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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUMICA E ALIMENTOS


FURG
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA E CINCIA DE ALIMENTOS

AVALIAO BIOLGICA DA SPIRULINA EM TAMANHO


MICRO E NANOMTRICO E ESTUDO DA SUA
ENCAPSULAO EM LIPOSSOMAS

ADRIANA RODRIGUES MACHADO

Orientadora:Prof(a). Dr. Leonor Almeida de Souza Soares

Co-orientadora: Prof(a). Dr. Mrian Ribeiro Galvo Machado

Rio Grande, RS.


2

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA E CINCIA DE ALIMENTOS

AVALIAO BIOLGICA DA SPIRULINA EM TAMANHO


MICRO E NANOMTRICO E ESTUDO DA SUA
ENCAPSULAO EM LIPOSSOMAS

ADRIANA RODRIGUES MACHADO

Dissertao apresentada para obteno


do ttulo Mestre em Engenharia e Cincia
de Alimentos

Prof. Dra. Leonor Almeida de Souza Soares


ORIENTADORA - FURG
Prof. Dra. Mirian Ribeiro Galvo Machado
CO-ORIENTADORA - UFPel

Rio Grande-RS
2012
3

Dedico esta dissertao aos meus familiares: minha me Norma Rodrigues Machado,
irm Maria Ins Rodrigues Machado e sobrinha Victoria Leitzke, pelo apoio,
companheirismo e presena constante em minha vida.

ii
4

Agradecimentos

A Deus, pela vida....

Aos meus familiares: minha me, apoio, amor, tambm a uma pessoa que no
est mais conosco, meu pai, pois sei que de onde estiver estar torcendo por mim.
minha irm Maria Ins pelo incentivo, contribuies, correes e palavras de coragem,
minha amada sobrinha pelo carinho e abrao;
orientao da professora Leonor de Souza Soares meus sinceros
agradecimentos pelo auxilio a execuo desta obra, amizade, conselhos e grande
aprendizagem. colega de equipe que se tornou uma grande amiga e incentivadora
e uma grande colaboradora deste projeto Leticia Assis ;
FURG atravs dos laboratrios de: Bioengenharia, Cincia de Alimentos,
Tecnologia de Alimentos, pelos emprstimos de equipamentos; principalmente s
funcionrias: Maria de Jesus Lamego e Sabrine. Aos colegas de Ps-Graduao:
Maira Mendes, Vanessa Ribeiro, Cristiano, Renata, Helen, Lisiane, Michele Souza,
Priscila Tessmer, Alessandra, Lidiane Moreira, Marina, Juliana,Gilberto, Larine,
Fernanda,Tnia, e demais colegas. Agradecimentos ao departamento de Quimica-
FURG em especial ao Tito pela ajuda nas analises. Aos Professores Jorge Alberto e
Eliana Badiale Furlong pelas importantes contribuies neste trabalho.
UFPEL: antigo Departamento de Cincia de Alimentos-Quimica de Alimentos.
s professoras Mirian Galvo Machado e Rosane Rodrigues pelas co-orientaes,
auxilio, apoio e amizade. Ao Biotrio Central, a Zootecnia, ao Centro de Biotecnologia;
aos Laboratrios de Anlises Clnicas e Regional de Diagnstico, atravs das equipes
das professoras Carmen Lcia Ribeiro e Ana Lcia Schild.
professora Amanda Motta pelo o auxilio, apoio na execuo deste projeto e sua
estagiria Michele Mello pelos ensinamentos.
Ao curso de Engenharia de Materiais, especialmente ao professor Neftali Carreo,
Bianca e Matheus Zorzelli Krolow;

UFRGS- em especial Yasmine Micheletto.

s amigas Priscila Missio, Amanda Pinto, Dbora Martinez, Shanise El Hallal,


Michele Paludo; e s estagiarias: Paula Polidori e Bruna Behling.
Agradecimentos Embrapa - principalmente ao Dr. Suita e sua equipe. Aos amigos
que de alguma forma contriburam com uma palavra de amizade, mesmo distantes.
CAPES, pela concesso da bolsa de mestrado. A todos meus sinceros
agradecimentos.
iii
A tica, a amizade, a capacidade de criar novas estratgias, fundamentadas na
experincia, o talento para promover alianas positivas, o esprito de liderana, a
conscincia da fora que reside no verdadeiro trabalho em equipe. Tudo isso aflora
quando as circunstancias exigem, quando se sabe que existe um objetivo maior a ser
alcanado.

(Autor desconhecido)

iv
2

SUMRIO

LISTA DE TABELAS......................................................................................... VIII

LISTA DE FIGURAS......................................................................................... IX

LISTA DE EQUAES.......................................................................................... X

CAPTULO I.......................................................................................................... XI

RESUMO................................................................................................................ XII

ABSTRACT............................................................................................................ XIII

1. INTRODUO GERAL..................................................................................... 1

2.OBJETIVOS........................................................................................................ 3

2.1. Objetivo Geral................................................................................................ 3

2.2. Objetivos Especficos................................................................................... 3

3.JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 4

CAPTULO II.......................................................................................................... 6

4. REVISO BIBLIOGRFICA............................................................................. 7

4.1. Histrico-Spirulina platensis.................................................................. 7

4.1.1 Condies de crescimento e cultivo.................................................. 9

4.2. Biotecnologia e Cianobactrias.............................................................. 10

4.3.Legislao......................................,,.......................................................... 11

4.4. Aspectos nutricionais do uso da spirulina como alimento.................. 11

4.4.1.Proteinas e Aminocidos..................................................................... 11

4.4.2.Vitaminas........................................................................................... 11

4.4.3 Pigmentos........................................................................................... 11

4.4.4. cidos graxos poliinsaturados............................................................ 12

4.4.5 Lipidios no organismo............................................................................. 12

4.4.5.1 Transporte dos lipdios e lipoprotenas............................................. 12

4.4.5.2 Teor de lipdio no fgado..................................................................... 13

V
4.5 Nanotecnologia em alimentos................................................................... 14

4.6 Encapsulao.............................................................................................. 16

4.6.1. Lecitina de soja....................................................................................... 17

4.6.2. Lipossomas............................................................................................ 19

4.6.3.Toxicidade de alimentos em tamanho nano............................................ 21

5 MATERIAL E MTODOS.................................................................................. 22

5.1. Material........................................................................................................... 22

5.1.1. Obteno da biomassa microalgal........................................................... 22

5.1.2. Cultivo e processo de obteno da microalga........................................ 22

5.1.3. Ingredientes para elaborao das dietas.................................................. 23

5.2. Mtodos.......................................................................................................... 24

5.2.1. Preparo da biomassa........................................................................... 24

5.2.2 Composio centesimal......................................................................... 24

5.2.3. Purificao parcial da Lecitina de soja.................................................. 24

5.2.4. Comparao de mtodos parade avaliaoda nanoencapsulao da 24


Spirulina LEB 18....................................................................................................
5.2.5 Liofilizao do material encapsulado.................................................... 26

5.2.6 Tamanho mdio das particulas e caracterizao morfologica.............. 26

5.2.6.1. Espalhamento dinmico de Luz-EDL............................................... 26

5.2.6.2. Microscopia eletrnica de varredura-MEV........................................ 26

5.2.7 Ensaio Biolgico.................................................................................... 27

5.2.8 Preparo da Spirulina em tamanho nano................................................ 27

5.2.9 Elaborao das dietas.............................................................................. 29

5.2.9.1 Peletizao....................................................................................... 29

5.2.9.2 Animais............................................................................................. 30

5.2.9.3 Eutanasia, coleta de sangue e figado............................................... 30

5.2.9.4 Medidas antopomtricas.................................................................. 31

5.2.10 Avaliaes dos figados....................................................................... 31

vi
5.2.10.1 Determinao de Lipidios- ............................................................... 31

5.2.10.2 Avaliaes histopatologicas.......................................................... 31

5.2.11 Avaliaes das fezes........................................................................ 32

5.2.11.1 Determinaes de lipidios............................................................ 32

5.2.12 Avaliaes bioquimicas................................................................ 32

5.2.13 Avaliaes hematolgicas............................................................ 32

5.3. Anlise estatstica......................................................................................... 32

CAPTULO III-Desenvolvimento do trabalho..................................................... 33

ARTIGO 1 PROCESSO DE NANOENCAPSULAO DE Spirulina LEB-18 EM 34


LIPOSSOMAS .................................................................

ARTIGO 2 AVALIAES BIOLGICAS, NUTRICIONAIS E BIOQUIMICAS


DE RATAS WISTAR ALIMENTADAS COM DIETAS CONTENDO Spirulina EM
TAMANHOS MICRO E 52
NANOMTRICO.....................................................................................................

ARTIGO 3 AVALIAES BIOQUIMICAS E HISTOPALGICAS DE RATAS 71


WISTAR ALIMENTADOS COM DIETAS COM Spirulina LEB-18........................

ARTIGO 4: AVALIAO BIOLGICA DE CASENA E SPIRULINA EM RATOS


WISTAR E ENCAPSULAO DESTA FONTE PROTEICA EM
LIPOSSOMAS...................................................................................................... 90

ARTIGO 5- INFLUNCIA DA CIANOBACTRIA (Spirulina LEB-18) NO 102


METABOLISMO DE RATOS FMEAS WISTAR...................................................

CAPTULO IV......................................................................................................... 119

CONCLUSOES GERAIS...................................................................................... 120

CAPTULO V.......................................................................................................... 121

REFERNCIAS GERAIS...................................................................................... 122

APNDICES.......................................................................................................... 136

APNDICE 1 PARECER DO COMIT DE TICA EM EXPERIMENTAO 137


ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS.......................................

vii
2

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Formulao das dietas experimentais administradas durante 15 dias a


ratos fmeas da cepa wistar/UFPEL (g.Kg -1)......................................................29

viii
LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Vista microscopia de uma spirulina................................................................7

Figura 2. Mulheres filtrando a spirulina e Mercador africano vende a spirulina seca,


com nome de DIH......................................................................................................8

Figura 3. Transporte dos lipidios e lipoproteinas........................................................13

Figura 4.Examplo das diferentes formas de compostos:(A) esfera(sistema atricial) e


(B)capsula(sistema reservatrio).................................................................................14

Figura 5. Lecitina de soja purificada............................................................................18

Figura 6. Estrutura molecular da fosfatidilcolina..........................................................18

Figura 7. Estrutura do lipossomae corte transversal de um lipossoma unilamelar....20

Figura 8.Caracteristicas estruturais dos lipossomas...................................................20

Figura 9. Processo de obteno..................................................................................23

Figura 10. Processo de elaborao de lipossomas atravs de duas tecnicas ultra-som


e homogeneizador ultra-turrax.....................................................................................25

Figura 11. Processo de elaborao de spirulina em tamanho nano............................26

Figura 12. Processo de anlise de espalhamento dinmico de luz 1 etapa:filtragem


dos lipossomas; 2a o laser incide sobre a amostra localizada no centro do gonimetro
: a luz espalhada em determinado ngulo e coletada e amplificada pelo
fotomultiplicador que envia dados ao computador......................................................27

Figura 13. Microscopia eletrnica de varredura...........................................................28

Figura14.Distribuio dos animais por grupo


(n=6);c=caseina;A=aproteica;S=spirulina;Sn=spirulina nano......................................32

ix
LISTA DE EQUAES

Equao 1:Quociente de eficincia liquida de proteina-NPR..........................12

x
Capitulo I

Resumo
Abstract
Introduo geral
Objetivo
Geral
Especifico
Justificativa

xi
RESUMO

A Spirulina uma microalga classificada como GRAS (Generally Recognized as


Safe) pelo FDA (Food and Drug Administration), o que garante seu uso como alimento
sem riscos sade. No entanto, no Brasil, apesar de Spirulina, ser considerada um
novo alimento, a recomendao de seu consumo limita-se a 1,6g ao dia. Com isso,
vrias pesquisas na area de nanotecnologia esto trabalhando para desenvolver
novos alimentos, os quais permanecem inertes no corpo e liberam os nutrientes para
as clulas quando for necessrio. Um elemento chave neste setor o
desenvolvimento de nanocpsulas que podem ser incorporadas aos alimentos para
distriburem nutrientes. Na indstria de alimentos a encapsulao, um processo no
qual um ou mais ingredientes ou aditivos (que constituem o ncleo) so revestidos por
uma cpsula comestvel. A spirulina foi utilizada neste processo de encapsulao
como ncleo. As vantagens de encapsular a Spirulina visa mascarar compostos de
sabor indesejvel, retardando alteraes que podem resultar em perda de aroma,
alterao de cor ou perda do valor nutricional, quando da aplicao em formulaes,
assim como, tambm permitir a liberao diretamente no organismo.O objetivo do
presente trabalho foi avaliar as propriedades biolgicas e nutricionais da biomassa
Spirulina LEB-18/FURG em seus tamanhos micro e nanomtrico, como tambm,
analisar o mtodo especfico de encapsulao da spirulina e caseina O processo de
encapsulao ocorreu atravs da metodologia de hidratao do filme lipdico. Para
verificao da morfologia das partculas utilizou-se microscopia eletrnica de
varredura. Logo, para analise do tamanho mdio utilizou-se a tcnica de espalhamento
dinmico de luz. O experimento foi realizado durante 15 dias, para verificao do
quociente da eficiencia liquida de proteina. Foram utilizados 24 fmeas de rattus
norvegicus, recm desmamadas (21 dias), da cepa Wistar/ UFPEL provenientes do
Biotrio Central da Universidade Federal de Pelotas. Durante o experimento foram
ofertadas 4 dietas denominadas C (casena como fonte protica); S (spirulina
micromtrica); A (Aproteico); e Sn (Spirulina nano). No decorrer e ao trmino do
experimento foram observados peso dos animais e ingesto diria de dieta; coletados
materiais biolgicos, como, excretas, sangue e figados para posteriores
determinaes. Constatou-se que a fosfatidilcolina uma possibilidade vivel na
aplicao como material de parede para a formao de lipossomas de Spirulina
platensis visto que o material obtido apresentou-se na escala nanomtrica e
visualmente encapsulado. Os resultados das avaliaes in vivo levam a concluir que a
dieta a base de spirulina em substituio casena no afetou significativamente o
consumo alimentar total e o ganho de peso, promovendo valores de coeficiente de
eficincia alimentar muito prximos casena. Portanto com relao as avaliaes
bioqumicas no soro os grupos no diferiram estatisticamente.

Palavras-chave: microalga, avaliao biolgica, encapsulao, lipossomas e


nanotecnologia.

xii
2

Abstract
Spirulina microalgae is classified as a GRAS (Generally Recognized as Safe) by FDA
(Food and Drug Administration), which ensures its use as food without health risks.
However, in Brazil, although Spirulina, be considered a novel food, the
recommendation of its use is limited to 1.6 g daily. Thus, several studies in the area of
nanotechnology are working to develop new foods, which remain inert in the body and
release nutrients to cells when needed. A key element in this sector is the development
of nanocapsules that can be incorporated into food to distribute nutrients. In the food
industry encapsulation is a process in which one or more ingredients or additives (the
core) are coated with an edible capsule. Spirulina was used in this process as the core
encapsulation. The benefits of Spirulina aims to encapsulate the masking undesirable
flavor compounds, delaying changes that may result in loss of flavor, color change or
loss of nutritional value, when the application in formulations, and also allow the
release directly into the body. The objective of this study was to evaluate the biological
and nutritional properties of Spirulina biomass LEB-18/FURG in their micro-and
nanometer sizes, but also analyze the specific method of encapsulation of casein and
spirulina encapsulation process occurred through the methodology hydration of the
lipid film. To check the morphology of the particles we used scanning electron
microscopy. Therefore, to analyze the average size used the technique of dynamic light
scattering. The experiment was conducted for 15 days to check the ratio of net
efficiency of the experiment protein. We used 24 females of Rattus norvegicus, newly
weaned(21 days0, Wistar/ UFPEL from the Central Animal Laboratory, Federal
University of Pelotas. For were offered four diets termed C (casein as protein source),
S (Spirulina micrometer), A (non-protein) and Sn (Spirulina nano). During and at the
end of the experiment were observed animal weight and daily intake of diet, collected
biological materials, such as feces, blood and livers for subsequent determinations. It
was found that phosphatidylcholine is a viable possibility in the application as wall
material for the formation of liposomes of Spirulina as the material obtained was
presented at the nanoscale and visually encapsulated. The results of evaluations in
vivo lead to the conclusion that the diet of spirulina as a substitute for casein did not
significantly affect the total food intake and weight gain, promoting values of feed
efficiency coefficient close to casein.So with to serum assessment groups did not differ
statistically.
Key words: microalgae, biological evaluation, encapsulation, liposomes and
nanotechnology.

xiii
1

1 Introduo

As microalgas so consideradas a primeira forma de vida fotossintetica criada


pela natureza h mais de 3,5 bilhes de anos (VONSHAK, 1997). As algas iniciaram a
produo de oxignio em nossa atmosfera, permitindo que todas as formas de vida
superiores se desenvolvessem. De acordo com a composio da biomassa gerada,
esta pode ser utilizada na alimentao humana ou animal, para extrao de
biocompostos, ou para a produo de biocombustveis, entre outros (VONSHAK,
1997). A Universidade Federal do Rio Grande, em especial o Programa de Ps-
Graduao em Engenharia e Cincia dos Alimentos, desenvolvem pesquisas acerca
do cultivo de microalgas, como tambm o seu aproveitamento como bioprodutos de
alto valor agregado e baixo custo. Dentro desta universidade, o Laboratrio de
Engenharia Bioqumica tem se dedicado constantemente ao seu cultivo.
A principal microalga estudada e produzida devido s suas propriedades
nutricionais e teraputicas a do gnero Spirulina, principalmente S. platensis. Esta
cianobactria apresenta composio (54-74% de protenas, cidos graxos
poliinsaturados e vitaminas, alm de compostos antioxidantes) para uso como
complemento alimentar. A microalga classificada como GRAS (Generally
Recognized as Safe) pelo FDA (Food and Drug Administration), o que garante seu uso
como alimento sem riscos sade. No Brasil, a Spirulina, considerada um novo
alimento e seu consumo limita-se a 1,6g ao dia (FDA, 2003).
A Spirulina tambm monstra-se eficaz, no controle da diabetes, reduo de peso.
Alm dos benefcios supracitados, outros estudos cientficos j identificaram
propriedades anti-anmicas(ZHANG CHENG-WU, et al.,1994) e anti-intoxicao renal
da Spirulina (H. FUKINO, et al.,1990).
Existe um mecanismo ao qual pode estar associado reduo de peso
proporcionada pela Spirulina que o efeito da protena na saciedade. Segundo alguns
autores, a elevao do nvel de aminocidos plasmticos, observada aps a ingesto
de protenas, estimula a liberao de hormnios anorexgenos e insulina, os quais iro
atuar sobre o centro da saciedade, resultando na reduo do apetite (LANG et. al.,
1998; PAIVA et. al., 2007).
A Nanotecnologia comeou a ser discutida em 1959, pelo fsico Richard
Feymann, mas s pde ter avanos significativos em suas aplicaes a partir da
dcada de oitenta, com o desenvolvimento de microscpios especiais. De uma
maneira geral, os principais benefcios do avano da Nanotecnologia so: Controle
das caractersticas desejveis, Otimizao do uso de recursos e menor impacto
2

ambiental. O termo nanotecnologia interpretado da seguinte forma: o prefixo nano


indica medida, onde um nano significa a bilionsima parte de um metro, ou seja, 10 -9
metros. J a expresso nanotecnologia refere-se a uma srie de tcnicas utilizadas
para manipular a matria na escala de tomos e molculas que para serem
visualizados requerem microscpios especiais (MARTINS, 2005).
De acordo com Martins (2005), vrios pesquisadores na rea de
nanotecnologia esto trabalhando para desenvolver novos alimentos, os quais
permaneceriam inertes no corpo at liberarem seus nutrientes para as clulas, quando
fosse necessrio. Um elemento chave neste setor o desenvolvimento de
nanocpsulas que podem ser incorporadas aos alimentos para distriburem nutrientes.
Com isso, na indstria de alimentos, a encapsulao um processo no qual um ou
mais ingredientes ou aditivos (que constituem o ncleo) so revestidos por uma
cpsula comestvel (AZEREDO, 2005).
A Spirulina foi utilizada neste trabalho para estudos in vivo de sua
potencialidade de ser aproveitada em forma micromtrica, nanomtrica e de se
adequar a processo de encapsulao como ncleo. As vantagens de encapsular a
Spirulina platensis visa mascarar compostos de sabor indesejvel, retardando
alteraes que podem resultar em perda de aroma, alterao de cor ou perda do valor
nutricional, quando da aplicao em formulaes, assim como, tambm permitir a
liberao diretamente no organismo (AZEREDO, 2005).
3

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Avaliar as propriedades biolgicas e nutricionais de biomassa Spirulina LEB-18/FURG


em seus tamanhos micro e nanomtrico.

2.2 Especficos
Obter uma Spirulina em tamanho nanomtrico a partir da biomassa da spirulina
LEB-18/FURG
Analisar a composio centesimal da microspirulina e nanospirulina
Verificar atravs de testes in vivo o comportamento da microalga Spirulina LEB-
18 em tamanho nano e tamanho micro;
Determinar as respostas nutricionais da Spirulina nano mediante testes in vivo.
Analisar o efeito da nanospirulina nas respostas biolgicas, bioquimicas e
hematolgicas in vivo;
Avaliar o mtodo especfico de encapsulao da spirulina e caseina;
Determinar a eficincia da encapsulao;
4

3. Justificativa

O cultivo microalgal um dos mais modernos processos biotecnolgicos em


desenvolvimento. A utilizao de microalgas como fonte de alimento tem sido bastante
explorada em diversos pases como Frana, Estados Unidos, China e Tailndia.
A Universidade Federal do Rio Grande desenvolve pesquisas acerca do
cultivo de microalgas, como tambm de sua aplicao como bioprodutos de alto valor
agregado e baixo custo. Entre estas microalgas est a Spirulina platensis
constantemente estudada devido s suas propriedades nutricionais e teraputicas.
Esta microalga vem sendo utilizada como suplemento de dietas, apresentando
benefcios atravs de seu consumo, uma vez que pode ajudar em tratamento de
doenas do corao, hipertenso, obesidade, alcoolismo, tenso pr-menstrual
(COLLA, 2002).
Na indstria de alimentos, as pesquisas com nanotecnologias acenam para uma
revoluo tecnolgica diante do potencial de aplicaes, alterando a forma como o
alimento produzido, processado, embalado, transportado e consumido, tendo sua
aplicao em alimentos funcionais, os quais respondem s demandas do corpo e
podem distribuir nutrientes de modo mais eficiente (MARTINS, 2005). Vrios grupos
de pesquisas esto trabalhando para desenvolver novos alimentos, os quais
permanecem inertes no corpo e liberam os nutrientes para as clulas quando for
necessrio. Um elemento chave neste setor o desenvolvimento de nanocpsulas
que podem ser incorporadas aos alimentos para distriburem nutrientes (MARTINS,
2005).
Com isso, as aplicaes da nanotecnologia possibilitam a fabricao de
produtos com caractersticas diferenciadas ao manipular a estrutura molecular,
alterando a geometria ou arquitetura da composio das molculas dos materiais. A
partir desta modificao geomtrica, os elementos adquirem caractersticas fsico-
qumicas diferentes das tradicionais, ou seja, diferentes daquelas conhecidas no
tamanho em que aparecem na natureza. Mudanas nas propriedades dos materiais
em escala nano causam alteraes tambm em sua microlocomoo (ou seja, seu
movimento atravs da matria), bem como sua potencialidade para invadir barreiras,
como a pele humana e membranas (como poder ocorrer em membranas do crebro
e pulmo, por exemplo) (AZEVEDO, 2003).
Assim, com a indstria de alimentos, apoiando as novas aplicaes da
nanotecnologia, tornaram-se aparentes, incluindo o uso de nanopartculas, como os
5

lipossomas (SOZER e KOKINI, 2009), que podem ser utilizados para a encapsulao
de ingredientes alimentcios.
A encapsulao envolve a incorporao, absoro ou disperso de compostos
slidos, lquidos ou gasosos dentro, ou em vesculas pequenas, que podem chegar
escala nanomtrica. As combinaes de compostos incorporados podem ser
protegidas contra degradao, melhorar a estabilidade e solubilidade (e.x,
solubilizao de componentes hidroflicos em matrizes hidrofbicas e vice-versa)
(KLAYPRADIT E HUANG, 2008; JAFARI et al., 2008).O ncleo o local onde se
encontra o componente ativo, e este pode ser composto de um ou mais ingredientes.
A spirulina platensis foi utilizada neste processo de encapsulao como ncleo. As
vantagens de encapsular a Spirulina platensis visa mascarar compostos de sabor
indesejvel, retardando alteraes que podem resultar em perda de aroma, alterao
de cor ou perda do valor nutricional (AZEREDO,2005), quando da aplicao em
formulaes, assim como, tambm permitir a liberao diretamente no organismo.
Com isso um dos processos utilizados para encapsulao so os lipossomas.
Segundo Faceto (2006) e Santos (2002), os lipossomas so vesculas formadas por
bicamadas lipdicas unilamelares ou multilamelares, pequenas ou grandes. Os
tamanhos dos lipossomas podem variar dentro de uma faixa relativamente ampla de
dimenses: de algumas dezenas de nanmetros a algumas centenas de micrmetros.
Dentre os vrios mtodos de elaborao de lipossomas pode-se citar o mtodo de
hidratao do filme lipdico.
6

Capitulo II

Reviso Biobliogrfica

e Materiais e Mtodos
7

4 Reviso bibliogrfica

4.1 Histrico Spirulina platensis


A cianobactria Spirulina (Arthrospira platensis) um micro-organismo aqutico,
de cor verde azulada, que possui um filamento helicoidal multicelular (Figura 1). A
Spirulina possui envoltrio celular mais parecido com uma bactria do que com uma
alga, isto , suas paredes celulares so mais digerveis uma vez que so formadas por
mucopolissacardeos e no por celulose, o que representa vantagem do ponto de vista
de preservao da integridade de componentes, como vitaminas e cidos graxos
poliinsaturados (TOMASELLI, 1993).

Figura 1 - Vista microscpica de uma spirulina.


Fonte: http://www.antenna.ch/malnutrition.
Nos ltimos tempos, os cientistas vem se interessando pelas caractersticas
nutricionais e teraputicas da Spirulina, porm as suas qualidades j eram conhecidas
pelos Astecas, que a chamavam de tecnitlatl, e pelos Kanembous povo que habita a
regio do Kanem, no Chade, pas da frica Central, que h muito tempo recolhe a
spirulina, filtrando a gua dos lagos (Figura 2). A massa dessa alga microscpica se
concentra ento num pur de um verde profundo que espalhada no solo para
secagem. Uma vez seca a spirulina pode ser armazenada durante muito tempo
(Figura 2). A spirulina adicionada nos alimentos diariamente aumentando o valor
nutricional desses, sendo um suplemento alimentar de suma importncia naquela
regio, vendida nos mercados com o nome de DIH (MICHKA, 2005).
8

A B

Figura 2: Mulheres africanas filtrando a spirulina (A) e Mercador africano vendendo a


spirulina seca, com nome de DIH(B).
Fonte:http://www.antenna.ch/malnUtrition
Ultimamente existe uma grande procura pela spirulina, principalmente nos pases
desenvolvidos, onde a mesma usada para diversos fins, por exemplo, como
complemento nutricional, adicionada a cosmticos, cremes para a pele, em corantes
de balas, na rao de peixes, camares e galinhas poedeiras, alm de utiliz - la em
inmeras pesquisas cientficas com o intuito de estudar seu potencial teraputico.
Devido a essa procura, sua produo aumenta a cada ano e inmeros pases j a
produzem em grande escala, por exemplo Espanha, Frana, Alemanha, Chile,
Equador, China, Tailndia, ndia, e, sobretudo os Estados Unidos onde atinge um alto
preo (FOX, 1999).
A lagoa Mangueira, localizada na regio sul do estado do Rio Grande do Sul,
Brasil, apresenta altos niveis de carbonato e um pH alcalino, com caracteristicas fisico-
quimicas adequadas para o crescimento da spirulina, por esta razo no municipio de
Santa Vitoria do Palmar foi construida,atravs de projeto especifico da FURG, uma
planta-piloto para produo desta cianobacteria (COSTA, 2004).
9

4.1.1 Condies de crescimento e cultivo


Para um crescimento timo das microalgas, de acordo com Derner (2006), existe
uma srie de nutrientes necessarios, sendo que a quantidade requerida depende do
microorganismo em estudo. Quanto aos macronutrientes, requerem carbono,
nitrognio, oxignio, hidrognio e fsforo, alm de clcio, magnsio, enxofre e
potssio. Como micronutrientes, geralmente requerem ferro, mangans, cobre,
molibdnio e cobalto, enquanto algumas microalgas tambm necessitam baixas
concentraes de vitaminas no meio de cultura.
O meio Zarrouk (1996) um dos diversos meios utilizados para o cultivo da
Spirulina, o meio mais utilizado para o preparo e manuteno do inculo na
fermentao. Este composto por: NaHCO 3; K2HPO4; NaNO3; K2SO4; NaCl;
MgSO4..7H2O ; CaCl2; EDTA; e solues A5 e B6. A soluo A5 possui H3BO3; MnCl2.
4H2O; ZnSO4. 7H2O; CuCO4. 5H2O; MnO3; e a soluo B6 contm NH4VO3; 12
KCr(SO4)2. 12H2O; NiSO4. 6H2O; Na2WO4.2H2O; TiOSO4.; H2SO4. 8H2O; Co(NO3)2.
6H2O. O cultivo de microalgas para a obteno de biomassa e de seus produtos de
sntese uma atividade industrial estabelecida em escala comercial em alguns pases
como China, ndia, Austrlia e Israel (FDA, 2003). No Brasil, a produo da microalga
em nvel experimental tem se tornado frequente devido necessidade de pesquisas
visando o desenvolvimento e o aperfeioamento dos sistemas de produo. O cultivo
otimizado da Spirulina realizado em escala laboratorial em biorreatores, estimulando
assim a produo de compostos de interesse comercial e conhecimento sobre as
variveis de crescimento (RANGEL, 2000; ANDRADE & COSTA, 2008). A escolha do
meio de cultivo depende dos produtos de interesse (biomassa, cidos graxos,
pigmentos, etc.) que as microalgas podem sintetizar naquelas condies de meio
(DERNER,2006). Conforme Tomaselli (1993), estudos mostraram que a composio
da biomassa da S. platensis varia conforme os ciclos claro/escuro aos quais a mesma
submetida. No perodo iluminado ocorre a sntese dos carboidratos em detrimento
protena, durante o perodo escuro as protenas so sintetizadas a partir dos
carboidratos .
Para o emprego na elaborao de alimentos, bem como para a extrao de
alguma substncia de interesse, depois de transcorrida a fermentao necessrio
separar a biomassa do meio de cultura. O processo de separao envolve uma ou
mais operaes slido:lquido, como floculao, centrifugao e filtrao, por exemplo.
Em seguida, a biomassa desidratada; para tanto, podem ser empregadas diversas
tcnicas, como secagem ao sol, spray-drying e liofilizao.
10

De acordo com Derner (2006), para extrao dos compostos, as clulas microalgais
so rompidas, empregando-se mtodos de homogeneizao, ultra-som, choque
osmtico, solventes, enzimas, etc. As substncias de interesse so ento recuperadas
e, na maioria dos casos, sofrem algum processo de purificao como ultrafiltrao,
cromatografia ou fracionamento. Esses parmetros de produo no so fixos, eles
dependem no s do biorreator utilizado como tambm do objetivo da pesquisa.

4.2 Biotecnologia e cianobactrias


As cianobactrias so procariontes tendo, portanto, o material gentico disperso
na clula (DERNER, 2006). Sendo organismos pertencentes ao reino Monera, onde
estes micro-organismos fotossintticos, os quais crescem em meio lquido e se
reproduzem rapidamente, podendo multiplicar sua biomassa em perodos de 24h,
gerando compostos biologicamente ativos, como protenas. O interesse no cultivo
destes organismos fundamenta-se em suas variadas e possveis aplicaes tais como
alimentao, produo de energia qumica, extrao de pigmentos entre outras
substncias celulares de interesse industrial e no tratamento de guas residurias
(BURJA et al., 2001).
Conforme Radmann & Costa (2008) existem diversos mtodos para capturar CO 2
liberado por indstrias e usinas termoeltricas, destacando-se a utilizao de
microalgas. Com a utilizao de CO 2 as microalgas se multiplicam e produzem uma
srie de compostos de interesse, como protenas, cidos graxos e corantes. Alm
desse processo que favorece a preservao do meio ambiente, as microalgas
contribuem tambm no tratamento de efluentes e ao se reproduzirem nesse meio,
aumentam sua biomassa, a qual pode ser utilizada como fonte de alimentao e/ou de
extrao de biocompostos.
11

4.3 Legislao
A Spirulina, em maio de 2009, passou a fazer parte da Lista de Novos
Ingredientes (enquadrada nos Alimentos com Alegaes de Propriedades Funcionais
e/ou de Sade, Novos Alimentos/Ingredientes, Substncias Bioativas e Probiticos)
aprovada pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, a qual limita a sua ingesto
diria em 1,6g por indivduo (BRASIL, 2009).

4.4 Aspectos nutricionais do uso da Spirulina como alimento


Dentre os nutrientes que compem a biomassa seca da microalga Spirulina
platensis, vrios so os que apresentam importncia por suas propriedades
nutricionais e comerciais, dentre os quais esto as protenas e aminocidos, os
pigmentos e os cidos graxos poliinsaturados(HENRIKSON,1994).

4.4.1 Protenas e aminocidos


Comparando-se a Spirulina com outras fontes de protenas, esta apresenta
teores mais elevados que a carne de peixes (15-25%), que sementes de soja (35%),
ovos(12%), cereais(8-14%) e leite integral (3%). Quanto aos aminocidos, na Spirulina
os limitantes so a cistena e a metionina, porm apresentam-se nesta alga em
quantidades superiores s encontradas em cereais, sementes e verduras
(HENRIKSON,1994).
Na avaliao da qualidade das protenas e em geral dos nutrientes do
alimentos so utilizados diversos conceitos, como: qualidade do nutriente presente no
alimento, quantidade do nutriente ingerido, que ser digerido de forma que possa ser
absorvido pelo organismo, quantidade do nutriente digerido que ser efetivamente
absorvido pelo organismo, quantidade do nutriente absorvido que poder ser utilizado
pelo organismo para realizar uma funo biolgca e quantidade do nutriente que o
organismo poderia utlilizar (HERNANDEZ,1996).

4.4.2 Vitaminas
Esta cianobactria fonte de vitaminas lipossoluveis como a prvitamina A,
vitaminas E e K bem como as do complexos B e vitamina C. Conforme Janby(1988),
apenas 1,8g de Spirulina alcanaria o valor de RDA ( recommendied Dietary
Alowance) para vitamina B12, importante fator para as clulas vermelhas do sangue.
12

4.4.3 Pigmentos
Os carotenides so fotopigmentos lipossolveis podendo apresentar-se como -
caroteno, xantofilas, zeaxantina e lutena (OLAIZOLA E DUERR, 1990). As
quantidades de -caroteno encontradas na microalga podem chegar a concentraes
dez vezes maiores que as encontradas na cenoura. Conforme Herikson,(1994), em
10g da microalga seca, pode-se encontrar cerca de 23.000Ul (14mg) do composto,
cerca de 460% da dieta recomendada. Em valores percentuais , o contedo de
carotenides de 0,37% na microalga.
O consumo de -caroteno tem sido indicado por reduzir os riscos de contrao
de cncer, devido a capacidade de desativar os radicais livres, evitando que
reacionem no organismo. Tambm podem estimular populaes de lactobacilos
intestinais, aumentando a absoro de vitamina B1.
A ficocianina o principal pigmento da microalga, podendo chegar a 20% em
peso seco. Tem sido utilizada como pigmento alimentcio e de cosmticos
(RICHMOND, 1990). A ficocianina apresenta-se como estimulante ao sistema
imunolgico, aumentando a contagem de leuccitos, cuja funo principal manter a
sade dos rgos do corpo, proteger contra o cncer, lceras e hemorridas
(HENRIKSON,1994).
A clorofila pode ser utilizada como corante alimentcio verde. encontrada em
pequenas quantidades na microalga quando comparada s quantidades de
ficocianina, sendo apenas 1,1 %, apresentando-se principalmente como clorofila-a
(HENRIKSON,1994).

4.4.4 Acidos graxos poliinsaturados


A Spirulina platensis possui cidos graxos poliinsaturados, sendo uma fonte
potencial de acido gama-linolnico (GLA), o qual constitui de 20-25% de lipdio da
microalga.

4.4.5 Lipidios no organismo

4.4.5.1 Transporte dos lipdios e lipoprotenas


Os lipdios so transportados na corrente sanguinea como lipoprotenas (Figura
3) que existem em diversas variantes, cada uma com funo diferentes composies
lipidicas e proticas diferentes. Os lipidios provenientes da alimentao so
empacotados nos quilomicrons; a maioria parte de seu contedo em triacilgliceris
liberada para os tecidos adiposo e muscular pela lipoprotena lipase durante o
13

transporte atravs dos capilares. Os remanescentes dos quilomicrons (contendo


principalmente protena e colesterol) so captadas pelo fgado. Lipdios endgenos e
colesterol do fgado so liberados para os msculos e para os adipocitos pelas VLDL.
A extrao de lipidios das VLDL (junto com a perda de algumas das lipoproteinas)
convertem gradualmente parte delas em LDL, estas transportam o colesterol para os
tecidos extra-hepticos ou so captadas de novo pelo fgado. O figado capta
remanscentes das LDL,VLDL e quilomicrons por meio do processo de endocitose
mediada por receptores. O excesso de colesterol nos tecidos extra-hepticos
transportado de volta ao fgado como HDL. No figado parte do colesterol
transformada em sais biliares (LEHNINGER, 2010).

Figura 3: Transporte dos lipidios e lipoproteinas


Fonte :Lehninger 2010.

4.4.5.2 Teor lipdico no fgado


A degenerao gordurosa no uma doena especfica, mas pode ocorrer como
seqela de uma variedade de perturbaes do metabolismo normal. MACLACHLAN e
CULLEN (1998) apresentam os mecanismos potenciais responsveis pelo acmulo
excessivo de gordura no fgado incluem os seguintes:
a) entrada excessiva de cidos graxos para o fgado, que pode ocorrer pela ingesto
excessiva de gordura com a alimentao ou pela mobilizao do aumento de
triglicerdeos do tecido adiposo, como por exemplo, no perodo de lactao.
14

b) funo anormal do hepatcito, que pode levar ao acmulo excessivo de


triglicerdeos no hepatcito devido reduo, nesta clula, da oxidao dos cidos
graxos.
c) ingesto excessiva de carboidratos na alimentao resultando na sntese
aumentada de cidos graxos, com formao excessiva de triglicerdeos nos
hepatcitos.
d) aumento na esterificao de cidos graxos a triglicerdeos.
e) reduo na sntese de apoprotenas e subsequente decrscimo na produo e
exportao de lipoprotenas pelo hepatcito.
f) decrscimo na secreo de lipoprotenas pelo fgado.
Deve ser frisado que esses so mecanismos potenciais e que mais de um defeito
pode ocorrer em um determinado distrbio heptico independente da causa, o aspecto
macroscpico do fgado com degenerao gordurosa bastante caracterstico. Com a
acumulao progressiva de lipdios, o fgado aumenta de volume e torna-se
amarelado. Em casos menos acentuados, lipdios podem acumular-se somente em
regies especficas do lbulo heptico, como a regio centrolobular, conferindo assim,
uma acentuao do padro lobular ao ligado em casos mais graves, todo o fgado est
difusamente afetado, o rgo pode tornar-se consideravelmente aumentado de volume
e apresentar uma textura gordurosa, vacolos lipdicos so facilmente detectveis no
citoplasma dos hepatcitos (MACLACHLAN & CULLEN, 1998).

4.5 Nanotecnologia em Alimentos


Os termos nanocincia e nanotecnologia renem muitas idias e procedimentos
conhecidos com uma proposta de inovao tecnolgica que auxilie e acompanhe
todos os avanos cientficos importantes hoje, utilizando ferramentas novas,
anteriormente no disponveis, que permitem ver as estruturas nanomtricas e at
movimentar tomos, por exemplo, as microscopias de fora atmica (mostra detalhes
topogrficos em superficies) e de tunelamento (que permite movimentar tomos e
observar densidade eletrnica), com vrios modos diferentes de obteno de imagem
(INOUE, 1989; GATTI, 2002; HARUYAMA, 2003).
Nano um prefixo grego que significa "ano". Um nanmetro (nm) igual a 1
milionsimo de milmetro ou 1 bilionsimo de metro. Para ter-se uma idia, um fio de
cabelo possui o dimetro de 100.000 nm. tomos so cerca de 1/10.000 do tamanho
de uma bactria e bactrias so 1/10.000 do tamanho dos mosquitos (DURAN, 2003).
O termo nanopartculas aplicado liberao controlada de compostos amplo e
15

refere-se a dois tipos de estruturas diferentes, nanoesferas e nanocpsulas, Figura 4.


Denominam-se esferas aqueles sistemas em que o composto encontra-se
homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimrica ou cerosa
(AZEVEDO, 2003). Desta forma obtm-se um sistema monoltico, onde no possvel
identificar um ncleo diferenciado. Nanocpsulas, ao contrrio, constituem sistemas
reservatrios, onde possvel identificar-se um ncleo diferenciado, que pode ser
slido ou lquido.

Figura 4: Exemplos das diferentes formas de compostos: (A) esfera (sistema


atricial) e (B) cpsula (sistema reservatrio).
Fonte: http://lqes.iqm.unicamp.br(acesso :maro de 2011.

Os EUA, Inglaterra, Japo e alguns pases da Unio Europia tm investido


volumes expressivos de recursos em pesquisa e desenvolvimento no segmento da
nanocincia e das nanotecnologias. Por outro lado, algumas estimativas indicam que
mais de 1.200 grupos corporativos no mundo esto direcionando grandes volumes de
recursos para o desenvolvimento de aplicaes na rea. A inteno de investimentos
e o discurso das agncias de fomento de diversos pases, das empresas e das
universidades tm apontado para a janela de oportunidades que a nanotecnologia
abrir, tanto do ponto de vista de novos mercados como da competitividade entre
empresas e pases (DIEESE, 2008). No Brasil, como em todo o mundo, h uma
ampla gama de estruturas e aplicaes nanotecnolgicas. Uma vez que um produto
desenvolvido, ele pode ser usado para uma grande variedade de aplicaes.
D-se o nome de nanoalimento aos alimentos que foram cultivados, produzidos,
processados ou embalados com o uso de tcnicas ou de ferramentas
nanotecnolgicas, ou que tenham tido a adio de nanomateriais (DIEESE, 2008).
16

4.6 Encapsulao
A encapsulao definida como a tecnologia de armazenamento de materiais
slidos, lquidos ou gasosos em cpsulas seladas que podem libertar o seu contedo
sob determinadas condies pr-estabelecidas (SPARKS, 1981). O encapsulamento
confere um meio de proteo a componentes sensveis dos alimentos, pode evitar
perdas nutricionais, aplica-se a ingredientes sensveis de sofrer alteraes, preserva
aromas e cheiros, transforma ingredientes lquidos em slidos fceis de manusear.
Uma tecnologia de encapsulamento tanto mais eficiente quanto menores as
perdas de aroma durante o processo, e quanto maior a concentrao e estabilidade do
aroma no produto final.
Um nmero elevado de fatores deve ser considerado para selecionar o mtodo mais
correto no encapsulamento de aromas, Tuley (1996). necessrio ter em
considerao:
- O tipo de material de transporte (matriz) a utilizar;
- O tipo de substncias auxiliares que sero incorporadas (solventes, ligantes,
protenas);
- A solubilidade do aroma (hidrossolvel ou lipossolvel);
- Os parmetros de processamento de aplicao especfica a que o aroma
encapsulado deve resistir (temperatura, pH, dissoluo) e o mecanismo de libertao
do composto;
- Especificaes, como o tamanho de partculas, densidades e condies de
armazenamento.
As principais nanoestruturas utilizadas para encapsulao de ativos so os
lipossomas, as ciclodextrinas, as nanopartculas polimricas e as nanopartculas
lipdicas.
As vantagens destes sistemas so a melhora da estabilidade qumica e fsica dos
ativos, melhora da biodisponibilidade, manuteno do ativo no tecido alvo, muitas
vezes, possibilitando a penetrao deste em zonas corpreas de difcil acesso,
solubilizao de ativos hidrofbicos, reduo de efeitos colaterais e da toxicidade,
assim como do nmero de doses e freqncia de administrao,proporcionando maior
conforto do paciente e, conseqentemente, a maior adeso ao tratamento (SANTANA,
et al.,2010). Umas das materias primas utilizadas para encapsulao a lecitina de
soja.
17

4.6.1Lecitina de soja
A lecitina (Figura 5) a designao dada a uma mistura de glicolpideos,
triglicerdeos e fosfolipdios (por exemplo: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e
fosfatidilinositol). Contudo, em bioqumica, o termo lecitina usualmente, utilizado
como sinnimo de fosfatidilcolina pura - um fosfolpido que constitui o principal
componente da fraco fosfatada que se obtm da gema de ovo (em grego: lekithos -
, de onde deriva o nome do composto) ou de gros de soja, de onde extrada
por meios mecnicos ou qumicos, utilizando hexano. A lecitina comercializada, em
elevado grau de pureza, como suplemento alimentar e para uso mdico (MERTINS,
2004).
A lecitina usada comercialmente tanto como emulsionante quanto como
lubrificante em diversas atividades econmicas, como na indstria farmacutica ou
alimentar. Por exemplo, utilizada como emulsionante em chocolates e na produo
de revestimento para alimentos. A lecitina considerada como um surfactante no-
txico, bem tolerado pelo organismo, at porque parte integral das membranas
celulares e pode ser totalmente metabolizada. Foi classificada nos Estados Unidos da
Amrica, pela Food and Drug Administration, como sendo geralmente reconhecida
como produto seguro para o consumo humano. A lecitina reconhecida como aditivo
alimentar pela Unio Europeia com o nmero E E322(ZAMBELLI E MOREIRA, 2009).
Outra vantagem da lecitina da soja que ela pode ser usada como ingrediente
alimentar, servindo como estabilizador vitamnico, protegendo as vitaminas A e E
contra oxidaes, e tambm servindo como fonte de colina, inositol e outros
componentes estimulantes do crescimento (MEYERS, 1990).
A fostatidilcolina (lecitina de soja) um fosfolipdio natural de massa molar
igual a 780 g/mol e =0,05 g/cm3 (REYS, 2010 apud WILLARD et al., 1998). Faz parte
da composio molecular das membranas biolgicas e tambm se encontra presente
no plasma sanguneo como constituinte de lipoprotenas. biocompatvel,
biodegradvel e tem ao detergente. Sua estrutura (Figura 6) formada por duas
longas cadeias hidrocarbnicas, uma saturada e outra insaturada, que constituem a
poro hidrofbica ou apolar da molcula. A poro hidroflica ou polar formada pelo
glicerol, o grupo fosfato e a colina (MERTINS, 2004). A fosfatidilcolina um slido
amarelado, higroscpico e pouco estvel. facilmente decomposta em altas
temperaturas e degradada pela ao do oxignio quando exposta ao ar e umidade
por longos perodos. Seu principal produto de degradao a lisofosfatidilcolina,
resultante da hidrlise da funo ster no carbono de posio 1 ou 2 do glicerol,
fornecendo uma molcula com apenas uma cadeia apolar (REYS, 2010 citando
18

KISHIMOTO et al., 2002). Sua presena aumenta consideravelmente a


permeabilidade das membranas de lipossomas, diminuindo a capacidade de reteno
de material encapsulado nos lipossomas (LUTZ et al., 1995).A fosfatidilcolina de soja
obtida do subproduto no processo de fabricao do leo de soja. Esta matria prima
constituda de uma mistura de um grande nmero de cidos graxos, lipdios, protenas,
pigmentos e fosfolipdios de diferentes estruturas moleculares, com a fostatidilcolina
representando entre 10 e 20%. A purificao industrial e laboratorial feita por
cromatografia em coluna. Os processos mais acessveis utilizam colunas de slica ou
alumina e misturas de clorofrmio: metanol como eluente (MERTINS, 2004).

Figura 5: Lecitina de soja purificada


Fonte: Imagem do autor,2011

Figura 6: Estrutura molecular da fosfatidilcolina


Fonte: (REYS, 2010 citando MERTINS, 2004).
A fosfatidilcolina, atualmente, largamente empregada nas indstrias
farmacutica e cosmtica como emulsificante excipiente e na produo de lipossomas,
19

bem como nas indstrias alimentcias e de tintas como estabilizante e emulsificante


(MARON et. al., 2007).

4.6.2 Lipossomas
As nanoestruturas utilizadas para encapsulao so denominadas Lipossomas
(Figura 7), onde estes so vesculas microscpicas compostas de uma ou mais
bicamadas lipdicas concntricas, separadas por um meio aquoso, sendo amplamente
difundidas nas reas medica e farmacutica; na rea de alimentos, eles vm sendo
utilizados como encapsuladores de aromas, mascaradores de sabor e protetores de
nutrientes contra degradaes do trato gastro intestinal. Podem encapsular
substncias hidroflicas e/ou lipoflicas, sendo que as primeiras ficam no
compartimento aquoso e as lipoflicas inseridas ou adsorvidas na membrana. Por
serem biodegradveis, biocompatveis e no imunognicos so altamente versteis
para pesquisa, teraputica e aplicaes analticas (EDWARDS, BAEUMNER, 2006;
NEW, 1990; PUISIEUX et al., 1995). Estas vesculas so constitudas basicamente
por fosfolipdeos (podendo ser de natureza sinttica ou natural),esteris e um
antioxidante (VEMURI, RHODES, 1995). Os lipdios (Figura 8) mais utilizados nas
formulaes de lipossomas so os que apresentam uma forma cilndrica como as
fosfatidilcolinas, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e esfingomielina, que tendem a formar
uma bicamada estvel em soluo aquosa. As fosfatidilcolinas so as mais
empregadas em estudos de formulao de lipossomas, pois apresentam grande
estabilidade frente a variaes de pH ou da concentrao de sal no meio. Os
fosfolipdios so caracterizados por uma temperatura de transio de fase (Tc), na
qual a membrana passa de uma fase gel, onde a cadeia hidrocarbonada do lipdio est
em estado ordenado, para uma fase de cristal-lquido, onde as molculas ficam com
movimentos mais livres e os radicais hidroflicos agrupados tornam-se completamente
hidratados. O comprimento e a saturao da cadeia lipdica influenciam o valor da Tc.
Portanto, diferentes membranas compostas por lipdios distintos podem exibir
diferentes nveis de fluidez na mesma temperatura (FRZARD, 2005; LASIC, 1998). A
permeabilidade dos lipossomas relativamente baixa quando a temperatura menor
que a Tc dos lipossomas, sendo a mesma medida pelo fluxo ou pela taxa em que o
soluto sai do compartimento aquoso, atravs da bicamada. Esta propriedade vai
depender, no entanto, da natureza do soluto e da fluidez da membrana (FRZARD,
1999).
20

Figura 7- Estrutura do lipossoma e Corte transversal de um lipossoma unilamelar. Em


vermelho, as cabeas polares; em preto, as caudas hidrofbicas.
Fonte: Disponvel em <http://www.uni-magdeburg.>
Com isso, os lipossomas foram desenvolvidos para melhorar a biodistribuio de
compostos em locais especficos do corpo humano. Portanto, passaram a ser
reconhecidos como transportadores de compostos biologicamente ativos, tendo a
capacidade de potencializar e/ou modificar a atividade dos compostos com os quais
eles esto associados. Este efeito dependente da composio qumica e da
estrutura fosfolipdica (GMEZ-HENZ & FERNANDEZ-ROMERO, 2005).

Figura 8: Caractersticas estruturais dos lipossomas


Fonte:Demicheli et.al,2005 Quimica Nova

Os liposomas podem ser produzidos numa gama de dimenses que vai de


alguns nanmetros a vrios micrmetros. Com isso, os lipossomas so distinguidos
pelas seguintes categorias: Lipossomas Unilamelares pequenos (Small Unilamelar
21

Vesicles-SUVs), so os menores na escala de tamanho com dimetro variando entre


20 e 80 nm, onde a membrana formada por uma nica bicamada fosfolipidica;
Lipossomas Unilamelares grandes(Large Unilamelar Vesicles-LUVs), so
intermedirios na escala de tamanho com dimetro variando entre 80nm e 1m, onde
a membrana formada por uma nica bicamada fosfolipidica: Lipossomas
Multilamelares pequenos(Multilamelar Vesicles-MLVs), apresentam dimetro mdio
entre 400 nm e alguns micrometros, a membrana formada por uma bicamada
fosfolipidica, dispostas na forma concntrica(Mertins,2008). Lipossomas gigantes:
apresentam vesculas unilamelares gigantes ou GUV (giant unilamellar vesicles),
com dimenses superiores a 1 m, podendo chegar s dezenas de m,(Figura 8),
tamanho comparvel ao de uma clula eucariota(SANTOS, 2002 citando LASIC,
1995).
Os lipossomas podem carrear substncias lipoflicas dentro de suas
bicamadas lipdicas, permitindo assim um aumento no transporte de compostos s
clulas ou tecidos especficos, aumentando a potncia e/ou reduzindo a toxicidade do
agente encapsulado.

4.6.3 Toxicidade de alimentos em tamanho nanomtrico


Miller e Senjen (2008) alertam sobre a crescente aplicao das nanotecnologias
na produo de alimentos, por meio de nanopartculas, nanoemulses e nanocpsulas
no processamento e embalagens dos alimentos, sem a devida regulao. Se por um
lado as nanotecnologias podem proporcionar melhorias no desempenho industrial, na
qualidade nutricional e na eficincia das embalagens dos alimentos, podem tambm
trazer maiores riscos sade humana e ao meio ambiente. Exemplos so as
nanopartculas de prata, dixido de titnio e xido de zinco, utilizados em suplementos
nutricionais e em embalagens, mas que apresentaram elevada toxicidade para clulas.
Diante dos riscos potenciais associados s aplicaes das nanotecnologias na
agricultura e nos alimentos, Miller e Senjen (2008) defendem uma moratria no
desenvolvimento de produtos alimentcios, embalagens e agroqumicos at que a
segurana especfica das nanotecnologias seja discutida e regulamentada sob os
seguintes aspectos: a) nanomateriais devem ser regulados como novas substncias;
b) ampliao da definio de nanomateriais; c) transparncia na avaliao quanto
segurana dos nanomateriais; d) rotulagem dos produtos; e) maior envolvimento da
sociedade nas discusses, tanto do ponto de vista da segurana, quanto para a
sustentabilidade da produo agrcola e de alimentos.
22

No entanto, o impacto ao meio ambiente e sade humana ainda bastante


controverso, principalmente devido falta de estudos toxicolgicos.

5 MATERIAL E MTODOS

5.1 Material

5.1.1 Obteno da Biomassa microalgal


A biomassa da microalga Spirulina LEB cepa-18 foi fornecida pelo Laboratrio
de Engenharia Bioqumica , isolada da lagoa Mangueira, Santa Vitoria do Palmar, Rio
Grande do Sul, Brasil (MORAIS et al , 2008) e suplementada com 20% do meio
Zarrouk, conforme a figura 9 (COSTA et al., 2004).

5.1.2 Cultivo e processo de obteno da microalga


O cultivo de microalgas para a obteno de biomassa e de seus produtos de
sntese uma atividade industrial estabelecida em escala comercial em alguns pases
como China, ndia, Austrlia e Israel (FDA, 2003).
No Brasil, a produo da microalga em nvel experimental tem se tornado
freqente devido necessidade de pesquisas visando o desenvolvimento e o
aperfeioamento dos sistemas de produo. O cultivo de microalgas pode ser utilizado
na remoo de nutrientes, contaminantes orgnicos, metais pesados e patgenos de
guas residuais, fornecendo subproduto que pode ser utilizado na produo de
compostos de alto valor agregado ou na produo de biocombustveis (MUOZ &
GUIEYSSE, 2006).
A produtividade da biomassa em um cultivo depende, principalmente, da
luminosidade e da temperatura, desde que as fontes de nutrientes sejam adequadas
(ROSA, 2008).
A produo da microalga Spirulina cepa LEB-18/FURG, realizada na Planta Piloto
localizada as margens da Lagoa Mangueira (33o 30 13 S e 53o 08 59 W) em Santa
Vitria do Palmar, RS. A unidade consiste de 3 tanques abertos tipo raceway de
10.000L e 1 tanque aberto tipo raceway de 1.000L para propagao do inculo. Os
cultivos so protegidos por tnel de filme transparente com proteo contra raios UV e
expostos a condies ambientais naturais. Quando a microalga atinge a concentrao
0,50g.L-1, sua biomassa separada atravs de filtrao e seca em secador de
bandejas a 50C por 5h (MORAIS et al., 2008). A figura 9 apresenta a forma de cultivo
e processo de obteno da microalga.
23

Figura 9. Processo de obteno da Spirulina pelo Laboratrio de Engenharia Bioqumica


(LEB/FURG).
Fonte: LEB-FURG, 2010.

5.1.3 Ingredientes para elaborao das dietas


Casena, L-cistina, cloridrato de colina, minerais p.a., mistura vitamnica
(manipulao farmacutica), leo de soja, sacarose, fibras de trigo e amido de milho
foram adquiridos no comrcio local. A mistura de minerais (REEVES et al., 1993) foi
obtida atravs da pesagem e homogeneizao dos minerais adquiridos.
24

5.2 Mtodos

5.2.1 Preparo da biomassa


A biomassa de Spirulina LEB-18 foi triturada em moinho de bolas (Modelo Q298-2)
e peneirada em agitador de peneiras, alcanando uma granulometria de 200m. Aps
foi acondicionada a vcuo em embalagens de polietileno de alta densidade (PEAD),
com capacidade para 500g, e armazenada sob refrigerao temperatura de 5C.

5.2.2 Composio centesimal


Foram realizadas determinaes, em triplicata, de umidade, lipdio, cinzas e
protenas da Spirulina LEB-18 e das dietas, segundo os mtodos descritos pelo
Institututo Adolfo Lutz (2008) e os lipdios pelo mtodo Bligh and Dyer, (1959).

5.2.3 Purificao parcial da Lecitina de soja


A lecitina de soja bruta comercial foi parcialmente purificada conforme Mertins
(2008), sendo dissolvidas 50 g da mesma em 250 mL de acetato de etila. Aps,
lentamente, e sob agitao, foram adicionados 10 mL de gua destilada, ocorrendo a
formao de duas fases. O sobrenadante foi descartado. A fase inferior, com aspecto
de gel, foi dispersa em 150 mL de acetona, formando aglomerados que foram
triturados com basto de vidro. A acetona foi separada por decantao dos slidos; e
mais 250 mL de acetona foram adicionados, repetindo-se o processo de triturao. O
precipitado foi filtrado sob vcuo e seco em estufa a 60C2C e resfriado em
dessecador.

5.2.4 Comparao de mtodos de avaliao da nanoencapsulao da biomassa


Spirulina LEB-18.
O processo de encapsulao foi realizado de acordo com a metodologia de
hidratao do filme lipdico, segundo Malheiros (2010). A fonte de lipdios utilizada
para a elaborao dos lipossomas foi a fosfatidilcolina purificada a partir da lecitina de
soja. Primeiramente, 5 e 2 g da fosfatidilcolina foram dissolvidas em 500 mL e 200mL
de clorofrmio, em balo de fundo redondo, respectivamente, aps sua completa
disperso, o solvente orgnico foi removido em evaporador rotatrio at que fosse
observado um filme lipdico depositado nas paredes do balo. Os traos de solvente
orgnico foram removidos atravs da estocagem do balo por 18h em dessecador a
vcuo. O filme lipdico resultante foi disperso pela adio de 20 mL de tampo fosfato
pH 7,0, 0,2 M contendo a cada filme 2 g de Spirulina LEB-18 dissolvida. A mistura
25

contida no balo foi submetida temperatura excedente a fase de transio (60 C).
Aps os lipossomas foram submetidos a tratamentos distintos de sonicao, utilizando
banho ultrasnico (40 kHz, Unique USC 700) a 60 C durante 30 min ou
homogeneizao (Ultra-Turrax) a 10.000 rpm durante 15 min(Figura 10).

5 e 2g Fosfatidilcolina Dissoluo em solvente orgnico


Evaporao
respectivamente Spirulina
dissolvida em
Tampo fosfato

Spirulina e filme
sob Aquecimento
em Banho-Maria

Lipossoma sob
Agitao

Sonicao

ou
Homogeneizao

Figura 10: Processo de elaborao de lipossomas atravs de duas tcnica Ultra-som e


homogeneizador ultra-turrax.
Fonte:Imagem do autor, 2011.

5.2.5 Liofilizao do material encapsulado


Foi realizada liofilizao do material encapsulado para melhor conservao e
aplicao em alimentos. Como tambm para anlise em Microscopio eletrnico de
Varredura.
5.2.6 Tamanho mdio das partculas e Caracterizao Morfolgica da Spirulina
nanoencapsulada

5.2.6.1 Espalhamento dinmico de luz-EDL


Para a determinao do tamanho mdio das partculas, foi empregado o mtodo
recomendado por Mertins (2008) que utiliza equipamento com comprimento de onda
26

de 632,8 nm, modelo 127 da Spectra-physics acoplado a um gonimetro BI-200M


verso 2.0 e com correlador digital BI-9000AT da Brookheaven Instruments. Os
lipossomas foram filtrados em filtros de 0,45m, e utilizaram se duas gotas de amostra
dissolvidas em 8 ml de tampo fosfato pH 7,0, 0,2M, para a realizao da anlise
(Figura 11).
2
1 3

Figura 11: Processo de anlise de Espalhamento dinmico de luz.1 etapa: Filtragem dos
lipossomas;2 o laser incide sobre a amostra localizada no centro do gonimetro. A luz
espalhada em determinado ngulo e coletada e amplificada pela fotomultiplicadora que envia
dados ao computador.
Fonte:imagens do autor,2011.

5.2.6.2 Microscopia eletrnica de varredura-MEV


A microscopia eletrnica de varredura (MEV) foi utilizada para a
caracterizao da superfcie das nanoestruturas lipdicas, a fim de se
observarem evidncias sobre a disperso das nanopartculas na matriz lipdica.
As imagens foram obtidas em um microscpio Shimadzu, modelo SSX-550,
que possui vcuo e EDS(espalhamento dinmico de luz), acoplados (Figura
12).

A B C
Figura 12: Microscpio eletrnico de varredura.Etapa A:Preparo da amostra-;Etapa B: os substratos foram
presos ao porta-amostra do MEV utilizando-se uma fita de carbono e as amostras foram, ento,
metalizadas com ouro; Etapa C: Amostras acopladas no equipamento Sanyu Electron, modelo Quick
Coater SC-701 eDados copilados no computador. Fonte: imagens do autor, 2011.
27

5.2.7 Ensaio biolgico


O ensaio biolgico foi conduzido no Laboratrio de Experimentao Animal, da
rea de alimentos, do Centro de Cincias Qumicas, Farmacuticas e de Alimentos, da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
O protocolo para a conduo do ensaio biolgico, nmero:
23110.000978/2010-91 (anexo 1), foi aprovado pela Comisso de tica e
Experimentao Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas.

5.2.8 Preparo da Spirulina LEB-18 em tamanho nanomtrico


A Spirulina LEB-18 com dimetro 200 micrometros foi dissolvida em soluo
tampo fosfato pH 7,0 e 0,2M, de acordo com Malheiros (2010) com modificaes,
posteriormente foi realizada agitao em homogeneizador Ultra-turrax 10000rpm por
20 minutos, at uniformizao das partculas em tamanho nano, de acordo com a
figura 13. Esta amostra foi utilizada para preparao de dietas para avaliao biologica
in vivo).

Aquecimento
Banho-Maria

Dissoluo em tampo fosfato


Spirulina micromtrica

Agitao e
Homogeneizao
das particulas

Spirulina em tamanho
nanomtrico

Figura 13: Processo de elaborao da spirulina em tamanho nanomtrico.


Fonte: Imagens do autor, 2011.

5.2.9 Elaborao das Dietas


As dietas foram elaboradas conforme AIN-93 (Instituto Americano de
Nutrio/American Institute of Nutrition), sendo preparadas quatro dietas: uma dieta
28

controle denominada casena, uma aproteica (sem protena) e duas dietas estudo,
designadas Spirulina micro e Spirulina nano, de acordo com a Tabela 1 . Foram
adicionados ingredientes como leo de soja, sacarose, amido de milho entre outros
(REEVES, 1993), para confeco destas dietas.

5.2.9.1 Peletizao
Para administrao das dietas aos animais, as mesmas foram peletizadas. As
misturas dos ingredientes foi umedecida com gel de amido a 8%, ate atingir uma
textura ideal para peletizao manual, sendo os peletes secos em estufa com
circulao de ar a 50C por 24 horas (SOUZA-SOARES et al., 2009).

Tabela 1: Formulao das dietas experimentais administradas durante 15 dias a


ratos fmeas da cepa Wistar/UFPel (g.Kg-1).
Ingredientes Caseina Aproteica Spirulina nano Spirulina

Spirulina micro _ _ - 200

Spirulina nano - - 80 -

Caseina 160 _ 80 -

Oleo de soja 70 70 70 70

Mistura mineral 35 35 35 35

Mistura vitaminica 10 10 10 10

L-cistina 3,0 3,0 3,0 3,0

Bitartarato de Colina 2,5 2,5 2,5 2,5

Sacarose 100 100 100 100

Fibra de trigo 50 50 50 50

Amido de milho 569,5 729,5 569,5 529,5


29

5.2.9.2 Animais
No ensaio foram utilizados 24 ratos fmeas(Rattus norvegicus) (figura 14),
recm desmamados (21 dias), da cepa Wistar/ UFPEL, com peso inicial mdio 58,16g
divididos aleatoriamente em blocos de 6 ratos para cada dieta. Os animais foram
fornecidos pelo Biotrio Central da Universidade Federal de Pelotas.
Os animais foram mantidos, em gaiolas metablicas individuais, comedouro
embutido em V. A pesquisa teve durao de 15 dias, sendo 4 dias de adaptao as
condies ambientais, manteve-se o ambiente com temperatura de 252C e ciclo de
iluminao claro-escuro de 12 horas, aps realizou-se a verificao do Quociente de
eficiencia liquida de proteina (NPR). Durante todo o experimento os animais
receberam gua ad libitum. O consumo de dieta e o peso dos animais foram
monitorados duas vezes por semana. Ao final do perodo de adaptao, os animais
foram pesados e distribudos em quatro grupos de 6, mantendo-se o peso mdio dos
grupos aproximadamente 56 g de maneira que a diferena entre os mesmos fosse a
mnima possvel.
No decorrer do experimento foram realizadas, diariamente, pesagens das
dietas remanescentes, com o objetivo de se determinar a quantidade diria de ingesta
por animal. O peso corporal dos animais foi registrado a cada 3 dias para avaliao do
ganho de peso semanal dos mesmos. Estes dados, alm de expressarem o ganho de
peso e a ingesto de dieta por animal, foram utilizados para determinar o coeficiente
de eficincia alimentar (CEA), calculado pela razo entre o ganho de peso e a
quantidade total de dieta ingerida durante o experimento.

5.2.9.3 Eutansia, coleta de sangue e figados


Ao trmino do perodo experimental, aps jejum de 12 horas, as ratas foram
pesadas, sendo eutanasiadas por decapitao. As alquotas de sangue foram
imediatamente depositadas em fitas especiais para dosagem de glicose e lidas em
equipamento Accu-Chek Advantage II (Roche).
No restante do sangue foram realizadas as analises:
a) 1mL colocado em eppendorfs contendo EDTA para anlises do hemograma;
b) o restante do sangue coletado foi centrifugado a 1000g, por 15min. a 4C,
separando-se o soro o qual foi congelado (-20C) para anlises
posteriores(minerais, HDL, LDL, VLDL,colesterol e triacilglicerol). As
determinaes foram realizadas em equipamento fotmetro Biosystems BTS-
310 semi-automtico com emprego dos reativos Biosystems reagents and
instruments.
30

Foi realizado um corte ventral longitudinal nos animais para inspeo dos
rgos e posteriormente retirado dos fgados.
Os fgados foram lavados em soluo fisiolgica gelada, enxutos em papel
filtro, pesados em balana analtica (capacidade de 200g e preciso de 0,01g) e
acondicionados em funo das anlises subseqentes. Parte do fgado foi
acondicionada em congelamento a 18C para anlise de lipdios e o lbulo direito
colocado, em soluo de formol tamponada, para posteriores anlises
histopatolgicas.
As carcaas e o restante do material biolgico foram acondicionados em
embalagens especias e destinados pelo biotrio a firma especializada .

5.2.9.4 Medidas antopomtricas


Posteriormente a eutansia, antes da abertura do abdmen dos animais, foram
realizadas as medidas do comprimento entre os membros torcicos, e circunferncia
do abdmen de cada animal, com o auxlio de fita mtrica. As medidas foram
expressas em centmetros.

5.2.10 Avaliaes dos fgados

5.2.10.1 Determinao de lipdios


Foram pesadas amostras de 3g dos fgados, originadas de um Pool de cada
grupo. A determinao foi realizada, em triplicata, atravs do mtodo de Bligh & Dyer
(1959) adaptado por Arajo (2009). Os resultados foram expressos em % lipdios.

5.2.10.2 Avaliaes histopatolgicas


Os figados foram retirados fragmentos includos em parafina, para obteno dos
cortes histolgicos com 5m de espessura, os quais foram corados por hematoxilina-
eosina (HE) e Gram histolgico (Behner; Tolosa; Freitas Neto, 1976). Os
procedimentos foram realizados pela equipe do laboratrio Regional de Diagnostico
da Faculdade de Medicina Veterinria da UFPEL, sendo as amostras avaliadas sem o
conhecimento prvio dos grupos aos quais pertenciam os animais . Atravs das
observaes histopatolgicas buscou-se avaliar: a) integridade ou leso dos diferentes
rgos; b) presena de qualquer alterao, caracterizando o processo, a distribuio e
a extenso; c) presena de degenerao gordurosa, heptica (esteatose).
31

5.2.11 Avaliao das fezes


5.2.11 .1 Determinao de lipdios
As fezes secas foram modas em almofariz, com ajuda de pistilo, e alquotas de
3g das fezes de cada amostra foram pesadas. A determinao foi realizada, em
triplicata, atravs do mtodo de Bligh & Dyer (1959) adaptado por Arajo (2009). Os
resultados foram expressos em % lipdios.

5.2.12 Avaliaes bioqumicas


As determinaes de colesterol total, triacilglicerois, VLDL, HDL,LDL e minerais no
soro foram realizadas em equipamento fotmetro Biosystems BTS-310 semi-
automtico com emprego dos reativos Biosystems reagents and instruments.

5.2.13 Avaliaes hematolgicas


O sangue de cada animal com EDTA foi imediatamente encaminhado ao
Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Veterinrio da Universidade Federal de
Pelotas, para realizao dos hemogramas em contador hematolgico automtico
(POCH-100iVDiFF, SYSMEX).

5.3 Anlises estatsticas

Os resultados foram analisados com o auxlio do programa Statistica, verso 7.0


(STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de Tukey (p
< 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.
32

Captulo III Desenvolvimento do trabalho


33

Artigo1: PROCESSO DE NANOENCAPSULAO DE Spirulina LEB-18 EM

LIPOSSOMAS

PROCESS OF NANOENCAPSULATION OF Spirulina LEB-18 IN LIPOSOMES

NANOENCAPSULAO DE SPIRULINA EM LIPOSSOMAS

Adriana Rodrigues MACHADO*

Leticia Marques de ASSIS*

Jorge Alberto Vieira COSTA*

Eliana BADIALE-FURLONG*

Leonor Almeida de SOUZA-SOARES*

Amanda de Souza da MOTTA**

Yasmine Miguel Serafini MICHELETTO***

*Escola de Qumica e Alimentos Universidade Federal do Rio Grande FURG CP

474 96201-900 Rio Grande do Sul RS Brasil

adriana.rodriguesmachado@yahoo.com.br

**Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, do Instituto de Cincias

Bsicas da Sade Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS 91501-

970 Rio Grande do Sul RS Brasil

***Departamento de Qumica Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS

CP 15003 91501-970 Rio Grande do Sul RS Brasil


34

RESUMO

A encapsulao, na indstria de alimentos, um processo no qual um ou mais

ingredientes ou aditivos (que constituem o ncleo) so revestidos por uma cpsula

comestvel. Dentre as formas de encapsulao de ingredientes alimentcios est o uso

dos lipossomas, que consistem em uma espcie de vesculas microscpicas lipdicas,

onde devido poro hidroflica e lipoflica dos seus constituintes, podem encapsular

substncias de diversas naturezas, sendo que as substncias hidroflicas ficam no

compartimento aquoso e as lipoflicas inseridas ou adsorvidas na membrana. O

objetivo do presente trabalho foi aplicar dois tratamentos distintos, sonicao e

homogeneizao, no processo de encapsulao de uma fonte protica, como a

cianobactria Spirulina LEB-18, com a finalidade de diminuir e padronizar o tamanho

dos lipossomas formados. Para a encapsulao da Spirulina, os lipossomas foram

preparados utilizando lecitina de soja parcialmente purificada, atravs da metodologia

de hidratao do filme lpidico, sendo submetidos ao banho ultra-snico 60C por 30

minutos e ao homogeneizador a 10.000 rpm por 15 minutos separadamente. Foi

determinado o tamanho mdio e morfologia das partculas utilizando a tcnica de

espalhamento dinmico de luz e microscopia eletrnica de varredura,

respectivamente. O tipo de processo aplicado no diferiu para a obteno de

partculas do tamanho nanomtrio, no entanto, os lipossomas submetidos ao

homogeneizador obtiveram tamanho mdio maior comparado aos lipossomas que

foram submetidos a sonicao. Morfologicamente os lipossomas apresentaram-se

mais uniformes quando submetidos ao homogeneizador.

Palavras-chave: spirulina, nanoencapsulao, lipossoma, sonicao e

homogeneizao
35

INTRODUO

A nanotecnologia focada na caracterizao, fabricao, manipulao e aplicao

de estruturas biolgicas e no biolgicas 1 na escala nanomtrica. O prefixo nano

est relacionado a uma escala de medida em que um nanmetro representa um

bilionsimo do metro ou um milionsimo de milmetros. Estruturas nesta escala

apresentam propriedades funcionais nicas no encontradas na escala macro. 2,3

Na indstria de alimentos, vrias novas aplicaes da nanotecnologia tornaram-se

aparentes, incluindo o uso de nanopartculas, como os lipossomas4, que podem ser

utilizados para a encapsulao de ingredientes alimentcios. A encapsulao envolve

a incorporao, absoro ou disperso de compostos slidos, lquidos ou gasosos

dentro, ou em vesculas pequenas, que podem chegar escala nanomtrica. As

combinaes de compostos incorporados podem ser protegidas contra degradao,

melhorar a estabilidade e solubilidade (e.x, solubilizao de componentes hidroflicos

em matrizes hidrofbicas e vice-versa).5,6 O ncleo o local onde se encontra o

componente ativo, e este pode ser composto de um ou mais ingredientes. A reteno

desses ncleos regida pela sua funcionalidade qumica, solubilidade, polaridade e

volatilidade.7 O principal objetivo da encapsulao proteger o material do ncleo de

condies ambientais adversas, como efeito indesejvel da luz, umidade e oxignio,

alm de contribuir para o aumento da vida de prateleira do produto e promover a

liberao controlada dos encapsulados. 8

Segundo Azeredo9 a escolha do mtodo de encapsulao depende de uma srie de

fatores, como: tamanho de partculas requerido, propriedades fsicas e qumicas do

ncleo e da parede, aplicao do produto final, mecanismos desejados de liberao,

escala de produo e custo. Existem vrios mtodos que podem ser utilizados para
36

encapsulao, como: atomizao, coacervao, extruso, secagem em tambor,

incluso molecular, leito fluidizado, liofilizao e incluso em lipossomas.

Os lipossomas consistem em vesculas nicas ou em multicamadas que envolvem

uma fase aquosa dentro de uma membrana de fosfolipdios. Essas vesculas se

formam espontaneamente quando fosfolipdios so dispersos em um meio aquoso.

Uma poro do meio aquoso torna-se fechada na membrana lipdica que serve ento

como uma partcula de liberao controlada para o material ativo disperso na fase

aquosa ou lipdica da partcula.10 As fosfatidilcolinas so as mais empregadas em

estudos de formulao de lipossomas, pois apresentam grande estabilidade frente a

variaes de pH ou da concentrao de sal do meio, 11 alm de ser biocompatvel,

biodegradvel e ter ao detergente. Devido presena da fase lipdica e aquosa na

estrutura das vesculas, os lipossomas podem ser utilizados na encapsulao, entrega

e liberao de materiais solveis em gua, lipossolvel e anfiflicos. 12,13

Os mtodos de preparao de lipossomas so inmeros e levam a formao de

diferentes tipos de vesculas em relao ao seu tamanho, sua estruturao,

capacidade de encapsulamento e tempo de reteno de substncias, nmero de

lamelas e etc. A elaborao de lipossomas requer a aplicao de energia para a

disperso das molculas dos lipdios em um meio aquoso, e o objetivo principal desse

processo a obteno de vesculas com o tamanho certo, polidisperso aceitvel,

elasticidade, estrutura e a eficincia de encapsulao. 13,14 Normalmente os lipossomas

obtidos pelo processo clssico, ou seja, atravs do mtodo de hidratao do filme

lipdico15 so mal formados e apresentam uma enorme variao de tamanho,

parmetros que limitam a sua aplicao tanto na pesquisa como na indstria.

Agentes bioativos encapsulados em lipossomas podem ser protegidos contra a

digesto no estmago, e mostram nveis significativos de absoro no trato

gastrointestinal, levando ao aumento da bioatividade e biodisponibilidade 16, alm de


37

serem sistemas com elevada biocompatibilidade e versatilidade. Neste sentido, os

lipossomas podem ser utilizados para a encapsulao da Spirulina.

A Spirulina LEB-18 uma cianobactria utilizada como alimento pelo homem devido

a sua composio qumica, apresentando elevada qualidade e quantidade protica,

aminocidos essenciais, minerais, cidos graxos poliinsaturados e vitaminas.

considerada um micro-organismo GRAS (Generally Recognized as Safe), no

apresentando toxicidade, sendo permitida como suplemento alimentar pela FDA (Food

and Drug Administration) o que garante seu uso como alimento sem riscos

sade.17,18 Vrias pesquisas19,20,21,22,23 relatam a importncia nutricional e funcional de

compostos presentes na Spirulina . A Spirulina foi utilizada nestes processos de

encapsulao como ncleo. As vantagens da encapsulao da Spirulina LEB-18 em

lipossomas consistem em mascarar compostos de sabor indesejvel, retardar

alteraes que podem resultar em perda de aroma, alterao de cor ou perda do valor

nutricional, quando da aplicao em formulaes, assim como, tambm permitir a

liberao diretamente no organismo. Existem diversas substncias que vem sendo

encapsuladas como leo essencial de laranja e extratos de aa 23b.

O objetivo no presente trabalho foi aplicar dois tratamentos distintos no processo de

encapsulao de uma fonte protica, a cianobactria Spirulina LEB-18, com a

finalidade de diminuir e padronizar o tamanho dos lipossomas, formados pela

metodologia de hidratao do filme lipdico.

MATERIAL E MTODOS

Condies de obteno da Spirulina

Foi utilizada a cianobactria Spirulina cepa LEB-18 isolada da lagoa Mangueira 24 ,

Santa Vitoria do Palmar, RS , Brasil , e suplementada com 20% (v/v) do meio

Zarrouk25, para a manuteno da produo do inculo e biomassa.


38

Purificao da lecitina de soja

A lecitina de soja comercial foi adquirida em forma de p, e sua purificao foi

realizada conforme Mertins26. Primeiramente dissolveu-se 50 g da mesma em 250 mL

de acetato de etila (Synth ). Em seguida, lentamente e sob agitao, foram

adicionados 10 mL de gua destilada, ocorrendo a formao de duas fases. O

sobrenadante foi separado da fase inferior e descartado. A fase inferior, com aspecto

de gel, foi dispersa em 150 mL de acetona (Synth ), formando aglomerados que foram

triturados utilizando-se um basto de vidro. A seguir, a acetona foi separada por

decantao e uma nova poro de 250 mL de acetona foi adicionada, repetindo-se o

processo de triturao. O precipitado foi filtrado sob vcuo e seco em estufa em

aproximadamente 60 C e resfriado em dessecador, fornecendo uma massa final de

40g, obtendo-se a fosfatidilcolina parcialmente purificada.

Encapsulao da Spirulina

O processo de encapsulao foi realizado de acordo com a metodologia de

hidratao do filme lipdico, segundo Malheiros10, com modificaes. .A fonte de lipdios

utilizada para a elaborao dos lipossomas foi a fosfatidilcolina purificada a partir da

lecitina de soja. Primeiramente, 1g da fosfatidilcolina foi dissolvida em 10 ml de

clorofrmio (Synth) em balo de fundo redondo, aps sua completa disperso, o

solvente orgnico foi removido em evaporador rotatrio at que fosse observado um

filme lipdico depositado nas paredes do balo. Os traos de solvente orgnico foram

removidos atravs da estocagem do balo por 18h em dessecador vcuo. O filme

lipdico resultante foi disperso pela adio de 20 ml de tampo fosfato pH 7,0, 0,2M

contendo 2 g de Spirulina LEB-18 dissolvida. A mistura contida no balo foi submetida

temperatura excedente a fase de transio (60 C). Aps os lipossomas foram


39

submetidos a tratamentos distintos, utilizando banho ultrasnico (40 kHz, Unique USC

700) a 60 C durante 30 min ou homogeneizao (ultra-turrax T25 digital) a 10.000

rpm durante 15 min.

Eficincia de encapsulao

A eficincia de encapsulao, ou seja, a massa de Spirulina encapsulada no

lipossoma foi avaliada de modo indireto. Primeiramente colocou-se, em tubos de

centrifuga 1 mL dos lipossomas e 2 mL de acetona, devido a lecitina ser insolvel

neste solvente. As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 min 3 C,

obtendo-se duas fases. O sobrenadante, contendo a amostra que no encapsulou foi

retirado e colocado em estufa 36 C at completa evaporao do solvente. No

material seco remanescente foi realizada a anlise de protena bruta, determinando

indiretamente a quantidade de amostra no encapsulada que se solubilizou na

acetona. A anlise de protena foi realizada atravs do mtodo de Kjeldahl clssico 27

(Instituto Adolfo Lutz, 2008), sendo os resultados expressos em % (m/m) de protena,

utilizando fator de converso de 6,25. Para o clculo do teor protico dentro da

cpsula utilizou-se a massa inicial de Spirulina adicionada aos lipossomas, subtrada

do teor protico fora da cpsula. A umidade da amostra foi determinada pelo mtodo

gravimtrico de secagem em estufa 105 oC at peso constante, sendo os resultados

expressos em % de umidade 27 (Instituto Adolfo Lutz, 2008). A eficincia da

encapsulao (EE) foi calculada de acordo com a Equao 1.

Tamanho mdio das partculas

Para a determinao do tamanho mdio das partculas foi utiliza a tcnica do

espalhamento dinmico de luz28 , atravs do equipamento com comprimento de onda

de 632,8 nm, modelo 127 da Spectra-physics acoplado a um gonimetro BI-200M

verso 2.0 e com correlador digital BI-9000AT da Brookheaven Instruments. Os

lipossomas foram filtrados em filtros de 0,45 m, e utilizaram-se duas gotas de


40

amostra dissolvido em 8 ml de tampo fosfato pH 7,0, 0,2M para a realizao das

anlises.

Liofilizao do material encapsulado

As amostras foram submetidas liofilizao em liofilizador de bancada modelo FD

5505, utilizando temperatura de -50 C e presso de 500 Hg por 24 h, a fim de se

obter um p seco para a anlise de microscopia eletrnica de varredura.

Anteriormente a este processo as amostras foram congeladas em ultra-frezer a 80

C por 48 h.

Microscopia eletrnica de varredura

Para a anlise microscpica os lipossomas liofilizados foram ressuspendidos em

metanol (Synth), tratados no banho ultra-snico durante 20 min e depositados sobre

substrato de silcio. Os substratos foram presos ao porta-amostra do microscpio

utilizando-se uma fita de carbono, sendo ento metalizadas com ouro por 3 min e

corrente de 5 mA, em equipamento Sanyu Electron, modelo Quick Coater SC-701. As

imagens foram obtidas em um microscpio Shimadzu, modelo SSX-550, que possui

vcuo e EDS(Espalhamento dinmico de luz) acoplados.

Anlise estatstica

Todas as determinaes foram realizadas em triplicata e os resultados obtidos

foram analisados estatisticamente atravs de ANOVA e Teste de Tukey, ao nvel de

5% de significncia, com auxilio do programa STATISTIC, verso 7.0.


41

RESULTADOS E DISCUSSO

O teor protico da Spirulina utilizada para a encapsulao foi de 60,36% em base

seca e teor de umidade de 11,48%. Na Figura 1 esto apresentados os valores do

teor protico total dos lipossomas de Spirulina, assim como dos sobrenadantes

contendo Spirulina no encapsulada e indiretamente o teor de Spirulina dentro da

cpsula, que passaram pelo processo de homogeneizao e sonicao. A eficincia

de encapsulao foi determinada de acordo com a equao 1.

Os lipossomas submetidos a homogeneizao apresentaram maior eficincia de

encapsulao (90%), comparado aos lipossomas submetidos a sonicao (79%).

Morais29, utilizando o mtodo de evaporao de fase reversa para a elaborao dos

lipossomas de hidrolisados de casena, obteve eficincia de encapsulao entre 56 e

62%, determinado por mtodo indireto de centrifugaes consecutivas. Were,30

utilizando o mtodo de hidratao do filme lipdico e sonicao para a encapsulao

de nisina, um peptdio antimicrobiano, obteve eficincia de encapsulao superior a

54%. Nas condies aplicadas neste estudo, considera-se satisfatrio os percentuais

obtidos para a eficincia de encapsulao dos lipossomas que foram homogeneizados

e sonicados. O uso dos lipossomas foi investigado para a encapsulao de

protenas,29,31 e outros ingredientes alimentares, 32,33 e diversos mtodos para a

elaborao tem sido propostos na literatura. Dependendo do mtodo e das

caractersticas do lipossoma e da amostra, vrios tipos de estruturas podem ser

elaborados, com caractersticas e taxas de encapsulao distintas.

O tamanho mdio e a polidisperso dos lipossomas que passaram pelo processo

de homogeneizao e sonicao esto apresentados na Tabela 1.

De acordo com a Tabela 1, a aplicao do homogeneizador ou da sonicao no

diferiu na obteno de lipossomas na escala nanomtrica, no entanto, pode-se

observar que os lipossomas que passaram pelo processo de sonicao, apresentaram

tamanho mdio menor (279,53nm) comparado aos lipossomas que foram submetidos
42

a homogeneizao (303,97nm). A polidisperso indica a extenso da variao de

tamanho dos lipossomas.

A escolha pelo mtodo de hidratao do filme lipdico para a elaborao dos

lipossomas ocorreu em funo deste ser um mtodo simples e de baixo custo, que

no requer equipamentos especializados, sendo muito eficaz em escala laboratorial, 35

no entanto, sabe-se que este mtodo produz vesculas multilamelares, sendo

necessrio um tratamento posterior para a uniformizao do tamanho e da estrutura

da partcula.36,37 Dentre as alternativas utilizadas para solucionar o problema da

elevada distribuio de tamanho e tipos de lipossomas obtidos, est o uso da

sonicao e ultra-agitao em homogeneizadores. Vrios autores 38,39,40 utilizam a

sonicao como tratamento posterior ao mtodo de hidratao do filme lipdico para

possvel aplicao em formulaes alimentcias, sendo este procedimento mais

comum que o uso de homogeneizadores, no entanto, apesar deste produzir vesculas

menores, apresenta desvantagens como baixa taxa de encapsulamento e pouco

adequado a produo industrial.

As micrografias da Spirulina LEB -18 e dos lipossomas de Spirulina obtidos pela

utilizao do homogeneizador e sonicao esto apresentadas na Figura 2.

Atravs das fotomicrografias obtidas observa-se que a Spirulina in natura apresentou

forma irregular e tamanho na escala micromtrica. Os lipossomas submetidos a

sonicao tambm apresentaram forma irregular, no entanto, os lipossomas que foram

homogeneizados apresentaram formato mais regular, e aparentemente uma estrutura

cilndrica organizada. A microscopia eletrnica de varredura foi utilizada para a

caracterizao da superfcie das nanoestruturas lipdicas, a fim de se observarem

evidncias sobre a disperso das nanopartculas na matriz lipdica. Barbosa,41 na

anlise microscpica das lipoesferas contendo hidrolisado de casena, elaborado pelo

mtodo de evaporao de fase reversa e tratamento posterior em homogeneizador,


43

revelou morfologia esfrica das mesmas, no entanto, tamanho de partcula em torno

de 3,8 m.

CONCLUSES

A encapsulao de Spirulina em lipossomas, utilizando o mtodo de hidratao do

filme lipdico, associado homogeneizao ou sonicao como tratamentos

complementares, mostrou-se eficiente para elaborao de lipoesferas nanomtricas.

Embora, com o processo de homogeneizao, obteve-se tamanho mdio maior das

partculas, morfologicamente mais uniformes, houve maior eficincia de encapsulao

comparado ao processo de sonicao. Portanto, a fosfatidilcolina parcialmente

purificada uma possibilidade vivel na aplicao como material de parede para a

formao de lipossomas de Spirulina visto que o material obtido apresentou-se na

escala nanomtrica e possivelmente encapsulado.

AGRADECIMENTOS: CAPES, UFRGS, UFPEL.


44

ABSTRACT

Encapsulation in the food industry is a process in which one or more ingredients or

additives (core) are coated with an edible capsule. Among the forms of encapsulation

of food ingredients is the use of liposomes, consisting of a sort of microscopic lipid

vesicles, where due to the lipophilic and hydrophilic portion of its constituents, can

encapsulate substances of various natures, and the hydrophilic substances stay in the

compartment aqueous and lipophilic inserted or adsorbed on the membrane. The aim

of the work was to apply two different treatments, sonication and homogenization, in

the encapsulation of a protein source, such as the cyanobacterium Spirulina platensis,

formed out by the thin-film hydration method. Liposomes were prepared using purified

soybean phosphatidylcholine and sonicated at 60 C for 30 min or homogenized at

10.000 rpm for 15 min. It was determined the average size, encapsulation efficiency

and particle morphology. The type of process applied did not differ for obtaining particle

size nanometric, however, liposomes subjected to homogenization medium size had

increased compared to liposomes that were subjected to sonication. Morphologically,

the liposomes were more uniform when subjected to homogenizer.

Keywords: Spirulina, nanoencapsulation, liposome, sonication, homogenization


45

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48

Tabela 1. Tamanho mdio e polidisperso da Spirulina em lipossomas elaborados

utilizando homogeneizao e sonicao

Amostra Determinaes

Tamanho mdio (nm) Polidisperso

Lipossomas homogeneizados 303,97a 0,248a

(Ultra-turrax)**

Lipossomas sonicados 279,53b 0,291a

(Ultra-Som)*

Letras iguais na mesma coluna indicam que no h diferena significativa pelo teste de Tukey

(<0,05); *Sp.Enc.US: Spirulina encapsulada Ultra-som; **Sp.Enc.UT: Spirulina encapsulada

Ultra-turrax.

Figura 1. Eficincia da encapsulao expressa atravs do teor protico dos lipossomas

de Spirulina que passaram pelo processo de homogeneizao e sonicao.


49

EE (%) = protena total da Spirulina Spirulina livre x 100

protena total da Spirulina

Equao 1. Equao utilizada para o clculo da eficincia da encapsulao (EE)


50

B C

Figura 2. Micrografia eletrnica de varredura da Spirulina in natura (A); Lipossomas de

Spirulina submetidos ao homogeneizador (B); Lipossomas de Spirulina submetidos a

sonicao (C).
51

Artigo 2: Avaliaes biolgicas, nutricionais e bioquimicas em ratas wistar


alimentadas com dietas contendo Spirulina em tamanho micro e nanomtrica

Biological assessments, Nutritional Biochemistry and Wistar rats fed diets


containing Spirulina micro and at a nano size

Adriana Rodrigues Machado, Maira Peres Mendes, Bruna Del Sacramento Behling,
Rosane da Silva Rodrigues, Mirian Ribeiro Galvo Machado, Leonor de Almeida
Souza-Soares

Resumo

A Spirulina tem sido utilizada para diversos fins dentre eles o enriquecimento protico
de alimentos. O objetivo do estudo foi avaliar as respostas biolgicas (bioqumicas e
nutricionais) em ratas cepa wistar/UFPEL alimentadas com dietas contendo Spirulina
em tamanhos micromtrico e nanomtricos, provenientes da biomassa da micoalga
Spirulina (LEB cepa-18). Foram elaboradas 4 dietas, sendo dieta controle (caseina
C), aprotica (A) Spirulina nano (Sp nano) e Spirulina micro (Sp micro). Realizaram-se
avaliaes biolgicas, nutricionas e bioqumicas quanto aos ndices de glicemia no
sangue e minerais no soro. A composio das dietas contendo Spirulina diferiram
estatisticamente das dietas casena e aprotica, com relao aos teores de umidade e
cinzas. Em relao dieta contendo a Spirulina nano seu teor protico diferiu,
significativamente, das demais dietas. J o teor lipdico das dietas avaliadas no
diferiram significativamente. Com relao ao peso crporeo no houve diferena
significativa atravs da ingesto de dieta spirulina.O coeficiente de eficincia alimentar
para todos os grupos avaliados no obteve diferena estatistica. As dietas spirulina
nos tamanho micro e nanomtrico no interferiram nas medidas antopomtricas de
ratas wistar, e glicemia do sangue. Nem os teores de Ca e Fe no soro com ligeira
reduo de Mg e P, mas dentro de valores considerados normais para espcie.

Palavras-chaves: microalga, nano, soro e CEA


52

Abstract

Spirulina has been used for several purposes amongst them the protein erichment of
foods. The aim of this study was to evaluate the biological( biochemical and nutritional)
in wistar strain rats/UFPEL fed diets containing Spirulina in micrometer and nanometer
Sizes from the biomass of spirulina microalga (strain LEB 18). Four diets were
prepared , and control diet( casein(C)), aproteic(A), spirulina nano(nano Sp) and micro
Spirulina(micro Sp).Evaluations were performed biological and
biochemical nutricionasand index of blood glucose and minerals in the serum. The
composition of the diets containing Spirulina diets differedsignificantly from the casein
and aproteic with respect to moisture and ash. Regarding
diet containing Spirulina nano its protein content differed significantly from the
other diets. Since the lipid content of the diets were not affected significantly. With
respect to body weight did not differ by intake of dietary spirulina.The food efficiency
ratio for all groups did not achieve statistical difference. Diets spirulina in micro
and nano size did not affect the measurements of anthropometric variables Wistar rats,
and blood glucose. Neither the Ca and Fe with a slight decrease in serum Mg
and P, but within normal limits for the species.

Key words: microalgae, nano, serum and CEA


53

Introduo

Spirulina LEB-18 uma microalga com composio apropriada para uso como
complemento alimentar, podendo ser empregada no combate desnutrio (FOX,
1996). Em sua composio destacam-se os altos teores de protenas (64 - 74%),
cidos graxos poliinsaturados e vitaminas (COHEN, 1997), alm de compostos
antioxidantes (COLLA et. al., 2007). Esta microalga classificada como GRAS
(Generally Recognized as Safe) pelo FDA (Food and Drug Administration), o que
garante seu uso como alimento sem riscos sade. No Brasil, a Spirulina tem sido
empregada, basicamente, na produo de cpsulas destinada dieta de
emagrecimento. De acordo com os fabricantes, o efeito de controlar o apetite ocorre
se ingerida uma ou duas horas antes das refeies, devido presena dos
aminocidos essenciais em quantidades balanceadas, bem como a sua composio
rica em protenas (HENRIKSON, 1994). Tem sido utilizada para diversos fins como: o
enriquecimento protico de alimentos e a elaborao de produto liquidos e secos
base de Spirulina LEB-18, com o propsito de servir de alimento para viagens
espaciais, levando em considerao seu potencial nutricional, visto que rica em
protenas e no possui substncias txicas (HENRIKSON, 1994). Muitos estudos
comprovam estas propriedades, como ensaios biolgicos em ratos. Na literatura,
observa-se que a espcie Rattus norvegicus a mais utilizada em pesquisas de novas
fontes alimentares (HARKNESS E WAGNER, 1993). Alm disso, os ratos apresentam
gentica e caractersticas endcrinas semelhantes aos humanos; alta prolificidade;
tempo de vida curto, propiciando ao pesquisador a obteno de respostas rpidas em
curto tempo; fcil manipulao; controle da sade; padronizao e controle rigoroso
das condies ambientais nas quais os animais esto inseridos, alm da convenincia
de disponibilidade de local e exemplares para realizao do experimento (HARKNESS
E WAGNER, 1993).
A biomassa de Spirulina indicada como auxiliar em dietas que requerem
diminuio da ingesto calrica, por conter substncias que parecem prolongar o
tempo de trnsito gstrico e produzir sensao de saciedade. (ARAJO,
FACCHINETTI e SANTOS.,2003 citando GUGLIELMI, RIPPKA, TANDEAU ,1993).O
trabalho de Becker et al. (1986) descreve um experimento com humanos com o
objetivo de estabelecer uma relao entre o consumo desta biomassa e a diminuio
do peso corporal. Atualmente, cerca de vinte e duas companhias no mundo produzem
biomassa de spirulina, e seu principal destino so lojas de produtos naturais e
farmcias, onde a biomassa seca vendida como suplemento alimentar, alm da
54

alimentao animal e extrao de pigmentos para uso em alimentos no Japo


(ARAJO, FACCHINETTI e SANTOS.,2003 citando BELAY et.al.,1997).
No entanto, esta biomassa comercializada sem que sejam consideradas as
condies de cultivo nem a espcie de cianobactria. possvel que fatores como
intensidade de luz, temperatura e composio do meio de cultivo, que podem variar de
uma regio produtora para outra, alm do estgio de crescimento celular, possam
resultar no acmulo de diferentes metablitos, e proporcionar atividades biolgicas
distintas em funo de tais condies (ARAJO, FACCHINETTI e SANTOS, 2003). O
objetivo do estudo foi avaliar as respostas biolgicas (bioqumicas e nutricionais )em
ratas cepa wistar/UFPEL alimentadas com dietas contendo Spirulina em tamanhos
micro e nanomtrico, provenientes da biomassa da micoalga Spirulina (LEB cepa-
18).

Material e Mtodos
Material
A biomassa da microalga Spirulina foi fornecida pelo Laboratrio de Engenharia
Bioqumica (LEB cepa-18),isolada da lagoa Mangueira,RS, Brasil (MORAIS et al ,
2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (COSTA,COLLA, DUARTE- FILHO,
2004).

A Spirulina LEB-18 foi triturada em moinho de bolas (Modelo Q298-2) e peneirada


em agitador de peneiras, alcanando uma granulometria de 200m. Aps foi
acondicionada a vcuo em embalagens de polietileno de alta densidade (PEAD), com
capacidade para 500g, e armazenada sob refrigerao temperatura de 5C.

Ingredientes para elaborao das dietas


As dietas foram formuladas para suprir as necessidade bsicas de um rato na
fase de crescimento, sendo utilizadas as seguintes fontes de nutrientes: Casena
comercial(SIGMA), L-cistina, cloridrato de colina, minerais, mistura vitamnica
(manipulao farmacutica), leo de soja, sacarose, fibra de trigo e amido de milho,
conforme a tabela 1. A mistura de minerais (REEVES et al., 1993) foi obtida atravs da
pesagem e homogeneizao dos reagentes p.a..
55

Mtodos
Preparo da Spirulina em tamanho nanomtrico
A Spirulina LEB-18 com dimetro 200 micrometros foi dissolvida em soluo
tampo fosfato pH 7,0, 0,2M, de acordo com Malheiros (2010) com modificaes,
sendo aquecida em banho-maria, agitada e homogeneizada em Ultra-turrax a
10000rpm por 20 minutos, at uniformizao das partculas em tamanho nanomtrico
(Figura1).

Elaborao das dietas


As quatro dietas foram elaboradas conforme AIN-93 (REEVES, et.al.,1993),
sendo uma controle denominada casena (C), uma aprotica (A), e duas dietas
estudos, designadas spirulina (S) e spirulina nano (Sn). Foram pesados
separadamente e adicionados os ingredientes como leo de soja, sacarose amido de
milho entre outros, com uniformizao constante.
As dietas foram umedecidas com gel de amido a 8%, at atingir uma textura ideal
para peletizao manual, sendo os peletes dispostos em bandejas vazadas, e secos
em estufa com circulao de ar, a 50C por 24 horas, de acordo com o fluxograma
(Figura 2).

Composio centesimal
Foram realizadas determinaes, em triplicata, de umidade, cinzas e protenas da
Spirulina cepa LEB-18 das dietas, segundo metodologia do Instituto Adolfo Lutz
(2008), e para os lipdios pelo mtodo Bligh and Dyer, (1959) e carboidratos por
diferena.

Ensaio biolgico
O ensaio foi conduzido no Laboratrio de Experimentao Animal da rea de
alimentos, do Centro de Cincias Qumicas, Farmacuticas e de Alimentos, da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel) ( Figura 3).
O protocolo nmero:23110.000978/2010-91 , foi aprovado pela Comisso de
tica e Experimentao Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas.
56

Animais
Foram utilizados 24 fmeas de rattus norvegicus, recm desmamadas (21
dias), da cepa Wistar/ UFPEL provenientes do Biotrio Central da Universidade
Federal de Pelotas. Foram pesadas e colocadas aleatoriamente em gaiolas
metablicas individuais, sob condies ambientais, manteve-se o ambiente com
temperatura de 252C e ciclo de iluminao claro-escuro de 12 horas, recebendo
dieta controle (C) durante 4 dias, como perodo de adaptao s condies
ambientais. Ao final deste perodo, os animais foram pesados e redistribudos em
quatro grupos (n = 6), atravs de sorteio randmico, obtendo-se o peso mdio dos
grupos de aproximadamente 56 g, de maneira que a diferena entre os mesmos fosse
mnima possvel. A pesquisa teve durao de 15 dias. Durante todo o experimento
as ratas receberam gua ad libitum, e 15 g da dieta por dia.
No decorrer do experimento foi realizada, diariamente, pesagem da oferta de
dieta e da sobra. O peso corporal individual foi registrado a cada 3 dias, havendo,
nesta ocasio, rodzio da posio das gaiolas nas diferentes prateleiras. Estes dados,
alm de expressarem o ganho de peso e a ingesto de dieta por animal, foram
utilizados para determinar o coeficiente de eficincia alimentar (CEA), calculado pela
razo entre o ganho de peso e a quantidade total de dieta ingerida durante o
experimento.

Eutansia, obteno de sangue,soro, glicemia direta e minerais.


Ao trmino do perodo experimental, aps jejum de 12 horas, as ratas foram
pesadas, sendo eutanasiadas por decapitao. Alquotas de sangue foram
imediatamente depositadas em fitas especiais para dosagem de glicose e lidas em
equipamento Accu-Chek Advantage II (Roche).
O restante do sangue coletado foi centrifugado a 1000g, por 15min a 4C,
separando-se o soro o qual foi congelado (-20C) para anlise posterior. As
determinaes de minerais foram realizadas em equipamento fotmetro Biosystems
BTS-310 semi-automtico com emprego dos reativos Biosystems reagents and
instruments.

Medidas antropomtricas
Posteriormente a eutansia, antes da abertura do abdmen, foram realizadas
as medidas do comprimento entre os membros torcicos, e da circunferncia do
abdmem com o auxlio de fita mtrica.
57

As carcaas, bem como os demais materiais descartveis utilizados foram


embalados, separadamente em sacos apropriados, e enviados atravs do Biotrio
para descarte especializado.

Anlise estatstica
Os resultados foram analisados com o auxilio do programa Statistica, verso
7.0 (STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de
Tukey (p < 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.

Resultados e discusso

Composio Centesimal da Spirulina LEB-18.

Atravs das determinaes centesimais da Spirulina LEB-18, obtiveram-se os


resultados demonstrados na Tabela 2.
Em comparao com os resultados obtidos neste trabalho (Tabela 2) para teor
lipdico de spirulina, Duarte (2008), encontrou 3,9 %.Quanto ao teor de cinzas, Rosa e
colaboradores (2005) encontraram 6%, enquanto neste estudo o valor ficou acima de
10%.
As diferenas em relao as composies centesimais podem ser advindas
das condies de cultivo da cianobactria de fatores como: intensidade de luz,
temperatura e composio do meio , que podem variar de uma regio produtora para
outra, alm do estgio de crescimento celular, e proporcionar atividades biolgicas
distintas em funo de tais condies (ARAJO et al., 2003).
As dietas contendo spirulina diferiram estatisticamente da dieta casena e
aprotca com relao umidade e cinzas; o teor proteico a dieta spirulina nano diferiu
significativamente das demais dietas (Tabela 3). O teor de umidade possivelmente se
deve a no uniformizao do processo de secagem, no qual as dietas posteriormente
a peletizao foram encaminhadas estufa com circulao de ar a 50C por 24 horas.
De acordo com a quantidade lipdica as dietas avaliadas no diferiram. Estudos
de Radmann & Costa (2008) sobre o contedo lipdico e composio de cidos graxos
de distintas microalgas indicam 25,73% de acido linolico, dentre os cidos graxos
presentes na biomassa de Spirulina LEB-18.
A tabela 4 apresenta os pesos inicias, finais, os ganhos de peso e as
avaliaes antropomtricas.
58

Resultados da tabela 4 mostram que no houve diferena significativa no peso


corpreo pela ingesto de dieta spirulina , apesar de o nvel de protena da mesma ter
sido maior do que 10% e que a dieta spirulina nano apresentar-se em torno de
10,76%. Logo, sendo eficiente para o aumento do peso destes animais. Apesar do teor
de lipdios, destas dietas apresentadas neste estudo no diferirem, isso significa a
provvel influncia das condies do cultivo das microalgas.
Os animais alimentados com a dieta aprotica apresentaram menor
circunferncia do abdmen diferindo significativamente (p0,05) das demais dietas
estudadas, onde as ratas pertencentes a estes grupos no apresentaram diferena
entre si.
Com relao ao consumo total, verificou-se que o grupo que consumia a dieta
aprotica apresentou baixo consumo, sendo justificado pela falta de protena e
palatabilidade.
O coeficiente de eficincia alimentar (CEA), resultado da razo entre o ganho de
peso total e o consumo total de dieta durante todo experimento foi semelhante para os
grupos casena, spirulina em tamanho nano e spirulina micromtrica indicando
semelhana entre os mesmos na converso do alimento ingerido.
O CEA encontrado para as dietas deste trabalho, de acordo com a tabela 4, esto
acima dos resultados encontrados por Rogatto et al. (2004) no seu estudo com uma
dieta com 17% de Spirulina em substituio total protena da dieta controle (casena)
em ratos machos jovens Wistar durante cinco semanas que apresentaram CEA de
0,21 .
J Mitchell et al. (1990), em seu estudo o efeito de diferentes concentraes (0%;
2,7%; 10,7%; 18,7% e 26,7%) de Spirulina mxima sob os nveis de vitaminas A e E,
constataram que o CEA foi inversamente proporcional ingesto da biomassa. No
entanto,quando o coeficiente de eficincia alimentar da dieta experimental apresentou-
se semelhante a padro, isso significa que est apresentou-se equilibrada
nutricionalmente.

Nveis sricos de minerais e de glicose no sangue

Na tabela 5 esto apresentados os resultados das avaliaes bioqumicas. Um


grande nmero de minerais so reconhecidos como essenciais para manter a vida.
Pode-se classific-los em 2 grandes grupos, sendo a quantidade encontrada no
organismo o marco divisor. Os oligoelementos so encontrados em quantidade
menores que 100 mg/kg de peso corpreo total (Fe, Zn, Cu, Mn, Cr, Mo, Se, F, I, etc).
59

Na avaliao do estado nutricional dos minerais, vrios fatores so considerados,


como, por exemplo, edema e funo renal. Para alguns, o Mg e o P diminuem a sua
excreo urinria com a menor oferta. Neste estudo os grupos contendo spirulina no
diferiram estatisticamente dos grupos caseina e aprotica, porm estes grupos
apresentaram diferena entre eles com relao aos minerais sricos Mg, P e Fe e Ca.
Sendo que o teor de clcio encontrado no plasma sanguneo, apenas houve diferena
no grupo aproteico. Conforme Cisternas, Vargas e Monte (2001), o nvel de clcio em
sangue humano varia de 9 -11mg/dL, Feddern (2007) obteve valores entre 9,8 e
10,9mgdL-1 para ratas wistar alimentadas com dietas de diferentes misturas. Santos et
al.(2004), em sua pesquisa sobre o estudos bioqumicos e hematolgicos em ratos
sobre biodisponibilidade de minerais numa dieta enriquecida com multimistura,
verificou os niveis de minerais no soro para grupos que receberam dietas creche com
multimistura e apresentaram o teor de clcio (Ca) e magnsio(Mg) respectivamente
10,09 e 3,04, estando proximos aos deste estudo.
Com relao concentrao de glicose no sangue, os grupos experimentais
no diferiram estatiscamente (p0,05). Menores valores de glicemia podem ser
atingidos conforme o estgio de maturao da barreira intestinal dos ratos, ou seja,
com o passar da idade esta barreira atinge maior maturidade e seletividade quanto
absoro dos nutrientes. Alm disso, um maior teor de fibras, obtidos das dietas,
(particularmente as fibras solveis) promove uma camada de gel protetor no intestino,
passando a oferecer maior obstculo para a absoro da glicose, consequentemente
gerando menor ndice glicmico sanguneo (CHAUD, SGARBIERI, 2008).
Contudo todos os grupos apresentaram valores de glicemia normais, 50 mg/dL
a 135mg/dL, para a espcie (HARKNESS E VAGNER, 1993). Estando de acordo com
outros autores como Aires-Neto (2005) que encontrou em ratos machos glicemia
variando de 96 a 102 mg/dL. Nogueira-Junior et al. (2005) que encontraram glicemia
inferior a 130mg/dL em ratos fmeas.
60

Concluso

As dietas contendo spirulina-LEB 18 nos tamanho micro e nanomtrico no


interferiram nas medidas antopomtricas de ratas wistar da mesma forma, no
alterando a glicemia do sangue. Nem os teores de Ca e Fe no soro com ligeira
reduo de Mg e P, mas dentro de valores considerados normais para espcie.

Agradecimentos : CAPES,UFPEL.
61

PARECER DO COMIT DE TICA EM EXPERIMENTAO ANIMAL DA


UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS, RS BRASIL
62

REFERNCIAS

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65

Figura 1:Fluxograma da preparao da Spirulina em tamanho nanomtrico pelo


mtodo de hidratao de filme lipidico
66

Figura 1.

Spirulina LEB-18 Dissoluo em Tampo Fosfato 0,2 M pH7,0

Aquecimento a 60C /Banho- Agitao por 2 minutos


maria

Homogeneizador Ultra-
turrax10000 rpm /20 minutos
67

Tabela 1: Dietas experimentais elaboradas e administradas durante 15 dias a ratos


fmeas da cepa Wistar/UFPel (g.Kg-1).
Ingredientes Caseina Aproteica Spirulina nano Spirulina

micro
(200micrometros)

Spirulina LEB- _ _ - 160


18

Spirulina em 80 -
tamanho nano
- -

Casena 160 _ 80 -

leo de soja 70 70 70 70

Mistura mineral 35 35 35 35

Mistura 10 10 10 10
vitamnica

L-cistina 3,0 3,0 3,0 3,0

Bitartarato de 2,5 2,5 2,5 2,5


Colina

Sacarose 100 100 100 100

Fibra de trigo 50 50 50 50

Amido de milho 569,5 670,5 569,5 569,5


68

Tabela 2:Composio centesimal da Spirulina LEB- 18


Determinaes Valores b.s. (%) Desvio padro
Umidade 11,95 0,09
Proteinas 60,36 6,66
Cinzas 10,88 0,08
Lipdios 3,05 0,11
Carboidratos** 13,76 0,00
*b.s=base seca/**Carboidratos=100 (umidade + protenas + cinzas + lipdios). Mdias de 3
determinaes.

Tabela 3: Composio proximal das dietas avaliadas


Determinaes Caseina Aproteica Spirulina Spirulina
nano micro
Umidade 8,870,03b 8,610,02b 10,420,29a 10,620,19a
Cinzas 3,140,064b 3,780,53b 4,790,011a 5,130,050a
Proteina 15,590,28a 1,450,19c 10,760,20b 15,250,29a
Lipidios 5,601,16a 5,331,04a 5,630,04a 5,581,09a
Carboidratos 66,79b 80,83a 68,4 b 63,00b
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa pelo teste de Tukey
(p<0,05). Carboidratos=100 (umidade + protenas + cinzas + lipidios).
69

Tabela 4: Respostas biolgicas e nutricionais de ratas Wistar submetidas s


diferentes dietas experimentais , durante 15 dias, mdia rato/grupo
Avaliaes Caseina Aproteica Spirulina nano Spirulina micro
a a a
Peso inicial(g) 56,339,24 57,0011,36 57,7111,28 60,8511,36a
Peso final(g) 133,3311,71a 65,6612,35b 134,5716,48a 125,7112,51a
Ganho de peso 77,00a 8,66b 76,86a 64,86a
total(g)
Consumo dirio(g) 13,890,69 6,961,62 b 15,631,58 14,040,78
Ingesto total(g) 208,40 127,97 234,47 210,56
CEA 0,36 0,06 0,32 0,30
Circunferncia do 11,431,00 9,100,65b 11,820,82 11,770,94
abdmen(cm)
Distncia brao a 10,781,50 9,351,55a 10,741,08 10,671,,14
brao(cm)
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p<0,05).Mdia de 6
repeties.

Tabela 5: Nveis mdios das determinaes de minerais ( mg/dL de soro) de glicose


(mg/dL sangue) das ratas alimentadas com diferentes dietas experimentais durante 15
dias (mdia rata/dieta)

Avaliao Caseina Aprotica Spirulina nano Spirulina


bioquimica

Mg 3,290,42a 3,281,97b 3,110,22,b 3,160,15,b

P 12,771,17 a 13,177,63 b 12,491,96,b 12,081,07,b

Ca 10,710,24 a 10,756,20 b 10,700,38 a 10,330,19 a

Fe 22759,35 a 217,4129,9 a 23666,52 a 213,1634,82 a

Glicemia 102,3315,73 100,530,61 105,5718,43 96,5712,63

Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p<0,05).
Mdia de 3 repeties.
70

Artigo 3- AVALIAES BIOQUIMICAS E HISTOPALGICAS DE RATAS WISTAR


ALIMENTADAS COM DIETAS CONTENDO Spirulina cepa LEB -18

Adriana Rodrigues Machado, Rosane da Silva Rodrigues, Andra da Silva Ramos


Rocha, Mirian Ribeiro Galvo Machado, Leonor Almeida de Souza- Soares

Resumo

O objetivo do estudo foi avaliar as respostas bioqumicas e histopatolgicas das ratas


wistar alimentadas por 15 dias com dietas contendo spirulina tamanho micromtrico e
em tamanho nanomtrico. Foram utilizadas 24 ratas fmeas, recm desmamadas (21
dias), da cepa Wistar/ UFPEL. As anlises realizadas foram: determinao de lipdios
nas fezes e fgados, verificao da digestibilidade lipdica, avaliaes bioqumicas dos
nveis de colesterol total, LDL-colesterol, HDL-colesterol, VLDL-colesterol,
triacilglicerois, glicose sanguinea e avaliaes histopatolgicas. A determinao de os
lipidios totais nas fezes a spirulina nanomtrica diferiu das demais dietas, aps
verificou-se que as dietas experimentais com relao a casena no obtiveram
diferena de acordo com os lipdios hepticos. Com relao as avaliaes
bioqumicas no soro os grupos casena, spirulina em tamanho micro e nanomtrico e
aprotica, no diferiram estatisticamente. As leses hepticas foram bastante
heterogneas quanto ao padro e intensidade, podendo ser decorrentes de deposio
lipdica, mais evidenciada na dieta aprotica, provavelmente ocasionada pela
deficincia de protena e consequentemente pelo decrscimo na produo e
exportao de lipoprotenas pelo fgado.

Palavras-chave: Figado, ratos, spirulina e dietas.


71

1 Introduo

Nos ltimos anos, alm da agricultura e da pecuria convencionais, outras


fontes proticas tm sido examinadas. Nesse sentido, microorganismos tm recebido
ateno especial como fonte alternativa de protena na dieta. Segundo Donato (2010)
a expresso biomassa ou single cellprotein (scp) foi proposta por Tannenbaum (1975),
como um termo genrico para indicar fontes de protenas brutas ou refinadas,
originrias de microorganismos.
Dentre os microorganismos que vm sendo estudados, a alga verde azulada,
denominada Spirulina platensis, destaca-se por sua qualidade nutricional, ndice de
protena de alto valor biolgico, bem como de outros componentes como vitaminas,
minerais e cidos graxos essenciais com destaque para o cido gama-linolnico e o -
caroteno (Belay ,et al.1993).
A Spirulina cresce normalmente em guas de lagos naturalmente alcalinos,
localizados em zonas ridas. Uma vez que essa alga tem rpida taxa de reproduo,
dividindo-se trs vezes ao dia, uma rea devotada totalmente ao crescimento de
Spirulina pode produzir 125 vezes mais protena que rea de mesma dimenso
voltada ao cultivo de milho; ou 70 vezes mais do que se voltada criao de gado
(Feddern, 2007). Alm disso, a Spirulina possui algumas vantagens sobre as outras
algas, dentre as quais pode-se citar paladar agradvel, no apresenta problemas na
sua digesto e nem toxicidade aparente aos humanos, o que no acontece com outras
algas tais como Chlorella e Scenedesmus (Contreras et al., 1979). Apresenta, ainda,
aes antioxidantes e hipocolesterolmica (Rodriguez-Hernandez et al.,2001).
A microalga classificada como GRAS (Generally Recognized as Safe) pelo FDA
(Food and Drug Administration), o que garante seu uso como alimento sem riscos
sade.
A biomassa de spirulina pode ser indicada como auxiliar em dietas que requerem
diminuio da ingesto calrica, por conter substncias que parecem prolongar o
tempo de trnsito gstrico e produzir sensao de saciedade (Araujo et.al.,2003
citando Guglielmi at.al.1993). O trabalho de Becker et al. (1986 ) descreve um
experimento com humanos com o objetivo de estabelecer uma relao entre o
consumo desta biomassa e a diminuio do peso corporal. No Brasil, a spirulina tem
sido empregada, basicamente, na produo de cpsulas destinadas dieta de
emagrecimento. Como tambm, para o estudo do metabolismo do colesterol e suas
fraes .
72

As lipoprotenas de acordo com sua densidade podem classificar-se em LDL


(lipoprotenas de baixa densidade), HDL (lipoprotenas de alta densidade), VLDL
(lipoprotenas de densidade muito baixa) e quilomcrons (com densidade ainda
menor), sendo o LDL e o HDL os mais estudados. O transporte de colesterol feito
em aproximadamente 65% pela LDL e 25% pela HDL. As lipoprotenas tm um ncleo
hidrofbico composto de triacilgliceris e steres de colesterol envoltos por uma
superfcie hidroflica de colesterol livre, no-esterificado, fosfolipdios e
apolipoprotenas (Giribela, 2007). Alm do LDL, as lipoprotenas HDL tambm so
responsveis pelo transporte de colesterol, atuando no transporte reverso deste, que
o processo pelo qual o colesterol transportado das clulas perifricas para o fgado,
retirando-o das paredes das artrias (Vilela, 2007). O HDL formado por partculas
esfricas, cuja estrutura consiste em um ncleo lipdico hidrofbico, contendo
principalmente steres de colesterol, triglicerdeos e colesterol no-esterificado e uma
superfcie hidrossolvel composta por camada de fosfolipdios, colesterol no-
esterificado e apolipoprotenas, principalmente apo A-I (Giribela, 2007).

O objetivo do estudo foi avaliar as condies bioqumicas e histopatolgicas das


ratas wistar que consumiam dietas com spirulina LEB-18 em tamanho micromtrico e
nanomtrico.

2 Material e Mtodos
2.1 Material
A biomassa da microalga Spirulina LEB 18 foi fornecida pelo Laboratrio de
Engenharia Bioqumica (LEB cepa-18),isolada da lagoa Mangueira,RS, Brasil (Morais
et al , 2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (Costa,Colla, Duarte- Filho,
2004). Aps, a Spirulina LEB-18 foi triturada em moinho de bolas (Modelo Q298-2) e
peneirada em agitador de peneiras, alcanando uma granulometria de 200m.
posteriormente foi acondicionada a vcuo em embalagens de polietileno de alta
densidade (PEAD), com capacidade para 500g, e armazenada sob refrigerao
temperatura de 5C.

2.1.2 Ingredientes para elaborao das dietas

As dietas foram formuladas, conforme a tabela 1, para suprir as necessidade


bsicas de um rato na fase de crescimento, sendo utilizadas as seguintes fontes de
nutrientes:Casena comercial (SIGMA), L-cistina, cloridrato de colina, mistura de
73

minerais, mistura vitamnica (manipulao farmacutica), leo de soja, sacarose, farelo


de trigo e amido de milho adquiridos no comrcio local. A mistura de minerais
(Reeves et al., 1993) foi obtida atravs da pesagem e homogeneizao dos minerais
adquiridos.

Tabela 1: Dietas experimentais administradas durante 15 dias a ratos fmeas da cepa


Wistar/UFPel (g.Kg-1)
Ingredientes Casena Aprotica Spirulina Spirulina
nano
(200 m)

Spirulina LEB-18 _ _ - 200

Spirulina nano - - 80 -

Caseina 160 _ 80 -

leo de soja 70 70 70 70

Mistura mineral 35 35 35 35

Mistura vitaminica 10 10 10 10

L-cistina 3,0 3,0 3,0 3,0

Bitartarato de 2,5 2,5 2,5 2,5


Colina

Sacarose 100 100 100 100

Fibra de trigo 50 50 50 50

Amido de milho 469,5 670,5 569,5 469,5

2.2 Mtodos
2.2.1 Preparo da Spirulina em tamanho nanomtrico
A Spirulina LEB-18 com dimetro 200 micrmetros, de acordo com Malheiros
(2010) com modificaes, foi dissolvida em soluo tampo fosfato pH 7,0, 0,2M,
posteriormente foi realizado aquecimento em banho-maria, com agitao em vortex e
homogeneizao em Ultra-turrax a 10000rpm por 20 minutos, at uniformizao das
partculas em tamanho nanomtrico (Fig.1).
74

Spirulina LEB-18

Dissoluo em Tampo
fosfato pH7,0

a
Aquecimento a 60C BanhoM.

Agitao por 2 minutos

Homogeneizador Ultra-
turrax10000 rpm /20 minutos
Figura 1:Fluxograma da Preparao da Spirulina em tamanho nano

2.2.2 Elaborao das Dietas

As dietas seguiram as recomendaes da AIN-93 (American Institute of Nutrition),


onde foram preparadas quatro dietas, sendo uma dieta controle denominada casena,
uma aprotica e duas dietas em estudos, designadas spirulina e spirulina nano
(Reeves et al.,1993).
Para administrao aos animais, as dietas foram umedecidas com gel de amido a
8%, at atingir uma textura ideal para peletizao manual, sendo os peletes secos em
estufa com circulao de ar a 50C por 24 horas acondicionadas em recepientes de
polipropileno.

2.3 Ensaio biolgico

Foram utilizadas 24 ratas fmeas (Rattus norvegicus), recm desmamadas (21


dias), da cepa Wistar/ UFPEL provenientes pelo Biotrio Central da Universidade
Federal de Pelotas que foram pesadas, colocadas aleatoriamente em gaiolas
metablicas individuais,recebendo dieta controle (C) durante 4 dias, como perodo
de adaptao s condies ambientais. O projeto foi aprovado pelo Comit de tica e
Experimentao Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas, registro
nmero:23110.000978/2010-91 (anexo 1). O ensaio biolgico foi conduzido no
75

Laboratrio de Experimentao Animal do Centro de Cincias Qumicas,


Farmacuticas e de Alimentos, da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Os
animais foram pesados semanalmente do inicio ao final do experimento, para
verificao de ganho de peso.
Ao final da adaptao os animais foram pesados e redistribudos em quatro grupos
(n = 6), atravs de sorteio randmico, (figura 2), obtendo-se o peso mdio dos grupos
de aproximadamente 56 g, de maneira que a diferena entre os mesmos fosse a
mnima possvel. Aps 15 dias de experimento os animais foram submetidos ao jejum
de 12 horas, as ratas foram pesadas, sendo eutanasiadas por decapitao.

2.3.1 Eutansia e retirada do fgado e avaliaes bioqumicas


Aps a eutansia alquotas de sangue foram imediatamente depositadas em fitas
especiais para dosagem de glicose e lidas em equipamento Accu-Chek Advantage II
(Roche).
O restante do sangue coletado foi centrifugado a 1000g, por 15min. a 4C,
separando-se o soro o qual foi congelado (-20C) para anlise posterior. As
determinaes no soro como colesterol total;Triacilglicerois;VLDL; HDL; LDL; e
minerais foram realizadas em equipamento fotmetro Biosystems BTS-310 semi-
automtico com emprego dos reativos Biosystems Reagents and Instruments.

Posteriormente eutansia, aps a abertura do abdmen, os fgados foram


coletados, lavados em soluo fisiolgica gelada (NaCl 0,9%), seco em papel filtro,
sendo um lbulo destinado s avaliaes histopatolgicas e o restante envolto em
papel alumnio e congelado a -20C para posterior determinaes dos
lipdios,conforme Bligh e Dyer (1959) adaptado por Arajo (2009).
As carcaas, bem como os demais materiais descartveis utilizados, foram
embalados separadamente em sacos apropriados e enviados, atravs do Biotrio,
para descarte especializado.

2.3.2 Determinao de lipdios nas fezes


Para determinao de lipdios primeiramente as fezes foram coletadas e
armazenadas sob refrigerao e aps secas em estufa a 501C por 48 horas. Foram
modas (almofariz e pistilo) em alquotas de 3g provenientes de cada animal foram
pesadas. As determinaes foram realizadas, em triplicata, de acordo com Bligh e
Dyer (1959) adaptado por Arajo (2009).
76

As alquotas foram transferidas para tubos de ensaio com capacidade para


70mL, adicionando-se exatamente 10mL de clorofrmio, 20mL de metanol e 8mL de
gua destilada. A mistura foi agitada em agitador rotativo (homogeneizador de sangue
modelo Phoenix AP 22) por 30 minutos. Aps foram adicionados 10mL de clorofrmio
e 10mL de soluo de sulfato de sdio 1,5%, sendo a mistura agitada vigorosamente
por 2 minutos. As camadas formadas foram separadas succionando-se e descartando
a camada metanlica superior. Posteriormente, a camada inferior foi filtrada em papel
filtro quantitativo, transportando-se o filtrado para recipiente de vidro mbar e
armazenados sob refrigerao. Amostras de 5mL dos filtrados foram transferidas para
bqueres de 50mL previamente tarados. O solvente foi evaporado em estufa a 100C.
O contedo total de lipdios presente nas fezes de cada animal foi calculado de acordo
com a equao 1.

% Lipdios totais = peso dos lipdios x 4 x 100


peso da amostra (g)

Equao 1 Clculo do percentual total de lipdios em fezes por grupo

2.3.3 Determinao da digestibilidade lipidica


A digestibilidade lipdica depende do pleno funcionamento de diversos rgos do
trato gastrointestinal. Logo, quaisquer alteraes relacionadas ao sistema digestrio
podem afetar a plena digesto e conseqente absoro e metabolismo dos nutrientes
(DAgostini, 2001; Kierzabaum, 2004; Ming, 2006). Assim, certas desordens no trato
gastrointestinal podem levar ao desenvolvimento de doenas relacionadas m
absoro lipdica. A equao 2 apresenta o clculo da determinao da digestibilidade
lipidica.
% Digestibilidade lipdica = (lipdios ingeridos lipdios excretados) x 100

lipdios ingeridos

Equao 2 Clculo da digestibilidade lipdica

2.4 Avaliaes histopatolgicas

Foram retirados fragmentos do lbulo direito do fgado de cada animal para


realizao da avaliao histopatolgica. As peas retiradas foram lavadas em soluo
salina (0,9%) e fixadas em soluo de formol tamponado (10%). Em seguida, as peas
foram submetidas a um processo de desidratao em srie crescente de lcoois e
77

diafanizao em xilol, em tempo previamente padronizado para todos os grupos, e


ento includas em parafina. Aps incluso, foram seccionados com 5m de
espessura e corados pelo mtodo da Hematoxilina-Eosina para o exame histolgico
em microscpio de luz. Os procedimentos foram realizados pela equipe do laboratrio
Regional de Diagnstico da Faculdade de Medicina Veterinria da UFPEL, sendo as
amostras avaliadas sem o conhecimento prvio dos grupos aos quais pertenciam os
animais. Atravs das observaes histopatolgicas buscou-se avaliar: a) integridade
ou leso dos diferentes rgos; b) presena de qualquer alterao, caracterizando o
processo, a distribuio e a extenso; c) presena de degenerao gordurosa heptica
(esteatose).

2.5 Determinao de lipidios no figado


Foram pesadas amostras de 3g dos fgados, originadas de um pool de cada
grupo. A determinao foi realizada, em triplicata, atravs do mtodo de Bligh & Dyer
(1959) adaptado por Arajo (2009). Os resultados foram expressos em % lipdios.

3 Anlise estatstica
Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, verso 7.0
(STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de Tukey (p
< 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.
78

4 Resultados e discusso

4.1 Avaliaes bioqumicas

Os nveis de colesterol total, e suas fraes LDL-colesterol, HDL-colesterol,


VLDL-colesterol, triacilglicerois e de glicose em ratos, esto expressos na tabela 5.
Tabela 5: Concentraes (mg/dL de soro) de colesterol total, LDL- colesterol,HDL-

colesterol,VLDL-colesterol, triacilgliceris e glicose (mg/dL de sangue) em ratas

fmeas wistar submetidas as diferentes dietas experimentais durante 15 dias

Avaliaes DIETAS

Bioqumicas Casena Aprotica Spirulina nano Spirulina

micromtrica

Colesterol total 77,6610,87 a 38,3333,92 b 83,513,21 a 93,1610,10 a

Triacilglicerois 73,0020,66 a 99,0058,11 a 70,0022,29 a 80,6625,35 a

HDL 31,664,54 a 28,0015,45 b 31,833,71 a 32,664,08 a

VLDL 14,54,08 b 19,6611,49a 14,334,68 b 16,005,05 b

LDL 33,162,64 a 13,669,01 b 37,0013,84 a 44,58,87 a

Glicemia 102,3315,73 100,530,61 105,5718,43 96,5712,63

Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p<0,05).

Com relao ao colesterol total os grupos que consumiam dietas casena,


spirulina micromtrica e spirulina nano no diferiram estatisticamente, somente o
grupo aprotico diferiu dos demais, pois este apresentou desvios padres muito
elevados, em funo das hemlises ocorridas nas coletas das amostras. A microalga
spirulina contm componentes antioxidantes como a ficocianina e compostos fenlicos
que so ligados diminuio do colesterol sanguneo. Diversos estudos comprovam
que a spirulina til no combate ao colesterol alto. Em um destes estudos, 15 homens
consumiram 4,2g de spirulina por dia durante 8 semanas,onde no final do estudo, a
spirulina mostrou-se eficiente a reduzir o mau colesterol (LDL) sem baixar o bom
colesterol (HDL) (Nakaya et al.,1988). Outro estudo com coelhos que tinham uma dieta
79

rica em colesterol mostrou que a suplementao com spirulina reduziu os nveis de


triacilgliceris e do mau colesterol (LDL) no sangue (Cheong et al., 2010 ). Segundo
Colla et al (2008), no seu estudo com coelhos alimentados com dietas ricas em
colesterol obtiveram decrscimo nos seus nveis de lipoprotenas no sangue quando
alimentados com dietas acrescidas de 0,5g de spirulina por dia.Outros estudos sobre o
efeito da spirulina platensis no perfil lipdico de ratos wistar, no encontraram alterao
significativa ao tratar de animais com dieta hipercolesterolmica acrescida de spirulina
por 60 dias, implicando que a microalga associada uma dieta rica em colesterol no
ou os nveis lipdicos (Bertolin et al, 2009).

Os triacilgliceris dos grupos apresentados neste estudo, no diferiram


estatisticamente entre si, o grupo spirulina nano apresentou a tendncia de valores
inferiores aos demais. Contudo, dentro do esperado, conforme os dados preconizados
pela equipe do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de
So Paulo (FMUSP, 2010) triacilgliceris devem estar presentes no soro de Rattus
norvegicus sadios em torno de 66,35 78,00mg.dL-1.Todos os resultados
encontrados foram superiores ao obtidos por Marco (2008). De acordo com Vaz et al.
(2006),os triacilglicerois (TG) so os lipdios presentes em maior quantidade na
alimentao e constituem a forma de armazenamento dos mesmos, representando a
maior reserva energtica dos mamferos. Com relao concentrao de glicose no
sangue, os grupos experimentais no diferiram estatiscamente (p0,05). As maiores
concentraes, numericamente, foram verificadas nos grupos submetidos s dietas
caseina e spirulina nano, porm a menor mdia foi demonstrada no grupo que recebia
dieta spirulina micro, conforme a tabela 5. Isso se deve, provavelmete a influncia dos
ingredientes na composio da dieta. Menores valores de glicemia podem ser
atingidos, tambm, conforme o estgio de maturao da barreira intestinal dos ratos,
ou seja, com o passar da idade essa barreira atinge maior maturidade e seletividade
quanto absoro dos nutrientes. Alm disso, um maior teor de fibras (particularmente
as fibras solveis) promove uma camada de gel protetor no intestino, passando a
oferecer maior obstculo para a absoro da glicose, consequentemente gerando
menor ndice glicmico sanguneo (Chaud et al., 2008).

Contudo todos os grupos apresentaram valores de glicemia normais, 50 mg/dL


a 135mg/dL, para a espcie (Harkness e Vagner, 1993). De acordo com outros
autores como, Aires-Neto (2005) encontraram em ratos machos glicemia variando de
96 a 102 mg/dL. Nogueira-Junior et al.(2005) trabalharam com ratos fmeas,
encontrando glicemia inferior a 130mg/dL.
80

A tabela 6 demonstra os dados dos teores de lipdios nas fezes, fgados de


ratas wistar submetidos s diferentes dietas, bem como suas digestibilidades.

Tabela 6. Teor de lipdios totais e respectivas digestibilidades lipdicas em ratas wistar

submetidas s diferentes dietas.

Grupo Lipidios da Dieta Lipidio - Lipdios Excreta Lipidio - Dosagem de Digestibilidade

dieta Consumo ingesta totais das mdia excretado lipdios nos


Lipidica*
mdio rato rato/dia excretas rato rato/dia(g) fgados
(g/%)
/dia (g) /dia(g) (%)
(g) (g/%) (g/%)

a a a b
Caseina 5,60 13,89 0,77 13,02 1,01 0,13 2,95 83,1

a a a b
Spirulina 5,58 14,04 0,78 11,56 2,53 0,29 3,62 62,8

a a b b
Spirulina 5,63 15,63 0,80 8,94 1,35 0,11 3,73 87,0

nano

a b a a
Aprotica 5,33 6,96 0,37 13,13 0,52 0,07 8,34 81,1

*% Digestibilidade lipdica = (lipdios ingeridos lipdios excretados) x 100 / lipdios ingeridos


Pela tabela 6, o aproveitamento lipidico dos animais foi consideravelmente maior
com dieta base de spirulina nano.Provavelmente se deve a complementao da
casena na formulao das dietas de spirulina nano, com isso assemelha-se as dietas
casena e aprotica, bem como menor teor de fibra proveniente da biomassa.
A maior concentrao de lipdios hepticos foi encontrada para os animais da
dieta aprotica. As dietas contendo spirulina apresentaram uma menor quantidade de
lipdios hepticos, caracteristicas de dietas de fonte vegetais indicando que as dietas
do presente estudo (S, Sn), apresentaram um fator benfico em funo da menor
deposio lipdica no fgado.
Pode se observar que as dietas casena, spirulina nano e aprotica, apresentaram
percentuais aproximados de digestibilidade lipidica entre si, enquanto a spirulina
micromtrica apresentou um percentual menor, devido ao percentual de fibras que
presentes na dieta. Bork et.al. (2008), em seu estudo sobre a Avaliao da
digestibilidade lipdica do leite caprino comparado ao leite bovino em ratas Wistar,
verificou a digestibilidade lipdica de 98,23%, 95,12% e 97,40% respectivamente para
a dieta padro, dieta com leite bovino e dieta com leite caprino, estando estes acima
dos resultados encontrados neste estudo.
81

4.2 Avaliao do perfil histopatolgico

As figuras 1, 2, 3 e 4 a seguir representam as fotomicrogrficas dos fgados


dos ratos fmeas do grupo,spirulina micromtrica, controle (casena), spirulina nano e
aprotica.

1 2

3 4

Figura1: Fotomicrografia do fgado do grupo Spirulina micro -(1)Degenerao vacuolar heptica

multifocal moderada.(2) Degenerao vacuolar heptica multifocal leve.(3) Degenerao

vacuolar heptica difusa moderada.(4) Degenerao vacuolar heptica difusa leve.


82

A B

C D

Figura 2: Fotomicrografias do fgado do grupo casena (A) Degenerao vacuolar heptica

difusa leve.(B) Degenerao vacuolar heptica difusa moderada.(C) Degenerao vacuolar

heptica multifocal leve.(D) Degenerao vacuolar heptica multifocal a coalescente moderada.

1 2

3 4

Figura 3: Fotomicrografias do figado do grupo Spirulina nano(1) Degenerao vacuolar

heptica difusa moderada.(2) Degenerao vacuolar heptica multifocal a coalescente

moderada.(3) Degenerao vacuolar heptica difusa leve.(4) Degenerao vacuolar heptica

difusa moderada.
83

1 2

3 4

Figura 4: Fotomicrografias do figado do grupo aproteico(1) ,(2)e (3) Degenerao vacuolar

heptica difusa acentuada. (4) Degenerao vacuolar heptica mdio-zonal multifocal a

coalescente acentuada.

Nas figuras anteriores (1,2,3 e 4) das lminas histolgicas dos lbulos direito dos
fgados, onde pode ser observado que praticamente todos os animais demonstraram
algum grau de leso heptica. Contudo, na figura 1 a verificao do fgado dos ratos
que recebiam dietas com spirulina as leses obtiveram 80% leve a 20% moderada.
Para as ratas fmeas que receberam dietas a base de casena os fgados
apresentaram leses com 50% de leve a moderada (Figura 2). O grupo que recebia
dieta de spirulina nanomtrica foram verificados os percentuais de 20% leve a 80%
moderada de acordo com a figura 3. J para os animais, onde eram fornecidas as
dietas aproticas, figura 4, apresentou leses hepticas muito acentuadas (100%). As
leses hepticas foram bastante heterogneas quanto ao padro e intensidade. Estas
podem ser decorrentes de estresse ou diminuio/restrio de ingesta/jejum. Alm
disso, em graus discretos so achados casuais nos fgados de roedores de laboratrio
(Jubb; Kennedy; Palmer, 2007).
Nos fgados no foram observados leses de significado patolgico. Uma das
alteraes metablicas nas clulas o acmulo intracelular de substncias, tais como:
84

gua, lipdios, carboidratos e protenas. O significado desse acmulo (degenerao)


depende da causa e da gravidade da deposio. Quando leve, pode no causar
efeito na funo celular. Um acmulo intracelular acentuado (grave) pode prejudicar a
funo levando morte da clula. importante ressaltar que na colorao de
hematoxilina e eosina no possvel determinar qual a substncia que est se
acumulando (Schild e colaboradores, comunicao pessoal, 2011).
Ferreira Hermosillo et al.(2010) no seu estudo relatam sobre pacientes que
sofriam de doenas heptica gordurosa no alcolica receberam 4,5 g de spirulina por
dia durante 3 meses, logo aps, os cientistas puderam concluir, com segurana, que a
spirulina pode ser considerada uma alternativa teraputica para pacientes que sofram
de doena heptica gordurosa no alcolica ou desordens de dislipidemia.
A esteatose heptica, ou o acmulo de lipdios no fgado uma alterao
metablica que tambm tem sido observada em organismos submetidos desnutrio
protico-calrica crnica (Kumar et.al 1972;Taylor et.al 1972). Este aumento da
concentrao de gordura no fgado acontece principalmente em funo de incremento
dos triaglicerdeos(Kumar et al 1972;Taylor et al 1972).

As principais causas da esteatose so: hipoxemia (a gordura transportada para o


fgado no oxidada e fica retida); txicos (arsnio, clorofrmio, tetracloreto de
carbono, micotoxinas) e insuficincia de fatores lipotrficos (colina e metionina)
(COELHO, 2002).

No entanto, segundo Coelho (2002) a degenerao gordurosa, tambm


conhecida pelas designaes de metamorfose gordurosa, esteatose, lipidose, e
infiltrao gordurosa, uma doena provocada pelo desequilbrio entre a captao
heptica dos cidos graxos e sua utilizao (AROEIRA, 1998, JONES; HUNT e KING,
2000). A doena causa a presena excessiva de lipdios dentro do fgado e ocorre
quando o ndice de acumulao de triglicerdeos excede seus ndices de degradao
metablica ou liberao como lipoprotenas (MACLACHLAN e CULLEN, 1998).
85

5 Concluso

Com relao as avaliaes bioqumicas no soro os grupos no diferiram


estatisticamente. A microalga Spirulina em tamanho micro e nanomtrico, os valores
demonstram que o seu consumo no alterou o desenvolvimento fisiolgico, bioqumico
dos animais. Com os resultados apresentados neste estudo verificou-se que os
animais evidenciaram determinado grau de leso heptica. As leses hepticas foram
bastante heterogneas quanto ao padro e intensidade. Podendo ser decorrentes de
deposio lipdica, verificada na spirulina em tamanho nanomtrico, porm mais
evidenciada na dieta aproteica, provavelmente ocasionada pela deficincia de protena
e consequentemente pelo decrscimo na produo e exportao de lipoprotenas pelo
fgado.

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Artigo 4- Avaliao biolgica de casena e Spirulina em ratos Wistar e


encapsulao destas fontes proteicas em lipossomas

Adriana Rodrigues Machado, Leticia Marques de Assis, Rosane da Silva Rodrigues,


Mirian Ribeiro Galvo Machado, Leonor Almeida de Souza Soares

Resumo

O objetivo do trabalho foi verificar o efeito nutricional de dietas em ratos Wistar


alimentados com spirulina e casena, e nanoencapsular atravs de lipossomas
estas duas fontes proticas, para possveis aplicaes em formulaes
alimentcias. Primeiramente foi realizado o ensaio biolgico, para avaliao do
efeito destas fontes proticas em ganho de peso dos animais. Foram utilizados
12 ratos fmeas, recm desmamados (21 dias), da cepa Wistar/ UFPEL, em
um total de 15 dias, com 4 dias de adaptao, com peso inicial entre 42,66 e
68g. Os animais foram pesados, no perodo de adaptao e no final do
experimento, para determinao do ganho de peso. O processo de
encapsulao, da spirulina e casena ocorreu atravs da formao de
lipossomas, utilizando a metodologia de Hidratao do Filme Lipdico,
recebendo tratamentos diferenciados aps sua elaborao,, como sonicao a
60 C durante 30 min ou homogeneizao (Ultra-Turrax) a 10.000 rpm durante
15 min. Para a determinao do tamanho mdio e morfologia das partculas
utilizou-se a tcnica de espalhamento dinmico de luz e microscopia eletrnica
de varredura, respectivamente. Conclui-se que as dietas a base de spirulina e
casena no diferiram significativamente no consumo alimentar total e ganho de
peso dos animais, promovendo valores de coeficiente de eficincia alimentar
muito prximos, como tambm, foi possvel elaborar lipossomas de casena e
Spirulina na escala nanomtrica.
Palavras-chaves: spirulina, casena, ratos e lipossomas.
90

1. INTRODUO

A cianobactria spirulina platensis representa uma fonte de protenas e cidos


graxos que a tornam importante como suplemento alimentar. A fonte de nitrognio
um nutriente que exerce influncia em seu metabolismo.
A casena bovina pode ser obtida em grande quantidade por processos
tecnolgicos a baixo custo, tanto pela precipitao cida (casena isoeltrica) como
pela coagulao enzimtica. Em virtude do crescente interesse da indstria na
produo de protenas de soro de leite, pode-se ter, em futuro prximo, quantidade
muito grande de casena no mercado. Devido ao seu elevado valor nutritivo e
excelente funcionalidade, aliadas ao baixo custo de produo, a casena se apresenta
como um ingrediente de primeira linha para o enriquecimento e produo de alimentos
proticos para fins especficos. Ela tem sido usada na produo de produtos crneos,
produtos de laticnios, produtos de panificao, chocolates, confeitos, produtos de
cobertura, cremes para caf e snacks (ALVIM et al., 2002).
As principais nanoestruturas utilizadas para encapsulao de substncias ativas
so os lipossomas, as ciclodextrinas, as nanopartculas polimricas e as
nanopartculas lipdicas, como a lecitina de soja.
Os lipossomas foram utilizados neste estudo, sendo uma das alternativas para a
nanoencapsulao de ingredientes alimentcios, como vantagem, ser uma das
tcnicas mais antigas e baratas para encapsulao. Lipossomas, ou vesculas de
fosfolipdios, so estruturas esfricas compostas por bicamadas lipdicas que
encapsulam parte do meio em que se encontram. So formadas predominantemente
por molculas anfiflicas, insolveis em gua, que quando em ambientes aquosos
formam disperses coloidais (LASIC, 1993).
Uma importante caracterstica da encapsulao em lipossomas que ela pode
facilmente permitir o controle da liberao dos compostos encapsulados, dependendo
das condies de temperatura, pH e presena de ons ao que o alimento submetido.
A casena comercial, assim como a spirulina, foi utilizada tambm neste processo
de encapsulao como ncleo. O objetivo do trabalho foi verificar o ganho de peso de
ratos Wistar de acordo com as duas diferentes fontes proticas consumidas e
nanoencapsular atravs de lipossomas estas fonte protica, como a casena e
spirulina LEB-18.
91

2. MATERIAL E MTODOS
2.1 Obteno das fontes proteicas e material de parede
A biomassa da microalga Spirulina LEB-18 foi fornecida pelo Laboratrio de
Engenharia Bioqumica, FURG, isolada da lagoa Mangueira, RS, Brasil, (MORAIS et al
, 2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (COSTA et . al., 2004).A casena e
a lecitina de soja foram adquiridas em forma de p no comrcio local da cidade de
Pelotas-RS.

2.1.1 Preparo da biomassa


A biomassa de Spirulina LEB-18 foi triturada em moinho de bolas (Modelo Q298-2)
e peneirada em agitador de peneiras, alcanando uma granulometria de 200m. Aps
foi acondicionada a vcuo em embalagens de polietileno de alta densidade (PEAD),
com capacidade para 500g, e armazenada sob refrigerao temperatura de 5C.

2.2Ensaio biolgico
Foram utilizados 12 ratos fmeas, recm desmamados ( 21 dias), da cepa Wistar/
UFPEL, com peso inicial entre 42,66 e 68g, que foram divididos aleatoriamente em
blocos de 6 ratos para cada dieta. Os animais foram fornecidos pelo Biotrio Central
da Universidade Federal de Pelotas,aps encaminhamento de projeto especfico para
a Comisso de tica da UFPEL. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratrio de
Experimentao Animal do Centro de Cincias Qumicas, Farmacuticas e de
Alimentos, UFPel, e teve durao de 15 dias, sendo 4 dias de adaptao s condies
ambientais, e 11 dias de experimento. Neste trabalho utilizaram-se 2 dietas: casena
(C) e spirulina (S).
As ratas foram mantidas individualmente em gaiolas metablicas , recebendo
diariamente dieta e gua ad libitum. O ensaio biolgico foi desenvolvido com
temperatura e umidade relativa nas faixas de 22-24C e 65-75%, respectivamente, e
ciclo claro/escuro de 12 horas.
No 15 dia as ratas, aps jejum de 12h, foram submetidas eutansia por
decapitao (guilhotina). Os animais foram pesados no perodo de adaptao, no
incio, na metade e no final do experimento, para determinao do ganho de peso. Os
dados de consumo de dieta, pesos e outros foram anotados em planilhas.
92

2.3 Composio centesimal


Foi realizada a composio centesimal da caseina e spirulina, nas dietas contendo
estas fontes proticas e na sua forma encapsulada, de acordo com as normas
analiticas do Instituto adolfo Lutz (2008). O fator de converso utilizado para protena
bruta foi de 6,25. O teor de carboidratos foi realizado por diferena.

2.4 Elaborao dos lipossomas e Liofilizao do material encapsulado


O processo de encapsulao foi realizado de acordo com a metodologia de
hidratao do filme lipdico, segundo Malheiros (2010). A fonte de lipdios utilizada
para a elaborao dos lipossomas foi a fosfatidilcolina purificada a partir da lecitina de
soja. Primeiramente, 1 g da fosfatidilcolina foi dissolvida em 100 mL de clorofrmio em
balo de fundo redondo, aps sua completa disperso, o solvente orgnico foi
removido em evaporador rotatrio at que fosse observado um filme lipdico
depositado nas paredes do balo. Os traos de solvente orgnico foram removidos
atravs da estocagem do balo por 18h em dessecador a vcuo. O filme lipdico
resultante foi disperso pela adio de 20 mL de tampo fosfato pH 7,0, 0,2 M contendo
2 g de Spirulina LEB-18 dissolvida. A mistura contida no balo foi submetida
temperatura excedente a fase de transio (60 C). Aps os lipossomas foram
submetidos a tratamentos distintos de sonicao, utilizando banho ultrasnico (40 kHz,
Unique USC 700) a 60 C durante 30 min ou homogeneizao (Ultra-Turrax) a 10.000
rpm durante 15 min(Figura 1).
A liofilizao foi realizada atravs do mtodo de desidratao por sublimao do
produto congelado a -80C por 48 horas, por meio do liofilizador de bancada modelo
FD 5505, apenas para determinao da microscopia eletrnica de varredura.
(a) (b)

Figura 1: Processo de obteno de lipossomas atravs do mtodo de hidratao do filme

lipidico.Etapa (a):Adio dos componentes;1: formao do filme lipidico;2: Adio de soluo

aquosa e mistura;Etapa (b) : Uniformizao dos lipossomas-evaporao do solvente e

formao do filme.
93

2.5 Tamanho mdio das partculas

Para a determinao do tamanho mdio das partculas foi utilizado a tcnica do

espalhamento dinmico de luz , atravs do equipamento com comprimento de onda de

632,8 nm, modelo 127 da Spectra-physics acoplado a um gonimetro BI-200M verso

2.0 e com correlador digital BI-9000AT da Brookheaven Instruments. Os lipossomas

foram filtrados em filtros de 0,45 m, e utilizaram-se duas gotas de amostra dissolvido

em 8 ml de tampo fosfato pH 7,0, 0,2M para a realizao das anlises.

2.6 Microscopia eletrnica de varredura

Para a anlise microscpica, os lipossomas liofilizados foram ressuspendidos em


metanol, tratados no banho ultra snico durante 20 min e depositados sobre substrato
de silcio. Os substratos foram presos ao porta-amostra do microscpio utilizando-se
uma fita de carbono, sendo ento metalizadas com ouro por 3 min e corrente de 5
mA, em equipamento Sanyu Electron, modelo Quick Coater SC-701. As imagens
foram obtidas em um microscpio Shimadzu, modelo SSX-550, que possui vcuo e
EDS acoplados.

2.7 Anlise estatstica


Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, verso 7.0
(STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de Tukey (p
< 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.
94

3. RESULTADOS E DISCUSSO

Os resultados da composio centesimal das dietas casena e spirulina esto


apresentados na Tab. 1.

Tabela 1: Composio centesimal das fontes proteicas in natura, dietas casena e


spirulina e caseina e spirulina em lipossomas.

Umidade Cinzas Protenas Lipdios Carboidratos

Caseina * 10,511,64b 2,020,02 b 77,331,01a 0,300,03 b 9,840,00b

Spirulina LEB-18* 11,950,09b 10,880,08b 60,36 6,66a 3,05 0,11b 13,760,00b

Dieta Caseina 9,900,004b 2,890,049b 16,680,11 7,41 0,11b 63,120,00a


a a b a a
Dieta Spirulina 10,40 ,01 3, 67 0,32 13,610,67 16,380,098 55,940,00

Caseina em 18,017,41a 22,932,63a 2,750,31b 19,317,55a 37,000,11a


lipossomas

Spirulina em 16,126,63a 30,950,15a 2,08 0,48b 18,952,95a 31.900,00a


lipossomas

Fontes proticas; Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena significativa pelo teste de
Tukey (p<0,05). Carboidratos=100-(Umidade%+Cinzas%+Proteinas%+Lipidios%)

As fontes proticas avaliadas diferiram estatisticamente no teor de cinzas e


lipidios, porm todos os valores eto de acordo com a FDA(2003) para microalgas.
Quando analisadas estatisticamente, as dietas diferiram significativamente
(p0,05) entre si em relao aos parmetros avaliados: umidade, protena e teor
lipdico. O contedo de cinzas da dieta spirulina foi significativamente superior (p0,05)
para a caseina, indicando a contribuio intrnseca da spirulina LEB-18.
Segundo Donato et.al (2010),na busca de uma fonte proteica de rpida reproduo
e boa qualidade, a alga Spirulina surge como uma alternativa deste nutriente
atendendo estas exigncias, sendo comparada com uma protena de alto valor
biolgico como a casena.

Na Tabela 1 todos os parmetros avaliados diferiram estatisticamente, sendo o


teor de umidade referente spirulina e casena ambas em lipossomas foram de 16,12
% e 18,01% respectivamente estando estas, compostas por uma soluo aquosa,
denominada tampo fosfato pH 7,0. Confirma-seo alto teor lipdico da casena e
spirulina encapsuladas, devido ao filme lipdico ser composto de lecitina de soja
parcialmente purificada. A quantidade de cinzas encontrada na amostra de casena e
spirulina ambas encapsuladas se deve provavelmente ao tampo fosfato utilizado para
95

auxiliar na homogeneizao da mesma com o lipossoma. J o baixo teor protico


encontrado para ambas fontes proteicas, possivelmente refere-se quantidade de
spirulina e casena que podem ser incorporadas na cpsula.
A tabela 2 apresenta dados relacionados ao coeficiente de eficincia alimentar.
Tabela 2: Pesos iniciais e finais, ganho de peso (g), Consumo alimentar total (g), e
Coeficiente de eficincia alimentar de ratos fmeas (Rattus norvegicus) linhagem
wistar, alimentados com dietas controle, aprotica e base de spirulina.

Parmetros avaliados Casena Spirulina


a
Peso inicial 54 8,58 51 10,33a

Peso final 109,2 8,32a 96,33 10,91a

Ganho de peso total 59,6610,54 a 45,338,38b

Consumo alimentar 108,42 14,21 104,150,56ab

CEA* 0,51a 0,43 a


Os valores correspondem mdia com estimativa de desvio padro (n=6);Mdias na mesma linha que possuem let ras
distintas diferem significativamente entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05); CEA*: Coeficiente de Eficincia Alimentar =
ganho de peso / consumo alimentar.

Com relao ao peso final dos animais que receberam as dieta a base de casena,
e de spirulina, no diferirem estatisticamente. J o ganho de peso total entre os grupos
estudados apresentou diferena significativa (p<0,05) entre eles. Segundo Nagaoka et
al.(2005), em sua pesquisa, onde tambm comparavam animais que receberam dietas
casena e spirulina, verificaram que no houve diferena significativa entre os grupos
experimentais com rela ao ganho de peso.
Rogatto et al. (2004)obteve CEA de 0,21, no seu estudo com uma dieta com 17%
de Spirulina em substituio total protena da dieta controle (casena) em ratos
machos jovens Wistar durante cinco semanas. Os resultados encontrados para o CEA,
neste estudo, demonstraram que a protena da dieta com spirulina foi to bem
aproveitada biologicamente quanto protena padro de casena (recomendada para
o grupo em estudo), e que a dieta estava bem equilibrada nutricionalmente, apesar da
diferena observada no consumo e no ganho de peso.
Estas fontes proteicas verificadas in vivo, aps foram encapsuladas em
lipossomas, posteriormente sendo analisados o tamanho mdio e a polidisperso e
microscopia eletrnica de varredura.
Para o preparo dos lipossomas, a escolha pelo mtodo de hidratao do filme
lipdico ocorreu em funo deste ser um mtodo simples e de baixo custo, que no
96

requer equipamentos especializados, sendo um mtodo muito eficaz em escala


laboratorial (SANTOS, 2002).
Para verificar a distribuio do tamanho das vesculas foi determinada por
espalhamento dinmico de luz, tcnica que emprega autocorrelao para analisar as
flutuaes na intensidade da luz espalhada gerada pela difuso das vesculas em
disperso, fornecendo o dimetro mdio das vesculas(CHONG, 1976). Na Tabela 3
esto apresentados os resultados obtidos no tamanho mdio e polidisperso do
controle,ou seja, somente lipossomas sem amostra, casena e spirulina pura e
encapsuladas.

Tabela 3. Tamanho mdio e polidisperso do controle,spirulina e casena pura,


lipossomas de casena e spirulina LEB-18.

Analises Controle C.P. C.Enc. S.P. S.Enc

Tamanho 203,07b 195,6b 263,78a 215b 304a


mdio(nm)

Polidisperso 0,194a 0,429b 0,444b 0,432b 0,287a

Obs:Controle-Lipossomas.C.P.-Caseinapura;C.Enc.Caseinaencapsulada;S.P.-Spirulina pura;
S.Enc-Spirulina Encapsulada;Letras diferentes na mesma linha indicam diferena estatstica pelo
teste de Tukey( <0,05).

Diante dos resultados apresentados na tabela 3, observou-se que houve


diferena estatstica nas amostras encapsuladas com as controle, caseina e spirulina
pura, assim verificou-se que a casena e spirulina encapsuladas apresentaram maior
tamanho das partculas. Gcer et al.(1993) que presumiram que o cloreto de
benzalcnio, devido a sua estrutura anfiflica, incorpora-se estrutura da bicamada,
provocando aumento no dimetro dos lipossomas.
Resultados semelhantes foram obtidos por Chorilli et al.(2007) observou que a
presena de cafena (CAF) aumentou o dimetro dos lipossomas, este resultado
possivelmente deve-se ao fato de que a CAF, por ser uma substncia ativa lipoflica,
se insere na estrutura da bicamada, provocando um aumento no dimetro dos
lipossomas.
J com relao polidisperso observada, constata-se que a amostra controle e
spirulina encapsulada diferiram estatisticamente das amostras casena pura, casena
encapsulada e spirulina pura. Contudo, os resultados mostraram um baixo grau de
polidispersidade, indicando que as preparaes so bastante homogneas com
97

relao distribuio de tamanho. Tal resultado est de acordo com os encontrados


por Lima (1995), que afirma que SUV apresentam boa homogeneidade com relao
distribuio de tamanho.
As figuras a seguir representam as micrografias de casena e spirulina pura e
casena e spirulina encapsulada em lipossomas. Os encapsulados observados MEV
possuem espessuras de aproximadamente 280 nm.

Figura 1: Micrografia da Casena pura (C.P) e Casena encapsulada liofilizada (C.E)

Comparando a micrografia com o tamanho das partculas observa-se que ambas as


amostras apresentaram tamanho nanomtrico, confirmando-se tambm, por meio das
micrografias, o efeito do processo de secagem por liofilizao, na morfologia das
nanopartculas. Conforme Cacela e colaboradores (2006) a vantagem da liofilizao
reside no aumento da meia vida da formulao lipossmica, pela sua maior
estabilidade em estado seco, podendo ser reconstituda com o veculo na hora da
administrao.
A figura 2 apresenta as microcrafias da spirulina LEB-18 e spirulina encapsulada.

Figura 2. Micrografias da Spirulina in natura e dos lipossomas de Sprulina .


98

Pode ser observado nos lipossomas de spirulina que estes apresentaram com
formato cilndrico e aparentemente encapsulado. Segundo Morais (2003), uma das
vantagens associadas ao emprego de lipossomas refere-se preservao da
qualidade nutricional dos hidrolisados de casena. Pesquisas revelam que a
encapsulao aumenta a estabilidade de carotenoides, antocianinas e betalainas
(AZEREDO, 2005).

4 CONCLUSES

Os resultados obtidos neste trabalho levam a concluir que a dieta base de


spirulina em comparao casena no afetou significativamente o consumo alimentar
total e o ganho de peso dos animais, promovendo valores de coeficiente de eficincia
alimentar muito prximos casena
Como tambm, pela metodologia utilizada foi possvel obter partculas proticas de
Casena na escala nanomtrica,como ao mesmo tempo, conclui-se que a lecitina de
soja bruta uma possibilidade vivel no emprego para encapsulao de Caseina e
spirulina, possibilitando mascarar o sabor e aroma deste material, pois, sua incluso
em futuras formulaes alimentcias contribuindo tecnologicamente no processamento
de alimentos e nutricionalmente na dieta.
99

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Agradecimentos:CNPQ,CAPES,UFPEL e FURG
101

ARTIGO 5- INFLUNCIA DA CIANOBACTERIA (Spirulina LEB-18) NO


METABOLISMO DE RATOS FMEAS WISTAR

ADRIANA RODRIGUES MACHADO*; MAIRA PERES MENDES; LETICIA MARQUES


DE ASSIS; ROSANE DA SILVA RODRIGUES; MIRIAN RIBEIRO GALVO
MACHADO;LEONOR ALMEIDA DE SOUZA - SOARES

Resumo

A Spirulina uma cianobactria consumida h milhares de anos por Astecas e Maias


como fonte de alimentao primria. A microalga poder ser a melhor opo, como
alternativa para produo de biomassa alimentar em regies ridas com escassez de
gua, pelo seu alto valor protico (50 a 70%). Objetivo do estudo foi verificar o
Quociente de Eficincia Lquida e avaliaes bioquimicas no sangue de ratas
Wistar/Ufpel.As analises realizadas foram, Quociente de eficincia liquida (NPR);
Coeficiente de eficincia alimentar(CEA). Para a transformao da spirulina em
tamanho nano,de acordo, foram tomados 4 g de spirulina micromtrica dissolvida em
100mL de soluo tampo fosfato, concentrao 0,2M, pH 7,0, procedeu-se o
aquecimento do balo a 60C, em banho-maria, e agitao em vortex. Posteriormente
a amostra foi conduzida ao Ultra turrax, para homogeneizao das partculas, a 10000
rpm, por 20 minutos. Foram utilizadas 24 ratos fmeas da espcie Rattus norvegicus,
Albinus, cepa Wistar/UFPEL com aproximadamente 57,97g e recm desmamados aos
21 dias de vida. Os animais foram divididos em quatro grupos (n=6): Grupo Controle
com dieta base de casena (C); grupo spirulina (Sp) com dieta base de spirulina,
grupo spirulina nano(Sn) e o grupo aproteico(A), recebendo dieta isenta de protena e
isocalricas por 15 dias. Para determinao dos indicadores biolgicos da protena
utilizou-se Reteno Protica Lquida (RPL) (do ingls Net Protein Retention -NPR) ; e
o Coeficiente de Eficcia Alimentar (CEA) aps 15 dias. Ao final do ensaio, os animais
foram eutanasiados por decaptao previamente para a coleta sangnea, o sangue
coletado foi centrifugado a 1000g, por 15min. a 4C, separando-se o soro o qual foi
congelado (-20C) para anlise posterior, para determinao de dois modos: em
ependorfs com EDTA para anlises de hemograma e para obteno do soro, protenas
totais e colesterol.Os resultados para o coeficiente de eficincia alimentar no
apresentaram diferena significativa para os grupos casena, spirulina e spirulina
nano.Foi verificado o Quociente de Eficincia Lquida para os grupos caseina, spirulina
e spirulina nano, onde apenas a spirulina em tamanho nano diferiu das demais,
obtendo tambm um valor nmerico alto de NPR. J as avaliaes bioquimicas (teores
de hemoglobina, hematocrito, albumina e proteinas totais) para os grupos que
receberam dietas Caseina, aproteica, spirulina e spirulina nano, no diferiram
estatisticamente. Portanto as dietas fornecidas aos grupos estudados no diferiram na
sua grande maioria nos coeficiente de eficiencia alimentar. Com relao aos
resultados bioqumicos de hematcrito(%); hemoglobina, protena total (g/dL) e
albumina (g/dL) pode-se concluir que os resultados dos grupos experimentais
avaliados foram prximos aos do grupo casena.

Palavras-chave: dietas, sangue, protena e biomassa.


102

1 INTRODUO

Microalgas so microrganismos fotossintticos com requerimentos nutricionais


relativamente simples e cuja biomassa pode ser empregada para obteno de
biocompostos, como suplemento alimentar humano, alimento animal ou fonte de
biocombustveis. A Spirulina uma cianobactria consumida h milhares de anos por
Astecas e Maias como fonte de alimentao primria ( ANNAPURA VV,et al. 1991).
Segundo Macedo e Alegre (2001) citando Mendes (1992), foi observado que o
contedo de lipdios da Spirulina aumenta com a diminuio da concentrao de
nitrato no meio de cultivo e a reduo da temperatura, efeito este que foi mais intenso
que o obtido com a reduo da temperatura apenas.
A utilizao de protenas unicelulares como ingrediente de alimentos est
condicionada funcionalidade de seus constituintes. Neste sentido, a caracterizao
da frao protica um fator relevante no desenvolvimento de ingredientes proticos,
a serem utilizados na formulao de alimentos (ANUPAMA e RAVINDRA,
2000;CHRONAKIS,2001;GUIL-GUERREERO et al., 2004).
Contudo, a utilizao de spirulina como alimento tem sido exaustivamente
discutida na literatura especfica (TRANQUILLE, et al.,1998; GRISTEAD,et al.,2000).
Alm de ser uma boa fonte de protenas, minerais e vitaminas, a spirulina no
apresenta toxicidade para seres humanos e no traz prejuzos para o desenvolvimento
de rgos e tecidos (SALAZAR et al.,1998). O objetivo do estudo foi verificar o
Quociente de Eficincia Lquida e avaliaes bioqumicas em ratos fmeas wistar.
103

2 MATERIAIS E MTODOS

2.1 Obteno da materia prima

A biomassa da microalga Spirulina LEB-18 foi fornecida pelo Laboratrio de


Engenharia Bioqumica (LEB cepa-18),isolada da lagoa Mangueira,localizada em
Santa Vitria,RS,Brasil (MORAIS et al , 2008) e suplementada com 20% do meio
Zarrouk (COSTA et al., 2004).

2.2 Preparo das Dietas

As dietas foram balanceadas segundo as recomendaes de (REEVES et


al.,1993) preparadas com 12% de protena para adequar a metodologia utilizada(
Tabela 1). Os valores obtidos para as dietas Spirulina in natura e spirulina nano
respectivamente foram: protena 15,25% e 10,76% e lipdios 5,58% e 5,63%. O leo
de soja foi usado como fonte de lipdios para as dietas.

2.3 Transformao da Spirulina platensis em Spirulina nanomtrica

Para a transformao da spirulina platensis em tamanho nano,de acordo com


Malheiros(2010), foram tomados 4 g de spirulina in natura dissolvidas em 100mL de
soluo tampo fosfato, concentrao 0,2M, pH 7,0, procedeu-se o aquecimento do
balo a 60C, em banho-maria, e agitao em vortex. Em seguida a amostra foi
conduzida ao Ultra turrax, para homogeneizao das partculas, a 10000 rpm, por 20
minutos.
2.4 Animais

Foram utilizadass 24 fmeas da espcie Rattus norvegicus, Albinus, cepa


Wistar/UFPEL com aproximadamente 57,97g e recm desmamados aos 21 dias de
vida. Os animais foram divididos em quatro grupos (n=6): Grupo Controle com dieta
base de casena (C); grupo spirulina (Sp) com dieta base de spirulina,grupo spirulina
nano(Sn) e o grupo aproteico(A), recebendo dieta isenta de protena e isocalricas por
15 dias. O grupo aprotico utilizado para clculo de NPR (Quociente de Eficincia
Lquida). Todos os grupos receberam gua e dieta ad libitum. Os animais foram
mantidos em gaiolas metabolicas individuais, em ambiente com temperatura constante
(24C 2C) e iluminao adequada (ciclo claro e escuro de 12 em 12 horas).
104

Todos os procedimentos experimentais obedeceram s normas da Comisso de


tica e Experimentao Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas (Registro
do protocolo n23110.000978/2010-91).

2.5 Mtodos de Avaliao Biolgica

Para determinao dos indicadores biolgicos da protena utilizou-se Reteno


Protica Lquida (RPL) (do ingls Net Protein Retention -NPR) ; e o Coeficiente de
Eficcia Alimentar (CEA) aps 15 dias. No final do ensaio, os animais foram
eutanasiados por decaptao previamente para a coleta sangnea, o sangue coletado
foi centrifugado a 1000g, por 15min. a 4C, separando-se o soro o qual foi congelado
(-20C) para anlise posterior, para determinao de dois modos: em ependorfs com
EDTA para anlises de hemograma e para obteno do soro, protenas totais e
colesterol.

Tabela 1 Formulao das dietas utilizadas durante o experimento (g/Kg)


Ingredientes Caseina Aproteica Spirulina nano Spirulina

Spirulina in natura _ _ - 200

Spirulina em tamanho - - 80 -
nano
Caseina 200 _ 80 -

Oleo de soja 70 70 70 70

Mistura mineral 35 35 35 35

Mistura vitaminica 10 10 10 10

L-cistina 3,0 3,0 3,0 3,0

Bitartarato de Colina 2,5 2,5 2,5 2,5

Sacarose 100 100 100 100

Fibra de trigo 50 50 50 50

Amido de milho 529,5 670,5 569,5 529,5


105

2.6 NPR- Quociente de Eficincia Lquida/ Reteno Protica Lquida (NPR)

Utilizou-se o parmetro Reteno Protica Lquida (NPR) ou o Quociente de


Eficincia Lquida, o qual uma modificao do PER (Quociente de Eficincia
Protica). Este mtodo tem a durao de 15 dias e utiliza, alm das dietas a serem
testadas, um controle negativo, constitudo por animais sem fonte protica na dieta, e
um controle positivo, constitudo por uma dieta base de casena (padro). O NPR
calculado atravs da seguinte frmula, conforme Bender e Doell (1957):

GanhoPeso Teste ( g ) PerdaPeso Aprotica (g)


NPR
Pr otena consumida (g)

2.7Anlise estatstica
Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, verso 7.0
(STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de Tukey (p
< 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.

3 RESULTADOS E DISCUSSES

As tabelas 2, apresentam respostas nutricionais de ratos Wistar submetidos as


diferentes dietas experimentais durante 15 dias.

Tabela 2: Resultados do Quociente de Eficincia Lquida-NPR em ratos fmeas


wistar cepa UFPEL
Grupo Ganho de Perda de Protena CEA NPR
peso peso (g) do consumida (g)
grupo pelos grupos
(PF-PI) aprotico experimentais

Caseina 77,00a - 15,59a 0,37a 5,77b

Aproteico 21,00b 13,00 1,45c 0,07b -

Spirulina 64,86a - 15,25a 0,33a 5,10b

Spirulina 76,86a - 10,76b 0,31a 8,35a


nano
Letras distintas na mesma coluna diferem significativamente entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05).

O coeficiente de eficincia alimentar (CEA) no diferiu estatisticamente entre


as dietas estudadas. Entretanto, o CEA para a dieta spirulina nano e spirulina
106

encontram-se abaixo dos resultados obtidos por Vieira e Bion (1998) de 0,36, no seu
estudo com valor biolgico de dieta base de soja (Glycine hispide) e algaroba
(Prosopis juliflora) contudo, acima dos encontrados por Melo et al. (2007) de 0,18 e
por Chaud, Sgarbieri e Vicente (2008), de 0,30.
Silva,(2009) em seu trabalho com leite caprino em ratos fmeas wistar, encontrou
CEA em mdia de 0,13, estando abaixo do encontrado neste estudo.
A ingesto alimentar e o ganho de peso foram determinantes para os valores de
CEA observados no presente estudo para todas as dietas, uma vez que os maiores
coeficientes encontrados por outros autores relacionam-se tambm com valores
maiores para o ganho de peso com o mesmo ou menor consumo alimentar confirmado
por Machado (2007) e Pacheco et al (2007).
Conforme Chaud, Sgarbieri & Vicente (2008) a reduo da eficincia alimentar
ocorre devido diminuio metablica do organismo frente determinada dieta,
causando estagnao ou reduo do peso corporal.
O NPR a tcnica utilizada para avaliar a qualidade da protena de um alimento
em relao ao padro de casena. Com isso, conforme a tabela 2 verificou-se que a
spirulina nano diferiu estatisticamento das demais dietas, possivelmente pela
complementao com casena. Gomes et al. (2000) em seu trabalho com ratos
encontraram valores de NPR a 4,70 para casena, 2,70 para farelo de soja no tratado
com bipiridilios, 2,60 para o tratado e 3,70 para o mesmo produto peletizado e tratado.
J Souza et al.(2000) em seu estudo sobre sintese e caracterizao nutricional de
plasteina obtida da proteina da folha de mandioca , da soja, e do soro de queijo obteve
para caseina 4,03 e sobrenadante plasteina 3,80 e plasteina precipitada 3,75, sendo
que estes dados esto abaixo do encontrado neste estudo com spirulina. Outro
estudo com Avaliao protica de uma nova multimistura com base no milho QPM BR
473 (GLRIA et al, 2004), constatou que as multimisturas lacteas+QPM e
Multimistura. Proposta apresentaram respectivamente 2,44 e 2,61, assim verificando
que no houve diferena significativa com a caseina que apresentou 2,74 em suas
avaliaes.
As tabelas 3, 4, respectivamente, demonstram os dados das avaliaes
bioquimicas, colesterol total de ratas fmeas wistar submetidos as diferentes dietas.
107

Tabela 3:Resultados das avaliaes hematolgicas em ratos

Indicadores

Grupo Hematcrito Hemoglobina Albumina Proteinas Eritrocitos Basfilos


totais
(%) (g/dL) (g/dL) (106/mm3) (%)
(g/dL)
a a a a a
Caseina 39,762,20 12,90,84 3,320,16 6,120,31 7,060,25 0
a a a a a
Aproteica 38,62,83 12,661,34 3,131,82 6,1213,93 7,130,64 0

Spirulina 39,581,78 a 12,840,66 a 3,300,15a 5,720,18a 7,080,42a 0

Spirulina 41,13,18 a 13,581,34 a 3,220,095a 5,920,29a 7,490,32a 0


nano
Os valores correspondem mdia com estimativa de desvio padro (n=6);Mdias na mesma coluna que
possuem letras distintas diferem significativamente entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05).

Os valores para hematcrito, para todos os ratos que consumiram diferentes


dietas no houve diferena significativa. O hematcrito (Ht) o resultado da proporo
entre o volume dos eritrcitos e do sangue total, sendo expresso como uma
porcentagem (%) do sangue total. O hematcrito obtido atravs de puno venosa e
cutnea (polpa digital) correlaciona-se bem (NETO et al 2011). Miller (1993), relatou
que o valor de hematcrito reflete a massa total de clulas na unidade de volume de
sangue, mostrando fundamental importncia no estudo de todos os tipos de
anemia,alm disso, seus resultados esto menos sujeitos a erros do que a contagem
de hemcias. Portanto,os valores de hematcritos para roedores variam entre 36 e
48% (HARKNESS & WAGNER, 1993), comprovando assim nveis fisiolgicos de
hematcrito em todos os grupos e concordando com outros estudos (BOAVENTURA
et al., 2003; DUARTE et al., 2009).
Pode-se afirmar que a hemoglobina dos ratos que receberam diferentes dietas no
diferiram estatisticamente, estando de acordo com os valores encontrados por
Marco(2008), no seu trabalho sobre a avaliao de nutrientes em multimisturas
acrescidas de spirulina platensis, que foram 13,4 a 14,5g/dL. Bernardi et.al (2009),
tambm no obteve diferena significativa em seu estudo no perfil nutricional e srico
de ratos. Contudo, valores de hemoglobina para roedores oscilam de 11 a 18%(
HARKNESS & WAGNER, 1993). Estudos comprovaram que o uso de Spirulina numa
concentrao bem superior a deste estudo(24%) em associao com produtos
vegetais apresentaram teores de hemoglobina aumentados em ratas durante a
gestao e lactao (KAPPOR E MEHTA,1993).
108

De acordo com Marco (2008) citando Sanchis e Silbiger(1986), a albumina


plasmtica boa indicadora do estado nutricional e, neste caso , os valores de ambos
ndices apresentam-se dentro dos padres de normalidade para a espcie em estudo.
Santos et al.(2004) encontrou para albumina 3,01g/dL para a dieta caseina e 2,68g/dL
para dieta suplementada com multimistura, estando este valor proximo aos deste
estudo. Conforme a literatura ratos sadios apresentam teor de albumina na faixa de
3,4 4,3g.dL-1 (MORTON et al., 1993; SOUZA-SOARES, MACHADO & RODRIGUES,
2009). Os resultados obtidos esto de acordo com os encontrados por Moreira (2010),
que verificou o efeito de diferentes concentraes de spirulina nos perfis bioqumico,
hematolgico e nutricional de ratos wistar nutridos e desnutridos,abaixo do mnimo
estabelecido (3,4g/dL).
Com relao s protenas totais, deste estudo, apresentadas na tabela 4 (5,72-
6,12gdL-1), no houve diferena significativa. J uma dieta creche suplementada com
multimistura, apresentou protenas totais inferiores a este estudo, no qual encontraram
valores de 4,48g/dL e para dieta casena 5,53g/dL(SANTOS et.al, 2004). Segundo
Luciano e Rostem de Mello(1998), em seu estudo sobre atividade fsica e
metabolismo de protenas em msculo de ratos diabticos experimentais , obtiveram
valores para o grupo controle sedentrio e treinado apresentaram 7,16 e 8,70 g/dL e
diabticos sedentrios e treinados em torno de 6,65 e 8,47g/dL. Moreira (2010),
verificou em seu trabalho sobre efeito de diferentes concentraes de spirulina, em
torno de 6,00-6,11g/dL de proteinas totais no sangue.
Quando comparados aos valores dos parmetros hematolgicos da literatura,
percebe-se que os eritrcitos apresentados neste estudo, demostrados na tabela 3,
esto de acordo com Sanchis & Silbiger (1986), citado por Souza-Soares; Machado &
Rodrigues (2009),de 7 a 10milhes/mm de eritrcitos. Contudo, os eritrcitos ou
hemcias so os elementos figurados presentes em maiores quantidades no sangue e
sua baixa contagem indica deficincia em ferro e estado anmico.
Os basfilos (tabela 3), desempenham papel importante nas respostas imunitrias
corporais, pois ao menor contato com uma substncia alergnica liberam mediadores
qumicos, como a histamina, a qual atrai as demais clulas de defesa (MILLER, 1993).
Conforme Sanchis & Silbiger (1986 APUD SOUZA-SOARES; MACHADO &
RODRIGUES, 2009) e Anthony et al. (2006) preconizam como valores normais a faixa
entre 0 e 1% de basfilos, os quais no foram detectados nos animais em estudo.
Portanto, os basfilos, para ratos so, aparentemente, raros ou poucos; sendo esta
escassez circulante uma caracterstica para a classe dos mamferos, de uma forma
geral (MESSIAS et al.2009).
109

Tabela 4:Resultados das determinaes de Triacilglicerois e Colesterol total no soro

Grupos Colesterol total (mg/dL) Triacilgliceris mg/dL

Casena 77,6610,87a 7320,67 a

Aprotica 38,3333,92b 99,0029,54 a

Spirulina 93,1610,11a 80,6625,35 a

Spirulina nano 83,5013,22a 70,0022,29 a


Letras distintas,na mesma coluna, diferem significativamente entre si pelo Teste

de Tukey (p<0,05).

Os valores de triacilgliceris, assim como de colesterol total, conforme a tabela


4, no diferiram significativamente entre os grupos em estudo. Marco (2008), em seu
estudo sobre a biodisponibilididade de nutrientes em multimisturas, obteve respostas
de colesterol total, em mdia 70,5 mg/dL, abaixo ds encontradas neste trabalho.
Assim como Moreira (2010), no seu estudo sobre o efeito de diferentes concentraes
de spirulina nos perfis bioqumico, hematolgico e nutricional de ratos wistar nutridos e
desnutridos tambm apresentaram-se abaixo. Denardin et al. (2009) encontraram
62,67 e 72,93mg/dL de colesterol total em ratos Wistar alimentados com dieta com
arroz e macarro em substituio casena, respectivamente. Sendo que o
encontrado neste estudo esto numa faixa de 77,00; 93,16;83,50mg/dL , para caseina,
spirulina e spirulina nano, respectivamente.
110

4 CONCLUSO

As dietas fornecidas aos grupos estudados no diferiram na sua grande maioria


nos coeficientes de eficincia alimentar, assim os resultados mostraram que tanto a
spirulina nano quanto a micro foram capazes de promover o crescimento dos ratos,
alcanando resultados comparveis casena. Com relao aos resultados
bioqumicos de hematcrito (%); hemoglobina, protena total (g/dL) e albumina (g/dL)
pode-se concluir que os resultados dos grupos experimentais avaliados foram
prximos aos do grupo casena. Logo, as dietas contendo spirulina tanto em tamanho
micromtrico quanto nanomtrico foram eficientes neste estudo. Devido a estes
fatores pode-se afirmar que a spirulina nos diferentes tamanhos foram eficientes,
apresentando respostas semelhantes ao controle
111

Abstract

INFLUENCE OF CYANOBACTERIA (SPIRULINA LEB-18) ON THE METABOLISM


OF FEMALE WISTAR RATS

Spirulina is a cyanobacteria consumed for thousands of years by the Aztecs and


Mayans as a primary power source. The microalgae may be the best option as an
alternative food for biomass production in arid regions with scarce water, for its high
protein content (50-70%). This study aimed to verify the Efficiency Ratio and Net
bioquimicas.As analysis Predictive scores were made, net efficiency ratio (NPR), feed
efficiency coefficient (CEA). Results for the food efficiency ratio were not significantly
different for groups casein, spirulina and spirulina nano.Foi checked the Net Efficiency
Ratio for groups casein nano spirulina and spirulina, spirulina where only the nano-size
differed from the others, obtaining a value too high number of NPR. Since biochemical
evaluations(hemoglobin, hematocrit, albumin and total protein) for the groups that
received diets Casein, no protein, spirulina and spirulina nano, both did not differ
statistically.Therefore, the diets given to groups did not differ mostly in the food
efficiency ratio. Regarding the results of biochemical hematocrit (%), hemoglobin, total
protein (g / dL) and albumin (g / dL) can be concluded that the results of the
experimental groups were assessed closer to the casein group and no protein.

Keywords: diet, blood, protein and biomass.


112

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116

Captulo IV
117

Concluses Gerais

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as dietas fornecidas com a


incluso de spirulina, spirulina em tamanho nanometrico e caseina no alteram o
indice glicmico das ratas, nas condies realizadas.
As avaliaes das dietas contendo spirulina em tamanho micro e
nanomtrico indicam que houve aumento de peso nos animais que as ingeriram,
contudo, os mesmos no mostraram alteraes de comprimento e circunferncia de
abdmen quando comparados aos demais.
Com relao s avaliaes bioqumicas no soro os grupos no diferiram
estatisticamente.
Os animais evidenciaram determinado grau de leso heptica, as quais foram
bastante heterogneas quanto ao padro e intensidade. Podendo ser decorrentes de
deposio lipdica, mais evidenciada na dieta aproteica, provavelmente ocasionada
pela deficincia de protena e consequentemente pelo decrscimo na produo e
exportao de lipoprotenas pelo figado.
J na avaliao de uma metodologia utilizada para nano encapsulao de fontes
proticas como a caseina e spirulina, verificou-se que foi possivel obter particulas
proticas em escala nanomtricas.
A lecitina de soja parcialmente purificada, tambm denominada fosfatidilcolina
uma possibilidade vivel, na aplicao como material de parede para a formao de
lipossomas, ou seja, no emprego para encapsulao de caseina e spirulina.
Contudo, a evoluo da nanotecnologia tem sido expressiva nos ltimos anos, com
relao aos parmentros avaliados neste estudo, pode-se salientar que a
nanotecnologia apresenta oportunidades para tecnologia de alimentos em reas tais
como encapsulao e libertao controlada de materiais alimentares, bem como a
estabilidade e durabilidade dos ingredientes sensveis.
118

Captulo V
119

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Apndice
134

Apndice 1-PARECER DO COMIT DE TICA EM EXPERIMENTAO ANIMAL


DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS, RS BRASIL