Recuento y caracterizacin de hongos filamentosos y levaduriformes

Counting and characterization of filamentous and levaduriform fungi

Angie Lizeth Caballero Arias*, Daniela Andrea Cruz Mahecha**

* Ingeniera ambiental, Universidad Central, Bogot

** Ingeniera ambiental, Universidad Central, Bogot
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Resumen
El recuento de poblaciones microbiolgicas es fundamental en prcticas experimentales para determinar el
nmero aproximado de unidades formadoras de colonias (UFC) en un tiempo determinado, de tal forma que se
pueda analizar el comportamiento de los mismos. Existen varios sistemas para detectar y medir el crecimiento de
microorganismos. En el presente informe se describe el recuento en placa contenida por Agar PDA+ cloranfenico
empleando la tcnica de diluciones para la obtencin de un estimado de la carga microbiana general de la muestra
de suelo del cultivo de Yuca. El mtodo se bas en realizar diluciones seriadas (base 10) de la muestra de suelo
y es posible realizar un recuento simultneo de de hongos filamentosos y levaduras ya que, dada la naturaleza
filamentosa de los hongos ambos forman colonias diferentes.
Palabras clave: Hongos filamentosos, levaduras, dilucin, recuento, PDA, UFC

Abstract
The count of microbiological populations is essential in experimental practices to determine the approximate
number of colony forming units (CFU) in a given time, so that you can analyze the behavior of the same. There
are several systems to detect and measure the growth of microorganisms. The present report describes the
contained by plate count agar PDA+ cloranfenico using the technique of dilutions to obtain an estimate of the
microbial load of the soil sample of the cultivation of cassava. The method is based on performing serial dilutions
(base 10) of the soil sample and it is possible to carry out a simultaneous count of filamentous fungi and yeast
because, given the nature of the filamentous fungi both form colonies.
Keywords: Filamentous fungi, yeasts, dilution, counting, PDA, CFU

otras molculas orgnicas complejas (UEB, 2006).

1. Introduccin
El suelo tiene funciones diversas y muy importantes
para los ecosistemas terrestres, es el sustento para
la vida vegetal y hbitat para una gran diversidad,
tanto del componente microbiano, as como de
macro invertebrados (Salazar, y otros, 2014).
Los microorganismos del suelo contribuyen al
mantenimiento de la fertilidad qumica, fsica y
biolgica del suelo, transforman nutrientes
inorgnicos, que de otra forma no pueden ser
absorbidos por las plantas; adems favorecen la
descomposicin y mineralizacin de la materia
orgnica (INTA, 2015).
En ese grupo se encuentran las bacterias, los
hongos, protozoarios y micro-algas (INTA, 2015)
pero, en el siguiente laboratorio se analizaron
nicamente hongos.
Los hongos son organismos hetertrofos y
quimiorganotrofos, propios de las clulas eucariotas,
es decir, que poseen ncleos verdaderos y no
poseen clorofila. Son portadores de esporas y
conidios dando lugar a la reproduccin sexual y
asexual respectivamente. Las estructuras
somticas, ramificadas y filamentosas estn
rodeadas por paredes celulares que contienen
quitina o celulosa, o ambas sustancias, junto con
Su importancia biolgica radica en que tienen la
funcin degradadora o desintegradora de los hongos
saprobios que descomponen la materia orgnica
(alimentos, material que los animales excretan,
plantas, otros hongos y animales muertos),
convirtiendo las molculas de la materia viva en
gases y sales minerales que son desechados al
medio y aprovechados por los auttrofos en su
proceso fotosinttico, como fuente de alimentacin y
respiracin de la mayora de los seres; de esta forma
contribuyen a mantener el ciclo de la materia en la
bisfera y el equilibrio dinmico de la naturaleza
(UEB, 2006).
El conteo microbiano determina el nmero de
microorganismos en una muestra para ello, existen
dos sistemticas, la primera, para el conteo de
microorganismos viables y la segunda, para el
conteo de microorganismos totales; en el desarrollo
de la prctica se us el mtodo de cuenta en placa
que hace parte del conteo de microorganismos
viables (UNAM, 2007).
Este artculo tiene como objetivo fundamental
realizar recuentos, caracterizacin macroscpica y
microscpica de colonias fngicas a partir de una
muestra de suelo de cultivo de yuca a la cual se le
aplicaron diluciones seriadas.
 2. Materiales y Mtodos
2.1. Preparacin del medio de cultivo
Se marcaron tres tubos de ensayo de 9 mL de NaCl
con las diluciones que se pretendan realizar 10-2,
10-3, 10-4, las cajas de agar SPC se marcaron con
dilucin 10-3 y 10-4, cada una con una rplica es
decir, se utilizaron cuatro cajas petri; se marc de
igual forma las cajas de agar almidn amoniacal con
nistatina pero con dilucin 10-2 y 10-3.
Se pesaron 10g de la muestra de suelo y se
diluyeron en 90 ml de NaCl (0,85%); se agit y esto
represent la dilucin 10-1.
Seguidamente, se tom 1 mL de la suspensin
anterior, se agreg a uno de los tubos de 9 ml de
NaCl y se agit; se realiz el mismo procedimiento
con todas las diluciones hasta 10-4.
De las diluciones 10-3 y 10-4, se tom 1 mL de cada
una, se sembraron en una caja Petri que contenan
agar PDA+ cloranfenicol y se realiz por duplicado.
Con el rastrillo de vidrio autoclavado se dispers la
muestra sobre el agar de manera uniforme y se dej
que la muestra se absorbiera con las cajas tapadas
durante 15 minutos a temperatura ambiente para
luego agruparlas y envolverlas en papel Vinipel.
Adems, se invirtieron las cajas y se incubaron
durante 7 das a una temperatura de 252C.
2.2. Caracterizacin macroscpica y hongos y levaduras.
microscpica de hongos filamentosos y
levaduriformes
Para la caracterizacin macroscpica de colonias
fngicas se observaron las colonias tanto del
anverso como el reverso y se describieron de
acuerdo a la colonia fngica a la que pertenecan,
color, forma, borde, elevacin y dimetro.
Para la caracterizacin microscpica de levaduras
se tuvo que realizar la tincin de Gram y para los
hongos se realiz la tincin Azul de Lactofenol.
2.2.1. Tincin de Gram
Se tom un portaobjetos limpio y se le agreg una
gota de agua, se flame al rojo vivo el asa, se dej
enfriar y se retir una pequea parte de la colonia;
esta muestra se dispers sobre la gota de agua en
la lmina formando una pelcula delgada.
Luego, se dej secar al ambiente la muestra para
luego proceder a realizar la tincin de Gram.
Esta tincin const de cuatro pasos; primero, se
cubri el frotis con cristal violeta por un minuto, se
lav con agua y se dej escurrir luego, se cubri con
Lugol por un minuto, se lav con agua y se dej
escurrir seguidamente, se aplic brevemente el
decolorante alcohol acetona por quince segundos,
se lav con agua y se dej escurrir y por ltimo, se
aplic el colorante de contraste Safranina o Fushina
por 30 segundos se lav con agua y se dej escurrir.
Despus de realizar la tincin se sec
cuidadosamente con un papel absorbente los
portaobjetos sin colocarlo sobre la muestra teida.
Al estar la muestra seca, se observ en el
microscopio con aumentos de 4x, 40x y 100x, para
este ltimo se debe aplicar una gota de aceite de
inmersin.
2.2.2. Tincin Azul de Lactofenol
Se tom un portaobjetos limpio y se le agreg una
gota de azul de lactofenol; con ayuda de las agujas
de diseccin se tom una muestra del material
fngico, se dispers sobre la gota de azul de
lactofenol y se tap con un cubreobjetos.
Luego, se observ la muestra en el microscopio con
aumentos de 4x a 40x y se reportaron las estructuras
observadas.
2.3. Recuento de hongos filamentosos y
levaduriformes
Despus del periodo de incubacin establecido se
cuentan las colonias para cada caja, para ello, se
utiliz un marcador para sealar en el agar los
La determinacin del recuento se realiz empleando
la siguiente frmula:
=
1.1
Pero, en el laboratorio se pueden presentar dos
situaciones en las que no se pudo aplicar dicha
frmula ya sea porque no se pueden contar o no se
presentan colonias con las caractersticas
esperadas.
Para dichas situaciones, el resultado se report
como mayor a (>) el factor de dilucin*10 y menor a
(< ) el factor de dilucin*10 respectivamente.
3. Resultados y Discusin
3.1. Caracterizacin macroscpica
A continuacin se presentan las caractersticas
macroscpicas de los 4 cultivos, derivados de las
dos diluciones empleadas con sus repeticiones,
reuniendo as hongos filamentosos y hongos
levaduriformes.
 Figura 1. Medio de cultivo anverso y reverso de la repeticin 1 de la dilucin 10 -3

Colonia Color anverso Color reverso Forma Borde Elevacin Promedio

fngica (cm)
Levadura Rosado Rosado Puntiforme Entero Plana 0,25
Pulverulentas -Interior verde oscuro Blanco y un Irregular Ondulado Convexa 0,95
-Borde blanco poco verde
Algodonosas -Borde y centro blanco Distintos tonos Irregular Lobulado Convexa 2,05
-Interior verde oscuro de amarillo
Tabla 1. Caracterizacin macroscpica de la repeticin 1 de la dilucin 10-3

Figura 2. Medio de cultivo anverso y reverso de la repeticin 2 de la dilucin 10 -3

Colonia Promedio
Color anverso Color reverso Forma Borde Elevacin
fngica (cm)
Algodonosas Blanco Naranja Puntiforme Entero Plana 0,015
Pulverulentas Verde oscuro No se Irregular Ondulado Convexa 0,88
observa
Algodonosas -Borde y centro blanco Naranja y Irregular Lobulado Plana 1,82
-Interior verde opaco amarillo
Tabla 2. Caracterizacin macroscpica de la repeticin 2 de la dilucin 10-3

Figura 3. Medio de cultivo anverso y reverso de la repeticin 1 de la dilucin 10 -4

Colonia Color anverso Color reverso Forma Borde Elevacin Promedio

fngica (cm)
Algodonosas -Borde blanco Blanco Irregular Entero Plana 2,05
-Interior verde oscuro
Algodonosa -Borde amarillo claro Amarillo Irregular Ondulado Plana
-Interior blanco
Tabla 3. Caracterizacin macroscpica de la repeticin 1 de la dilucin 10-4
 Figura 4. Medio de cultivo anverso y reverso de la repeticin 2 de la dilucin 10 -4

Colonia Color anverso Color reverso Forma Borde Elevacin Promedio

fngica (cm)
Levadura Rosado Rosado Puntiforme Entero Plana 0,25
Pulverulentas -Interior verde oscuro Blanco Irregular Ondulado Convexa 0,95
-Borde blanco
Algodonosas -Interior blanco y -Interior rojo y Irregular Lobulado Convexa 2,05
amarillo claro naranja
-Borde naranja -Borde amarillo
Tabla 4. Caracterizacin macroscpica de la repeticin 2 de la dilucin 10-4

En la prctica, los hongos filamentosos y levaduras no fue posible, dado que se presentaron
se diferencian en dos grupos segn el aspecto inconvenientes con las colonias de dilucin 10-4 por
macroscpico de sus colonias, siendo las levaduras escasez de muestra sobre el portaobjetos. De igual
colonias cremosas, opacas y hmedas y los hongos manera con el hongo levaduriforme, adicionando
filamentosos formando colonias algodonosas o que la posicin de la muestra sobre el portaobjeto
pulverulentas. fue a un extremo, lo que hizo complejo la
Las colonias que crecen sobre el agar provienen de observacin al microscopio. A continuacin, se
un derivado de la espora, de un fragmento de micelio presenta la caracterizacin microscpica de una
vegetativo, en la naturaleza se desconoce bajo qu colonia fngica algodonosa y una pulverulenta
estado fisiolgico latente o activo estaba la unidad perteneciente a la dilucin 10-4.
fngica viable en la muestra original, por lo cual el
solo agitar el tubo de la dilucin causa un error al
estimar la poblacin fngica ya que la agitacin,
rompe el micelio y los cuerpos que contienen
esporas en un nmero indeterminado de
fragmentos, cada uno de los cuales genera una
colonia, los gneros que liberan numerosas esporas
aparecen con facilidad en elevada densidad en
placa, en consecuencia los hongos que esporulan en
abundancia y se aslan con frecuencia por estas
razones(Syanez, 2007).
Los hongos filamentosos y levaduras en su mayora
son saprofitos, hallndose libres en la naturaleza,
especialmente en la materia orgnica en
descomposicin. Algunas especies son parsitas,
formando parte de la flora normal, como por ejemplo
Candida albicans, que es una levadura y puede Figura 5. Colonia fngica algodonosa observada a 40x en
comportarse como oportunista y resultar patgena el microscopio
cuando se produce una disminucin en los
mecanismos de resistencias del individuo. (Alonso & Estructura Fngica Color Caractersticas
Poveda, 2008). Conidios Azul Estructura reproductiva
asexual del micelio
3.2. Caracterizacin microscpica: Hifa septada Azul Estructura tubular que se
ramifica
Tabla 5. Caracterizacin microscpica de la colonia
Se seleccionan 4 colonias de hongos filamentosos y
fngica algodonosa
una levadura para realizar la caracterizacin
microscpica, sin embargo en la prctica, lo anterior
 Mtula Azul Clula que sostiene la
fialide y se encuentra
sobre una vescula.
Vescula Azul Engrosamiento de forma
que presentan las hifas.
Conidioforo Azul Estructura donde se
producen los conidios
Hifas septadas Azul Estructura tubular que se
ramifica
Tabla 6. Caracterizacin microscpica de la colonia
fngica pulverulenta

En los resultados de la caracterizacin microscpica

del hongo levaduriforme realizada por Tincin de
Figura 6. Colonia fngica pulverulenta observada a 40x Gram se esperaba que indicara que es gram
en el microscopio positiva. Por lo general se observan clulas de
distintos tamaos, las pequeas corresponden a
Estructura Fngica Color Caractersticas clulas recin formadas por gemacin que an no
Micelio Azul Conjunto de hifas han alcanzado su tamao normal o bien clulas
Conidios Azul Estructura reproductiva pequeas adheridas a una clula grande indicando
asexual del micelio que las dos clulas hijas que acaban de formarse por
Fialides Azul Estructura que da lugar al gemacin an no se han separado (Quintanar, 2012)
conidio

3.3. Recuento de microorganismos:

A continuacin, se realiz una tabla que contiene cajas de agar respecto a cada dilucin.
el conteo de hongos y levaduras en las cuatro

Medio de
Muestra Microorganismo Dilucin Repeticin Conteo Promedio
cultivo
R1 47
Suelo de 10-3 183,5
PDA + Hongos y R2 320
cultivo de
cloranfenicol Levaduras R1 9
yuca 10-4 13
R2 17
Tabla 7. Conteo de Hongos y Levaduras en el medio de cultivo

Recuento de Hongos y levaduras: conteos de la dilucin 10-4 ya que, sus repeticiones

estaban en el mismo orden de magnitud.
183,5 + 13
= 3
= 1,78 106
0,1 1,1 10 = 13 104 10 = 1,3 106

En este recuento se tom en cuenta los conteos de

las dos diluciones realizadas pero, se evidencian dos
errores que indican que la manipulacin y las
diluciones no fueron realizadas correctamente.
Dichos errores son:
-Los conteos entre las repeticiones (R1 y R2) de la
dilucin 10-3 no estn en el mismo orden de
magnitud; esto se debe a que el medio R2 se
contamin generando que las colonias tuvieran un
crecimiento abundante.
- Hubo un error en las diluciones debido a que la
magnitud de la mayor dilucin (10-4) debe ser de
orden 1-10 ya que el de la menor (10-3) fue de orden
10-100.
De acuerdo a lo anterior, se realiz un nuevo
recuento en el que se tomaron nicamente los
El recuento se reporta como unidades formadoras
de colonias (UFC) puesto que su desarrollo en placa
puede provenir directamente de una clula aislada o
de un cmulo. Muchos hongos son importantes en
los procesos de descomposicin de la materia
orgnica. Adems de los hongos benficos, tambin
se pueden aislar del suelo los hongos fitopatgenos,
como las levaduras. Los hongos aportan ms del
50% de la biomasa en el suelo, en principio por el
dimetro de sus filamentos y extensa red que
genera. As pues, la relacin que se encuentra entre
el suelo y los hongos es denominada simbiosis
porque los hongos degradan materia orgnica
proporcionndole nutrientes al suelo (Syanez, 2007).
4. Conclusiones
Los mtodos de recuento de colonias proveen una
aproximacin al nmero real de microorganismos de
acuerdo al medio empleado, tiempo y temperatura
de incubacin.
Los resultados macroscpicos resultan ser
acertados partiendo de la hoja tcnica del Agar Papa
Dextrosa (Potato Dextrose Agar, PDA, por sus siglas
en ingls), ya que esta seala que las levaduras
crecen como colonias desde un color crema a un
color blanco y los mohos crecen como colonias
filamentosas de variados colores. Lo anterior se
debe por el componente particular de Dextrosa,
siendo este favorable para el crecimiento de hongos
que degradan materia orgnica.
La caracterizacin microscpica funciona en
complemento con la caracterizacin macroscpica
para facilitar la identificacin de hongos filamentosos
y levaduriformes en el suelo.
5. Referencias
Alonso, L., & Poveda, J. (2008). Estudio
comparativo en tcnicas de recuento rpido en el
mercado y placas petrifilm 3M para el anlisis de
alimentos. Bogot, Colombia: Pontificia
Universidad Javeriana. Carrera de Microbiologa
industrial.
Berg, J. S. & Robson, M. C. (2003). Detencin de
los ciclos celulares y su efecto sobre la
cicatrizacin de heridas. Clnicas quirrgicas de
Norteamrica.
INTA, I. N. (2015). Anlisis Microbiolgico de
suelos. San Jos: Ministerio de Agricultura y
Ganadera.
Quintanar, M. E. (28 de Febrero de 2012).
Blogspot. Recuperado el 02 de Abril de 2017, de
Observacin de levadura. Blogspot:
http://ccnnvalledeloja1eso.blogspot.com.co/2012
/02/observacion-de-levaduras.html
Salazar, A. Ordoez, C., Hernndez, D.,
Castao, L., Pea, K., Rodrguez, J., & Bueno, L.
(2014). Actinomicetos
aislados del suelo del Jardn
UEB. (2006). Hojas tcnicas de divulgacin.
Unidad de Exhibicin Biolgica. Ciudad de
Jurez: Universidad Autnoma de Ciudad de
Jurez.
UNAM. (2007). Medicin del crecimiento
microbiano.
Facultad de Qumica UNAM.