas y antibiticos producidas en cloroplastos 2008-2011

Sistemas de expresin integrativos

Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Antgenos producidos en cloroplastos 2008-2011

17
 Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Limitacin: altos costos de purificacin de las protenas a partir de
extractos de plantas

Sistemas de expresin no integrativos

Vectores virales

18
 Sistemas de expresin no integrativos
Vectores virales

Ventajas
- Niveles de expresin potencialmente altos
- No se integran al genoma- No tienen efecto de posicionamiento
- Corto tiempo de desarrollo y produccin
- Permite el direccionamiento de protenas a compartimiento
subcelulares o al espacio apoplstico.
- Permite la modificacin postraduccional de protenas

Limitaciones
- Limitaciones en el tamao de la secuencia introducida
- Inestabilidad gentica de la secuencia introducida.
- Silenciamiento gnico

Sistemas de expresin no integrativos

Vectores virales

1. Infeccin inicial
PVX

2. Movilizacin viral clula a clula

3. Movilizacin sistmica

TMV

19
Potexvirus. Potato virus X

Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor T7

Expresin transitoria

20
 Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor para
expresin en plantas
Genoma viral ARN

Obtencin del ADNc del

genoma viral completo
ADNc del ADNc
genoma viral
Clonado del ADNc en un
vector binario para expresin
en plantas. Introduccin de
un sitio de clonado mltiple
Amplicn viral 35SCaMV ADNc t-nos
SCM
Clonado del gen de inters
Amplicn viral
recombinante 35SCaMV Gen X t-nos

Bombardeo del ADN infectivo

Agroinfiltracin
Agrospray
Expresin transitoria

Los vectores y Esquema

de la expresin
los amplicones de un gen forneo

virales a partir de un
vector y de un

amplifican la amplicn viral

de un virus
expresin de a ARN en
comparacin
los genes con la expresin

forneos de un gen forneo

por expresin
nuclear.

21
 Se pueden utilizar diferentes estrategias para expresar
genes forneos en vectores virales

Virus representativo

Reemplazo gnico

Insercin gnica

Presentacin de epitopes *
A B
Complementacin

A: Fusin traduccional de una pequea secuencia dentro del gen de la protena de la cpside.
B: Translectura traduccional de un codn de terminacin mbar (*) en el extremo 3
Genes virales
Reemplazo gnico
Bromovirus Genes forneos
Caulimovirus Complementacin
Furovirus Alfamovirus
Caulimovirus Insercin gnica
Geminivirus
Dianthovirus Caulimovirus
Hordeivirus
Geminivirus Presentacin de epitopes
Potexvirus Geminivirus
Potexvirus Comovirus
Tobamovirus Potexvirus
Potyvirus Tobamovirus
Tobravirus Tobamovirus
Tobamovirus Tombusvirus
Tombusvirus Tombusvirus

Vectores virales de 1era y 2da generacin

Vectores de 1era generacin o Virus completo

Infecta sistmicamente
Agroinfiltracin o Agrospray
Bioseguridad baja

22
Agroinfiltracin por jeringa

Rpida: la protena recombinante puede

obtenerse en aproximadamente una
semana.

Simple: slo se requiere equipamiento

bsico.

Flexible: puede utilizarse para producir

protenas de membrana, enzimas o virus
quimricos.

Laborioso: no compatible con una

produccin a gran escala

Vectores virales de 1era y 2da generacin

Vectores de 2da generacin o Virus desarmado
No infectan sistmicamente
Mtodo de inoculacin: Magnifection
Permite expresar transgenes de mayor tamao
Mayor estabilidad de los transgenes
Bioseguridad alta

23
 Magnifection. Agroinfiltracin por vaco.

Rpida
6-10 das.

Eficiente:
1-5 g protena/kg hoja

Escalable

Complejo Se requiere
equipamiento especfico y
standard

Flexible: puede utilizarse

para producir protenas de
membrana, enzimas o
virus quimricos.

Companias de base biotecnolgica para la produccin de

protenas en plantas

Icon Genetics. Alemania.

Vector TMV 2da generacin

Magnifection

24
 Companias de base biotecnolgica para la produccin de
protenas en plantas

Large Scale Biology Corp. EEUU. 2006

Vector TMV 1era generacin
Inoculacin mecnica

KBP 2008 Nuevas tecnologas

Companias de base biotecnolgica para la produccin de

protenas en plantas

KBP, Kentucky 2012

25
 NUCLEAR CLOROPLASTOS VECTORES
VIRALES
Niveles de Bajos niveles de Altos niveles de expresin Altos niveles de
expresin expresin (0,01-0,1 % (1-10%) expresin (1-10%)
TPS)

Tiempo de Largo Mediano Corto

evaluacin de 6-24 meses 3-12 meses 1-2 semanas
construcciones

Efecto Si No No
posicionamiento
gnico

Estabilidad de las Alta Alta Baja

secuencias

Plantas en que se Limitado a la Muy limitado a la Limitado al rango

puede expresar disponibilidad de disponibilidad de protocolos de hospedante
protocolos de de transformacin
transformacin

Silenciamiento Si, PTGS No Si, VIGS

post-transcripcional

Modificaciones Si No Si
post-
transduccionales
Bioseguridad Media Alta Baja

Expresin de antgenos para la

produccin de vacunas

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

26
 Vacunas a subunidades:
Las plantas
constituyen Seguras
un sistema Poco inmunognicas
alternativo Inyeccin
para la
produccin
de vacunas a Ventajas de las vacunas en plantas:
subunidad
Bajo costo de produccin.
Eliminacin de la cadena de fro durante el transporte.
Expresin de mltiples antgenos y adjuvantes en un
mismo sistema.
Posibilidad de inmunizacin oral por produccin de
Agrobiotecnologa
antgenos en plantas comestibles
Las plantas como
biorreactores

Vacunas orales en plantas

VENTAJAS DESVENTAJAS

Supervivencia del antgeno en el

Menores requerimientos de asistencia
mdica para su administracin.
Menor riesgo de transmisin de
enfermedades asociadas a la indebida
reutilizacin de jeringas y agujas.
Induccin de respuesta inmune a
nivel sistmico y de mucosas.
tracto digestivo
Induccin de una respuesta inmune
Promocin de una proteccin
adecuada
Ausencia de efectos de tolerancia
Ausencia de inmunogenicidad del
vehculo vegetal

Aunque originariamente se pens en emplear el tejido vegetal sin

procesar, actualmente se considera utilizar el tejido liofilizado. Esto
permitira controlar mejor la dosis ingerida y evitar efectos de tolerancia

27
 Vacunas basadas en vectores virales

Partculas virales quimricas son potentes inmungenos

(humoral y celular)

Los agregados de protenas virales son buenos adjuvantes

La expresin de epitopes como fusiones a las protenas de

cpside permite una abundante produccin.

El proceso de purificacin de las partculas virales quimricas es

un proceso simple y de alto rendimiento.

Los viriones purificados pueden ser establemente almacenados.

Vacunas en
Importancia epidemilogica de la hepatitis B
fase clnica:
Es una viremia persistente con 300 millones
hepatitis B de portadores en el mundo.
La vacuna actual se produce en levaduras que expresan
el antgeno de superficie HBsAg. Es efectiva, pero
costosa, por lo que se distribuye poco en los pases
subdesarrollados.
Se ha reportado la expresin de HBsAg en plantas de
tabaco, papa, lechuga y se encuentra en estudio su
expresin en tomates y bananas.

Expresin de HBsAg
en tubrculos de papa.

El antgeno recombinante forma

Agrobiotecnologa
estructuras vesiculares similares
Las plantas como a las observadas en el suero de
biorreactores pacientes infectados con HBV.

Tomado de: Kong et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.

28
Expresin Se compararon los niveles de expresin de HBsAg
del virus humano de hepatitis B en tubrculos de papa
de HBsAg utilizando distintas construcciones genticas.
en plantas
transgnicas
de Solanum
tuberosum

Tomado de: Richter et al., Nat. Biotech., 2000.

TEV:secuencia enhancer traduccional de Tobacco etch virus.

Agrobiotecnologa W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
vspaS: pptido seal de la protena VSP de soja.
Las plantas como vspaL: seal de transporte vacuolar de la proteina VSP de soja.
biorreactores NOS 3: terminador de nopalina sintetasa.
VSP 3: terminador de la protena VSP de soja.
Pin2 3: terminador del inhibidor de proteinasa II de papa.
SEKDEL : seal de retencin en RE.

La inmunizacin oral con tubrculos HB114-16 es comparable a

la obtenida con la vacuna producida en levaduras
Inmunizacin oral con HBsAg
Imnunizacin oral con rHBsAg Imnunizacin oral con HBsAg expresado en tubrculos previamente
purificado de levaduras expresado en tubrculos de papa inmunizados con rHBsAg purificado
de levaduras

Se suministraron 2 dosis de 150 mg de
rHBsAg cada una, en las semanas 0 y 1, y
una dosis de 0,5 mg en la sexta semana
(dosis subinmunognica).
CT: adyuvante, toxina del clera
Se seala el ttulo del antisuero obtenido.
Lnea anaranjada: control de ratones no
inmunizados
Se suministraron tres dosis orales de 5 g de tubrculos de papa transgnica (HB114-16),
conteniendo un promedio de 42 mg de HBsAg cada una, antes o despus de una
inmunizacin con 0,5 mg de antgeno purificado de levaduras (rHBsAg). Se sealan los ttulos
de los antisueros obtenidos en cada caso. Lnea anaranjada: controles de ratones
alimentados con papas no transgnicas.

Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.

29
La respuesta
inmune
disminuye con La eliminacin del
adjuvante (CT: toxina
la eliminacin colrica) en los
esquemas de
del adyuvante o inmunizacin lleva a
la coccin de una fuerte disminucin
de la respuesta inmune
los tubrculos

La coccin previa de
los tubrculos
disminuye pero no
elimina la respuesta
Agrobiotecnologa inmune.

Las plantas como

biorreactores

Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.

Inmunizacin En 2 de los 3 voluntarios inmunizados con hojas de

oral de lechuga transgnica se detect un ttulo de anticuerpos
anti-HBsAg protectivo luego de la segunda dosis
humanos
con lechuga Esquema de
transgnica inmunizacin:

que produce Primera dosis:

200 g de hojas
HBsAg
Segunda dosis
(a las 8 semanas):
150 g de hojas

Concentracin del
HBsAg en tejido de
lechuga: 1 a 5 ng/g
tejido fresco

Agrobiotecnologa

Las plantas como Tomado de: Kapusta et al., FASEB J., 1999.

biorreactores Para conferir proteccin en humanos deben

registrarse en sangre niveles de anticuerpos
anti-HBsAg de al menos 10 mUI/ml

30
Comovirus. Cowpea mosaic virus

Potexvirus. Potato virus X

31
PVX. Produccin de vacunas contra la tuberculosis

Presentacin de epitopes de Human Rhinovirus (HRV) en Cowpea mosaic

virus

32
 Vacuna terapeutica: Produccin de anticuerpos scFV para el
tratamiento del linfoma non-Hodgkins-TMV vector
TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors
Pathogen or Disease
Vectores
Insertion vectors
basados en Foot and mouth disease virus
Hepatitis C virus
Bovine herpes virus
TMV Colorectal cancer
Human immunodeficiency virus-1
Human immunodeficiency virus-1
Dengue virus
Mycobacterium bovis
Replacement vectors
Human papilloma virus
Yersinia pestis
Bacillus anthracis
Influenza
Modular vectors
Yersinia pestis
Smallpox virus
Peptide display vectors
Agrobiotecnologa
Human immunodeficiency virus-1
Influenza virus
Vectores basados Plasmodium falciparum
en virus vegetales Pseudomonas aeruginosa
Canine oral papilloma virus
Melanoma
Mycobacterium bovis
Pseudomonas aeruginosa
Antigens References
VP1 protein Wigdorovitz et la. 1999
Hypervariable region I Nemchinov et al. 2000
Glicoprotein D Perez Filgueira et al. 2003
Ga733-2 antigen Verch et al. 2004
Tat protein Karasev et al. 2005
p24 protein Perez Filgueira et al. 2004
Domain III of E protein Saejung et al. 2007
ESAT6-Ag85 antigens Dorokhov et al. 2007
E7 protein Massa et al. 2007
F1 and V proteins Mett et al. 2007
PA and LF domains Chichester et al. 2007, 2009
Hemoagglutinin Shoji et al. 2008, 2009
F1 and V proteins Santi et al. 2006
pBS antigen domain Golovkin et al. 2007
Glicoprotein 41 Durrani et al. 1998
HA epitope Sugiyama et al. 1995
Several epitopes Turpen et al. 1995
F protein epitopes Staczek et al. 2000
L2 protein Smith et al. 2006
p15-Trp2 epitopes Mc Cormick et al. 2006a, 2006b
ESAT6-Ag85 antigens Dorokhov et al. 2007
F protein epitopes Gilleland et al. 2000
33
TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors

Vectores
basados en Pathogen or Disease Antigens or Antibodies References

PVX Insertion vectors

Human papilloma virus E7 protein Franconi et al. 2002

Avian Influenza A virus M2 protein ectodomain Nemchinov and Natilla 2007
Toxoplasma gondii SAG1 protein Clemente et al. 2005
Toxoplasma gondii Gra4 peptide Ferraro et al. 2008
Hepatitis B virus nucleocapsid protein Mechtcheriakova et al. 2006
Transmissible gastroenteritis virus derivate antibody Monger et al. 2006

Peptide display vectors

Human immunodeficiency virus-1 capside epitopes Marusic et al. 2001

Plasmodium falciparum Several epitopes Turpen et al. 1995
Human papilloma virus E7 protein Franconi et al. 2002
Classical Swine Fever virus E2 glicoprotein peptides Marconi et al. 2006
Mycobacterium tuberculosis ESAT6 antigen Zelada et al. 2006
Agrobiotecnologa Human papilloma virus-16 E7 and L2 epitopes Cerovsk et al. 2008
Newcastle disease virus F protein epitope Natilla et al. 2006
Murine rotavirus VP6 protein O' Brien et al. 2000
Vectores basados
en virus vegetales

Ejemplos de antgenos expresados en plantas transgnicas

34
 Produccin de anticuerpos

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Los genes que codifican los cuatro polipptidos de las

La produccin inmunoglobulinas secretorias se acumulan en una misma
de anticuerpos planta por cruzamientos sucesivos entre plantas
transgnicas individuales y sus descendientes recombinantes
en plantas PLANTIBODIES
transgnicas
permite
ensamblar
molculas de
Ig complejas

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

35
Expresin La bacteria Streptococcus mutans es uno de los principales
agentes causales de la caries dental. El antgeno de superficie
del AgI/II participara en la interaccin hidrofbica entre S. mutans
anticuerpo y un complejo de glicoprotenas de alto peso molecular
presente en la superficie dental.
monoclonal
Estrategia:
anti-AgI/II en
Expresar el anticuerpo monoclonal murino anti-AgI/II en
plantas de Nicotiana tabacum con el fin de obtener grandes cantidades
tabaco del mismo.

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Adaptado de: Ma et al., Science, 1995.

Luego del tratamiento con un agente antisptico, la presencia

El anticuerpo del anticuerpo anti AgI/II evitara la recolonizacin de los
anti Agl/II nichos en la superficie dental por Streptococcus mutans.

actuara
alterando la
dinmica de
repoblacin
de la superficie
dental

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores
Adaptado de: www.planetbiotechnology.com

CaroRxTM
Planet Biotechnology

36
La inmunizacin pasiva local de humanos con anti-AgI/II
producido en plantas otorga proteccin contra S. mutants

Recolonizacin de Streptococcus mutants en la cavidad oral de voluntarios humanos

previamente tratados con gluconato de clorohexidina (CHX) para eliminar la flora oral

Tomado de: Ma. et al., Nat. Med. 1998 y www.planrtbiotechnology.com

Protocolo de inmunizacin:
Aplicacin directa en los dientes del anticuerpo secretorio producido en plantas de
tabaco (SIgA/G, lnea roja) durante 3 semanas con 2 tratamientos por semana. Se
realizaron controles con solucin salina (lnea verde claro), con un anticuerpo bovino no
relacionado producido en plantas (lnea azul) y con el anticuerpos murino (Guys 13,
lnea verde oscuro). n: nmero de voluntarios

RinoRxTM Fusin ICAM-q a IgA

Tratamiento preventivo de la gripe

causada por Rhinovirus

DoroRxTM IgA monoclonal contra dorocina

Tratamiento de efectos secundarios (alopeca) de la

quimioterapia con doxorubicina

37
 Expresin de protenas heterooligomricas por coexpresin de
vectores no competitivos

Expresin de anticuerpo moconoclonal A5

por coexpresin TMV y PVX

Expresin de HC y LC del A5 mAB Purificacin de mAb por A-Sefarosa

PAGE
TMV-LC No desnaturalizante
+
PVX-HC

SDS-PAGE

TMV-HC
+
PVX-LC
Westen blot

Produccin de protenas de inters

farmacolgico y medicinal

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

38
Produccin Construcciones usadas para transformar Nicotiana tabacum:
de factor de
P 35S CaMV hEGF tNOS p35EGF
crecimiento Versiones
citoplasmticas
epidrmico P 35S (L) CaMV W hEGF tNOS p35(L)EGF

humano en Versin P 35S (L) CaMV W ss hEGF tNOS p35(L)APEGF

apoplstica
plantas
Cuantificacin por ELISA de los niveles
de tabaco de hEGF expresado en plantas transgnicas

104

103

102

10

Agrobiotecnologa
1

Las plantas como

biorreactores

Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.

El hEGF producido en tabaco es biolgicamente activo

Ensayo de expansin de clulas del Ensayo de unin a radioreceptor
cumulus de ovocitos bovinos

Control hEGF st10ng

Planta no tranformada Extracto 35S (L) AP EGF

(10ng por ELISA)

Extracto planta infectada Extracto planta infectada con

Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.
PVX control PVXAPEGF

39
 Produccin de Galactosidasa A humana- Enfermedad de Fabry
TMV vector-Geneware system

Enfermedad de Fabry = deficiencia de la

enzima alfa-galactosidasa A

1: 60000 hombres-ligada a cromosoma X

Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system

Rpida optimizacin de la expresin del

gen que codifica la GalA

40
Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system

Control de calidad del la enzima GalA

producida

Pureza por SDS-PAGE

Determinacion del amino-terminal y la
secuencia completa por Maldi-tof
Esterilidad
Endotoxina
ADN residual
Impurezas residuales de la planta
Concentracin proteica
Actividad especfica

Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system

Modelo de enfermedad = ratn knockout GalA

Acumula lpido GB3 en varios rganos

Medicin de la eficacia de la enzima

GalA producida

Medicin de la acumulacin de GB3 en

ratones wt y en ratones knockout GalA

Clearance plasmtico

Organo blanco

41
42
43
Protenas
terapeuticas
producidas en
plantas en el
mercado o fase
clnica

Otras aplicaciones:
produccin de enzimas de inters
industrial, suplementos alimenticios y
biopolmeros

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

44
La avidina de
pollo fue la Construccin usada para transformar plantas de maz:

primera
Pr Ubiquitina Intron Ubi a-amilasa ss avidina Pin II 3
protena
El uso de codones de la secuencia seal de la a-amilasa de cebada y de la
recombinante secuencia codificante de la avidina de pollo se optimiz para su expresin en
comercializada plantas de maz.

obtenida El nivel de expresin de la avidina extrada de

en plantas semillas de maz fue 2,3% de la protena total
extrada (230 mg/Kg de semillas)

Grano de maz transgnico

incubado con un anticuerpo anti-
avidina. La interaccin se
evidencia por una reaccin
colorimtrica.
Agrobiotecnologa Notar la alta concentracin de
avidina en el embrin (E).
Las plantas como En: endosperma
biorreactores
Tomado de: Hood et al, Mol. Breed. 1997.

Caractersticas Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la

de la avidina estabilidad de la avidina expresada en semillas de maz

producida
en maz

Caractersticas fsicas de la avidina

recombinante producida en maz

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Tomado de : Hood et al, Mol. Breed. 1997.

45
Produccin
Las protenas
de brazzena edulcorantes tienen gran
demanda para productos
en plantas dietticos y para enfermos
de diabetes.
de maz La brazzeina es una
protena producida por la
planta africana
Pentadiplandra brazzeana
que posee un poder
edulcorante 1.200 veces
ms alto que el azcar.
Su produccin en la
planta nativa es
imprctica debido a los
altos volmenes de
produccin requeridos.
Se transformaron plantas
de maz con dos
variantes de la secuencia Tomado de: Lamphear et al.,
de brazzena y se la Plant Biotechnology Journal 2005.

expres en las semillas a

Agrobiotecnologa nivel del embrin y del
endosperma. Constitutive w/ intron: promotor de tipo poliubiquitina
Embryo-preferred: promotor de globulina 1 de maz
Las plantas como Se obtuvieron niveles de Endosperm-preferred: promotor de a-zena de 22kD
biorreactores acumulacin en semilla de BAASS: secuencia seal de la a-amilasa de cebada
Pin II: Terminador del inhibidor de proteasas II de Solanum tuberosum
hasta 4% de la PST. TEV y MDMV: enhancers traduccionales de Tobacco etch virus y Maize
dwarf mosaic virus

Expresin embrin Expresin promotor

+ citoplasma embrin + secrecin
Produccin ineficiente es ms eficiente

de brazzena Niveles de
expresin de
en plantas * brazzana en
semillas T1
PST)
(% PST)

de maz * * para los

mejores
Brazzena (%

transformantes
obtenidos con
las
construcciones
* 1-8 detalladas
en la
transparencia
anterior

Construccin gentica
Contenido de
*
(mg/g de peso seco)

brazzena en
fracciones
obtenidas por
Brazzena

molienda seca
de las semillas
de la lnea 5
Agrobiotecnologa (promotor para
Maz Grano Germen embrin).
mg (

Las plantas como entero molido

biorreactores
Grano entero endosperma embrin pericarpio

Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.

46
Produccin Esquema de los pasos de
de brazzena purificacin seguidos para el
aislamiento de brazzena expresada
en plantas en maz (maz transformado con la
construccin 5).
de maz

Muestras tomadas en los distintos pasos de

Agrobiotecnologa protenas fueron visualizadas por tincin con
Las plantas como
biorreactores
purificacin analizadas por PAGE-SDS. Las
Comassie Blue. Se embraron 5 mg en todos
los casos.
1: extracto crudo; 2: extracto calentado y
filtrado; 3: fraccin pico de la cromatografa
de intercambio catinico; 4: fraccin pico de
la cromatografa de tamao de exclusin.
Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.

Sntesis de plsticos biodegradables en plantas

Envases de shampoo hechos de un copolmero de polihidroxibutirato

y polihidroxivalerato a 0, 3 y 9 meses de permanecer en compost.

47
Produccin El polihidroxibutirato o PHB constituye una fuente
de PHB en . renovable de material termoplstico biodegradable.
plantas por En Alcaligenes eutrophus la sntesis a partir de acetil CoA
transferencia . ocurre en tres pasos catalizados por distintas enzimas.
de la va
metablica
bacteriana

Agrobiotecnologa

Las plantas como

biorreactores

Las plantas
La va completa de sntesis de PHB en Arabidopsis thaliana se
de A. thaliana obtuvo por transformacin con los genes phbA, phbB y phbC de
Ralstonia eutropha.
transformadas
Las tres enzimas se fusionaron a pptidos de trnsito a
con los genes cloroplastos para lograr su acumulacin en estas organelas. Esto se
hizo porque los niveles de acetil-CoA son mucho ms altos en los
phbA, phbB y plstidos que en el citoplasma.
phbC
acumulan p35S TPSS phbB NOS 3 p35S TPSS phbA NOS 3 p35S TPSS phbC NOS 3

grnulos de
PHB en los
cloroplastos
phbABC
Microscopia electrnica de una
clula del mesfilo de una hoja
Agrobiotecnologa madura de una lnea de A.
thaliana que expresa las enzimas
Las plantas como responsables de la sntesis de
biorreactores PHB. Se muestra un cloroplasto
conteniendo grnulos de PHB.
Tomado de: Bohmert et al, Planta, 2000.

48
Produccin a-amilasa en semilla de maz para bioetanol

2011 Usda-Aphis a prueba Enogen-Syngenta

Enzimas industriales
Avidina: kit de diagnstico
-glucuronidasa: kit de diagnstico
Trypsin: wound care
Celulasa: produccin de etanol
Xilanasa: procesamiento de biomasa
Fitasa: procesamiento de alimentos
(1-3)(1-4)-glucanasa: Brewing
Lignin peroxidasa: Paper manufacture

Biopolmeros
protenas de la seda de araa
polipptidos tipo elastina
colgeno

49
Companias que utilizan tecnologas para la produccin de
protenas en plantas

Tomado de: Biotecnologa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010

Tomado de: Biotecnologa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010

50
Aspectos de Bioseguridad:
bioseguridad En el caso de produccin de protenas teraputicas o con
actividad biolgica, se deben establecer condiciones de
bioseguridad an ms estrictas que las adoptadas para
otros OGMs, ya que stas no deben ingresar bajo ningn
punto de vista a la cadena alimentaria humana.

Riesgos y desventajas para la produccin

de medicamentos en plantas
Dispersin de los transgenes por polen, semilla o frutos
Riesgo de contaminacin de la cadena alimentaria;
Impacto en especies no blanco: pjaros, mariposas,
insectos etc.
Reproducibilidad en proceso de purificacin
Uso inapropiado de los productos derivados de OGM
Agrobiotecnologa
Temas regulatorios complejos
Las plantas como
biorreactores

Aspectos de
Algunas recomendaciones para la contencin
bioseguridad
biolgica:

- Utilizar sistemas cerrados para el crecimiento de plantas.

- Utilizar cultivos que no participen de las cadenas

alimentarias humana o animal.

- Utilizar cultivos de estructura floral cerrada

(autopolinizacin).

- Tener en cuenta el aislamiento temporal

(poca de polinizacin diferente en cultivos
relacionados) y espacial (barreras de cultivos
Agrobiotecnologa
no transgnicos).

Las plantas como - Si la expresin es en hojas, cosechar las

biorreactores
plantas antes de la floracin.

51