SECUENCIACION

YIOVANIS DE JESUS PEREZ

RUDDY ENRIQUE GUTIERREZ

CORPORACION UNIVERSITARIA RAFAEL NUEZ

FACULTAD DE MEDICINA
SEMESTRE II
2016
1. El mtodo de degradacin qumica (Maxam and Gilbert, 1977).

En este mtodo, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los

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extremos 5 o 3 de una o ambas hebras con P. Despus, la muestra de ADN se
divide en cuatro alcuotas y se fragmenta en cuatro reacciones qumicas distintas.
Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por
electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamao. Conociendo el
nucletido en el
que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molcula original
(figura 4). Las reacciones qumicas que se utilizan para fragmentar la molcula
de ADN son las siguientes:

1. Corte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil
sulfato (DMS). Despus, la reaccin es tratada en condiciones alcalinas; la
molcula de ADN se fragmenta en las purinas metiladas. Como resultado, se
obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las
cuales se metilan 5 veces ms rpido), y bandas claras que corresponden a las
adeninas. Para interpretar fcilmente el patrn de banda

generadas, se puede comparar contra un tratamiento que favorezca el corte de

las adeninas.

2. Corte de adeninas. Esta reaccin es una variacin de la anterior.

Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un cido diluido. Esto favorece el
corte de las adeninas metiladas. Despus de un tratamiento alcalino las guaninas
tambin son cortadas. Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y
claras que tambin corresponden a las adeninas, y las guaninas,
respectivamente.

3. Corte de pirimidinas. Esta reaccin utiliza el reactivo hidracina, que corta las
bases citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina para completar la
reaccin.

4. Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reaccin de hidracina con

tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos
que terminan en citosina.

Desde que se reporto este mtodo, no se han encontrado reactivos qumicos

especficos que corten las bases A o T, por lo que se utiliza la estrategia de
corte descrita en la figura 4. Esta estrategia permite distinguir entre los
nucletidos que se encuentran al final de cada corte y deducir la secuencia de
ADN
SECUENCIACION DEL ADN

El ADN es una de las molculas ms importantes para la vida, est formada por una
doble hlice cada cadena es un polmero de miles y millones de nucletidos, a su
vez cada nucletido est formado por una base nitrogenada(adenina A, Guanina
G, Citosina C Y Timina T), azcar desoxirribosa y un grupo fosfato. La posicin
de los nucletidos en la cadena de ADN se les denomina secuencia. Las tcnicas y
mtodos utilizados para saber cada secuencia de nucletidos en la cadena de ADN
se le denomina secuenciacin.

A partir de descubrimiento de la estructura de molcula de ADN en 1953 por

(Watson and Crick) hace ms de 50 aos era muy difcil, complicado y costoso
obtener una secuenciacin de 5 a 10 nucletidos, pero los avances cientficos y
tecnolgicos permitieron tener una secuencia con importancia mdica, ecolgica,
evolutiva y fisiolgica.

Es una tcnica en la que se hace un anlisis ms detallado de la estructura del ADN

y consiste en un conjunto de tcnicas y mtodos bioqumicos que nos permiten
averiguar la secuencia de los nucletidos (A, C, G, T) en el ADN.

3
 1 2 3 4

Figura 4. El mtodo de Maxam y Gilbert para secuenciar ADN. Los nmeros de

los carriles en el gel corresponden a los distintos tipos de corte que se describen
en el texto.

Ventajas y desventajas del mtodo de degradacin qumica.

La baja resolucin obtenida cuando se report la tcnica no se debi a un
factor inherente al mtodo de Maxam-Gilbert, si no a una limitante de los geles
de acrilamida. En un inicio, se consideraba un logro poder diferenciar el tamao
de 250 fragmentos y determinar la secuencia de ese tamao. El anlisis de una
secuencia en geles de acrilamida era complicado, ya que no se poda separar los
fragmentos grandes. Otro problema que comnmente afecta la resolucin de las
bandas obtenidas en el gel es el ensanchamiento de bandas cuyas secuencias
favorecen la formacin de estructuras secundarias. Para mejorar la resolucin
del gel se ha reportado que el uso de geles de acrilamida muy delgados, en
conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas ms delgadas y
mejor separadas (Sanger y Coulson, 1978).

Otro aspecto del mtodo de Maxam-Gilbert que puede ser un poco

laborioso es la necesidad de separar y analizar individualmente las hebras del
ADN que se quiere secuenciar (Sanger et al., 1977). Esto se puede realizar
mediante enzims de restriccin (figura 5) que separen los extremos
etiquetados para el anlisis. Alternativamente, las dos hebras marcadas
pueden ser desnaturalizadas y separadas en un gel (Maxam y Gilbert, 1977).

Hoy en da, el mtodo ms usado para la secuenciacin de cidos

nucleicos es el mtodo de Sanger. Sin embargo, es justo decir que el mtodo de
Maxam-Gilbert es el ms adecuado para determinar la secuencia de
fragmentos cortos de ADN, debido a que puede determinar la secuencia desde la
primera base. En cambio, el mtodo de Sanger slo permite la lectura a partir de
la base 10-20 (Tahara et al., 1990).

Figura 5. Las enzims de restriccin reconocen secuencias

especficas de ADN y pueden ser utilizadas para separar
las hebras etiquetadas antes de secuenciar por el
mtodo de Maxam-Gilbert.

2. El mtodo enzimtico (Sanger et al., 1977).

El mtodo de secuenciacin enzimtico sali casi al mismo tiempo que el de

Maxam y Gilbert, pero ha sido ms utilizado. Esto se debe, en gran parte, a que se
han realizado grandes avances en la automatizacin de esta tcnica, lo cual se
discutir ms adelante. El mtodo de Sanger se basa en el uso de la ADN
polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminacin especfica. Con
este mtodo se generan fragmentos de ADN de todos los tamaos posibles que
se puedan distinguir entre s, por el tipo de marcaje que llevan o por la
incorporacin de un terminador especfico. Las enzims del tipo de la ADN
polimerasa requieren de un templado de ADN de cadena sencilla, y realizan la
sntesis de la hebra complementaria extendindola a partir de un iniciador en
direccin 5 a 3. Entre los componentes de la reaccin se incluyen nucletidos que
no tienen un grupo hidroxilo en su extremo 3 (ddNTP), para poder obtener una
terminacin especifica en las cadenas. Una vez que el ddNTP se incorpora como
el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada contine
extendindose. La incorporacin de los ddNTPs es al azar, de tal forma que se
obtienen fragmentos de todos los tamaos posibles que terminan en un residuo
especifico.

En el mtodo de Sanger (1977), la estrategia es hacer cuatro reacciones

diferentes de sntesis de ADN, utilizando un ddNTP distinto en cada tubo. Con
la mezcla del nucletido normal (dNTP) y su
terminador (ddNTP), se pueden generar fragmentos complementarios de diferentes
tamaos que terminan en el mismo nucletido. Despus, estos fragmentos se
pueden separar en un gel de electroforesis con cuatro carriles distintos, para
determinar la secuencia del templado (figura 6).

Figura 6. El mtodo de Sanger. Cuatro reacciones con ddNTPs diferentes

permiten la sntesis de distintos fragmentos con una terminacin especfica.
Estos fragmentos se pueden separar por electroforesis y comparando los
tamaos, se puede determinar la secuencia del templado.

El mtodo de Sanger tiene varias ventajas sobre el mtodo de Maxam- Gilbert

(Blackburn y Gait, 1996). Las reacciones de secuenciacin del mtodo enzimtico se
pueden realizar en unas horas, en cambio las del mtodo de Maxam-Gilbert tardan al
menos un da. Las reacciones del mtodo de Sanger son ms puras, con menos
contaminantes que puedan afectar la resolucin del gel.

3. Limitaciones del mtodo enzimtico.

Cuando se report este mtodo para la secuenciacin de ADN, se usaba el fragmento

Klenow de la polimerasa I, y slo un ciclo de sntesis (incubando a
37 C) para obtener fragmentos de distintos tamaos. Todos los fragmentos tenan
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incorporados en sus cadenas, nucletidos marcados con P. El grupo
 de Sanger report que con esta tcnica se poda determinar una secuencia de
hasta 300 nucletidos, a partir de 15 bases del iniciador, aproximadamente. Al
momento de publicar esta tcnica, tambin reportaron que la mayor dificultad era
que los ddGTPs no estaban disponibles comercialmente. Desde entonces se ha
experimentado con variaciones del protocolo original y se han realizado grandes
avances en la automatizacin de este mtodo. En la tabla 1 se resumen algunos
de los avances ms importantes que han permitido el desarrollo de mtodos
automatizados para la secuenciacin de ADN.

4. MTODOS CONTEMPORNEOS EN LA SECUENCIACIN

Automatizacin del mtodo de Sanger

En la tabla 1 se resumen algunos de los avances mas importantes que han

permitido el desarrollo de mtodos automatizados para la secuenciacin de ADN
(usando el mtodo de Sanger).

Tabla 1. Descubrimientos significativos que permitieron el desarrollo de los

mtodos automatizados de secuenciacin de cidos nucleicos.

Avance Descripcin Referencia

Reaccin en Tcnica que permite la amplificacin Mullis, 1990
cadena de la exponencial de un fragmento de ADN
polimerasa
(PCR)
Polimerasa Taq Polimerasa termoestable que puede Innis et al., 1988;
utilizarse en el PCR Carballeira et al.,
1990
Marcaje del El marcaje y el tipo de deteccin utilizado Prober et al.,
ADN para identificar los fragmentos de ADN 1987; Igloi, 1998
Sintetizados
Secuenciadores Desarrollo de mquinas automatizadas Hunkapiller, et al.,
automatizados con la capacidad determinar la secuencia 1991; Lipshutz y
de miles de pares de bases por da Fodor, 1994
5. La tcnica de PCR y su relevancia en la secuenciacin de ADN.

En 1985, el qumico Kary Mullis desarroll la tcnica de la reaccin en cadena

de la polimerasa (PCR). Este mtodo permite la amplificacin exponencial
de una molcula de ADN, generando millones de copias de un fragmento. Esto
se lleva acabo con oligonucletidos que contienen un grupo extremo 3 libre,
que es complementario con la cadena molde de ADN. Los oligos funcionan
como punto de inicio para la adicin de nucletidos y para copiar la cadena
molde en el PCR. Una vez que el oligonucletido se une a su blanco, la
polimerasa de ADN puede seguir extendiendo la hebra complementaria. En
una reaccin tpica de PCR se usan dos oligonucletidos que flanquean la regin
de ADN que se desea amplificar. El nmero de copias del fragmento de ADN
que se encuentra entre los dos oligonucleotidos se amplifica con varios ciclos de
reaccin.
Cada ciclo de una reaccin de PCR
consta de tres pasos (figura 7):
1) Desnaturalizacin de las hebras
de ADN- El templado es el fragmento de
ADN que se desea amplificar, junto con
la regin que reconocen los
oligonucletidos. Para que el
oligonucletido se pueda unir, es
necesario que el templado sea de
cadena sencilla. As que este paso del
PCR es para separar las cadenas de
ADN, si el templado es de doble
cadena. Adems, en este paso se
deshace cualquier tipo de estructura
secundaria formada entre los
segmentos complementarios de los
oligonucletidos y que pudiera Figura 7. La reaccin de PCR
interferir con su habilidad de unirse al consiste en varios ciclos de 3
templado. Tpicamente, la pasos. Las temperaturas y los
desnaturalizacin del ADN se hace tiempos indicados son ejemplos y
con una incubacin breve del tubo de varan dependiendo de las
reaccin a una temperatura de 94 C. caractersticas del ADN que se
desee amplificar.

2) Temperatura de alineamiento - Esta temperatura se calcula con base en las

caractersticas de los oligos que sern utilizados. La temperatura a la cual la
mitad de los oligos estn unidos a su blanco (Tm), se calcula tomando en cuenta
el tamao de los oligos y su contenido de GC (%GC). Despus de
desnaturalizar las hebras de ADN, se incuba a una temperatura cercana a la Tm,
para que los oligos puedan encontrar su regin complementaria en el templado.
y se unan a ella.

3). Extensin de la cadena de ADN - Este es el ltimo paso de un ciclo de

reaccin de PCR y normalmente se hace a 72 C, la temperatura ptima para la
polimerasa de ADN. En este paso, la polimerasa extiende la cadena
complementaria del templado. La sntesis de la cadena complementaria tiene
como punto de inicio el complejo oligonucletido/templado. El tiempo de
incubacin de este paso depende del tamao del segmento que se desea
amplificar. Como regla general se considera que la polimerasa puede sintetizar
1,000 bases por minuto. En la reaccin de PCR, tpicamente, se llevan acabo de
30 a 40 ciclos de estos tres pasos, para lograr la amplificacin deseada.

La tcnica de PCR result relevante para la secuenciacin de cidos nucleicos

debido a que se adapt al mtodo de Sanger, de tal forma que se puede
sintetizar un mayor nmero de copias de los fragmentos con una terminacin
especfica. De esta forma, la seal del marcaje que lleva cada fragmento
aumenta, y es posible obtener lecturas ms claras de los fragmentos grandes, lo
que a su vez, permite la lectura de secuencias ms largas, una vez que se pueda
superar el problema de la resolucin de los geles.

5 Polimerasa Taq.

Cuando se desarroll el mtodo de secuenciacin de Sanger, se us el fragmento

Klenow de la polimerasa I de E. coli para hacer la sntesis de los fragmentos de
ADN con una terminacin especfica (Sanger et al, 1977). En
1957, se aisl la Polimerasa I y durante muchos aos se pens que era la
nica polimerasa que tena E. coli (Brown, 1999). De hecho, su actividad es tan
grande que enmscara la actividad de las otras polimerasas de esta bacteria, y
hasta que se obtuv una mutante que no produca la polimerasa I (polA), fue que
se pudieron detectar las otras enzims (Lewin, 1997). El uso de esta enzima
tiene algunas desventajas, en comparacin con las polimerasas que se aislaron de
otros organismos, aos despus. La reaccin de sntesis de ADN reportada por
Sanger en 1977, es de un solo paso, y en esta se tienen que sintetizar todas las
posibles combinaciones de fragmentos de ADN necesarios para determinar la
secuencia de un templado. La razn por la que la sntesis se realiza en un solo
paso se debe a que la temperatura ptima para la actividad de Klenow es
alrededor de 37 C (temperatura ptima de crecimiento de E. coli). Por lo tanto,
al elevar la temperatura para desnaturalizar los hbridos o estructuras
secundarias del ADN, se inactiva la Klenow, y es necesario aadir ms enzima
para hacer un segundo ciclo de sntesis de fragmentos de ADN.
El uso de la Klenow para generar fragmentos de ADN en las reacciones de PCR
y para sntetizarlo en la secuenciacin de cidos nucleicos se fue reemplazando
con otras polimerasas ms estables, aisladas de organismos termfilos. Una de
las polimerasas ms conocidas, fue aislada de Thermus aquaticus, y se le dio el
nombre de Taq (Innis et al., 1988). Dedido a que esta enzima es resistente a
altas temperaturas, fue posible automatizar la reaccin de PCR, sin necesidad de
aadir enzima nueva en cada ciclo de reaccin. La temperatura de extensin de
las cadenas de ADN se realiza a 72 C, en lugar de 37 C. Al hacer el
alineamiento de los oligos a una temperatura ms elevada, se obtiene una
mayor especificidad y homogeneidad en los fragmentos generados para la
reaccin.

Las polimerasas termoestables que se caracterizaron a finales de los

80s contribuyeron a optimizar el mtodo de Sanger para secuenciar cidos
nucleicos. En ese tiempo, se report la purificacin de polimerasas que podan
sintetizar hasta 1500 bases de ADN por minuto, y que mantenan su actividad en
un intervalo amplio de temperaturas elevadas (70-80 C) (Carballeira et al.,
1990). Con estas enzims, por fin fue posible obtener fragmentos uniformes de
ADN de hasta 1000 bases y se pudo determinar una secuencia de este tamao
(Innis et al., 1988).

6. Marcado de la cadena de ADN.

Se han explorado distintas maneras de marcar la cadena de cidos nucleicos

sintetizados para la secuenciacin de cidos nucleicos por el mtodo de Sanger.
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Originalmente, se utilizaron nucletidos marcados con P en la mezcla de
sntesis y algunos de stos se incorporaban en la cadena (Sanger et al., 1977).
Los nucletidos incorporados al final de la cadena (ddNTPs) no llevaban ningn
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marcaje ( P), slo carecan del grupo hidroxilo 3 para evitar que se siguiera
extendiendo la cadena. Para poder resolver el orden de los fragmentos
sintetizados de esta forma, era necesario separarlos en un gel de archilamida de
cuatro carriles distintos y luego tomarle una radiografa para detectar el marcaje
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( P). En los aos siguientes, se exploraron otros tipos de marcas que no fueran
radioactivas para etiquetar estos fragmentos de ADN (Igloi, 1998).
Eventualmente, los fluorforos fueron remplazando a los istopos radioactivos,
como el mtodo preferido de marcaje (Prober et al., 1987). La razn de esto, es
que marcar molculas de ADN con istopos radioactivos es laborioso, tardado,
peligroso y caro (Smith et al., 1985). Adems, las propiedades de las
molculas fluorescentes han contribuido al desarrollo de tcnicas automatizadas
de secuenciacin de cidos nucleicos. Por ejemplo, la posibilidad hacer todas las
reacciones de terminacin especfica en un solo
tubo (Prober et al., 1987).
Existen muchas diferentes etiquetas para los fragmentos de ADN. Las molculas
fluorescentes tienen varias propiedades que se adaptaron con cierta facilidad
hacia el desarrollo de mtodos automatizados para la secuenciacin de cidos
nucleicos, y las limitaciones en su uso se han ido resolviendo. Por ejemplo, se
observ que una inconsistencia en la intensidad de la seal de los distintos
fragmentos, poda complicar la interpretacin de la informacin que se obtena del
detector (Bennett, 2003). Experimentando con distintos fluorforos, se han
encontrado algunos que dan una seal constante y que se pueden distinguir
entre si con mayor facilidad (Rosenblum et al., 1997). Tambin, se observ que
la modificacin de los dideoxynucletidos (ddNTPs) con algn componente
fluorescente, puede causar que la migracin del fragmento de ADN en un gel de
acrilamida sea un poco distinta, y causar dificultad en la interpretacin de la
secuencia. Prober et al. (1987) encontraron que era posible usar cuatro etiquetas
fluorescentes de la misma familia y que estaban estructuralmente
relacionados, pero con distintos rangos de absorcin. La similitud de
estructura provoca que la influencia sobre la migracin de los distintos
fragmentos sea mnima y facilita la interpretacin de la secuencia.

Adems, se ha intentado variar la proporcin de nucletidos que estn en la

mezcla de reaccin. Ansorge et al. (1990) encontraron que la polimerasa T7 tiene
preferencia por algunos nucletidos. Observaron que si se usa una proporcin
equimolar de cada ddNTP, marcado con una molcula fluorescente, la magnitud
de la seal que se obtiene es distinta, y se incrementa en el orden A<G<C<T.
Para compensar esta preferencia natural, se vari la proporcin de los ddNTPs en
la mezcla de reaccin (2:2:1:0.5 = T:C:G:A) y as la intensidad de la seal
obtenida de las bandas fue constante).

Otro problema, fue la afinidad de las polimerasas por los terminadores ddNTPs.
Tabor y Richardson (1995) identificaron el residuo crtico que discriminaba
entre dNTPs y ddNTPs en el sitio activo de la polimerasa Taq y mediante
ingeniera de protenas reemplazaron este aminocido. El resultado fue una
polimerasa intrnsicamente termoestable con 8,000 veces ms afinidad por los
ddNTPs.

7. Incorporacin del marcaje a la cadena de ADN.

Independientemente del tipo de marcaje utilizado, existen distintas forms

de incorporar el marcaje a los fragmentos de ADN generados en una reaccin de
sntesis. Se han explorado tres forms distintas de incorporacin:

1. Marcaje del iniciador- El iniciador parece ser un buen lugar para incorporar
una marca porque se encuentra en el extremo 5 de la cadena de
ADN y no existen muchas posibilidades de que el marcaje interfiera con el
proceso enzimtico de la sntesis. Sin embargo, en la prctica esta regin ha sido
difcil de modificar enzimticamente porque es muy inerte. Kempe et al. (1985)
reportaron que despus de una incubacin de 96 horas con ARN ligasa, slo
pudieron modificar 20% del iniciador en el extremo 5 con un marcador de biotina.

2. Marcaje incorporado en la cadena- Se pueden incorporar nucletidos

marcados a la cadena de ADN durante su sntesis, tal como lo hicieron Sanger et
al.(1997). Es importante que el marcaje no interfiera con la actividad de la
polimerasa que incorpora los nucletidos a la cadena. Igloi (1998) report que
slo dos de las polimerasas termoestables, utilizadas comnmente en la
secuenciacin, aceptan dNTPs fluorescentes como sustratos. A pesar de que el
marcaje de ADN fue el primero en reportarse, no se ha utilizado tan
ampliamente porque no tiene ventajas claras sobre los otros mtodos.

3. Marcaje del nucletido terminal- Este mtodo de marcaje, claramente, es el

ms sencillo y el mejor por varias razones. En este caso, el nucletido
responsable de la terminacin (ddNTP), es el que lleva la marca. Esto asegura
que todas las cadenas sintetizadas a partir de un templado, lleven incorporado
una sola marca en el mismo lugar (al final de la cadena, en el extremo 3). De esta
manera, se obtienen fragmentos que producen bandas uniformes y cuyas
secuencias se pueden determinar ms fcilmente. Sin embargo, esta no ha sido
la razn principal por la que este mtodo ha sido el ms popular. Una ventaja
adicional de tener el nucletido terminal marcado, es que se pueden usar
nucletidos terminales que lleven cuatro tipos distintos de marcaje (uno diferente
para cada nucletido). Esto implica que las cuatro reacciones de terminacin
especfica (ddATP, ddCTP, ddGTP, y ddTTP) se pueden llevar acabo en el
mismo tubo, y ya no se tienen que hacer por separado (Prober et al., 1987).
Adems, debido a que se puede determinar cual es el nucletido terminal de los
fragmentos de ADN con base en su seal, es posible resolver la secuencia de un
templado con slo un carril. Las bandas que se ven, emiten una seal distinta,
dependiente del nucletido terminal incorporado. El hecho de que las bandas
puedan ser diferenciadas con un carril, elimina la variacin que puede ocurrir
entre carriles. Adems, si por alguna razn se produce terminacin inespecfica
(en un dNTP), no se detecta el fragmento, porque no lleva un ddNTP marcado al
final. Hoy en da, este es el mtodo que ms se utiliza para marcar las cadenas
de ADN. Kelley (1994) report que la informacin obtenida en las primeras 300
bases de la secuenciacin, es ms precisa (98% contra 95%) utilizando
terminadores (ddNTPs) que llevan una marca fluorescente en lugar de iniciadores
con una marca fluorescente.
8. Secuenciacin automatizada

Los hallazgos de la dcada de los 80s (mejores polimerasas, PCR, marcas

fluorescentes) contribuyeron al desarrollo de mquinas automatizadas capaces
de determinar miles de bases de secuencia por da. Las primeras mquinas de
secuenciacin salieron a finales de los 80s. En 1986, Smith et al. reportaron una
tcnica de secuenciacin automatizada, basada en la terminacin especfica
con cuatro diferentes fluorforos. La mezcla de sntesis se cargaba en un solo
carril de gel, en tubo, y se usaba un detector ptico para determinar la absorcin
de cada banda, casi al final del tubo. Esta informacin pasaba directamente a
una computadora y permita obtener informacin precisa de hasta 200 pares
de bases (pb) de la secuencia. Sin embargo, haban varias reas que podan ser
optimizadas para aumentar la longitud de la secuencia obtenida: (1) el tamao,
dimetro y composicin del gel electrofortico, (2) los reactivos para la reaccin
de secuenciacin, (3) las condiciones de electroforesis, (4) equipo
ptico/electrnico de deteccin, (5) los marcadores fluorescentes (Smith et al.,
1986).

Posteriormente, se experiment con el uso de una mquina que tena un detector

ptico capaz de leer la informacin de cuatro carriles (Ansorge et al.,
1987). En este caso, se report que era posible obtener informacin precisa de
ms de 400 pb, usando solo un marcador fluorescente y separando las cuatro
reacciones. Sin embargo, se report que a pesar de las aparentes ventajas del
uso de marcadores distintos y un carril de deteccin, era mejor separar las
reacciones para que los resultados no se vieran afectados por las diferencias
(causantes de variacin en la migracin electrofortica) o similitudes (espectros de
absorcin traslapados) entre los marcadores (Ansorge et al, 1987).

Ansorge et al. (1988) reportaron el primer protocolo que usaba marcadores

fluorescentes en lugar de istopos radioactivos para el mtodo de secuenciacin
de Maxam-Gilbert. Utilizaron un marcador que no interfera con la degradacin
de la molcula de ADN y lograron secuenciar 50 oligonucletidos de 20 bases
cada uno, en un slo gel. En este reporte, los autores demuestran que tambin
es factible automatizar el mtodo de Maxam- Gilbert usando fluorforos. Sin
embargo, en los aos siguientes no hubo muchos avances en esta rea, ya
que el desarrollo de las tcnicas automatizadas de secuenciacin se enfoc
principalmente en mejorar el mtodo de Sanger.

En 1994, se report el uso de la polimerasa termoestable SequiTherm, que es

capaz de sintetizar fragmentos grandes con terminacin especfica. Esto
permiti determinar hasta 1000 bases de una secuencia por reaccin
(Zimmmerman et al., 1994). Esto fue un gran hallazgo, porque a pesar de los
avances en la automatizacin de la secuenciacin la informacin que se
obtena despus de unas 400 bases de secuencia era difcil de interpretar y
susceptible a error. La excepcin eran reacciones de secuenciacin utilizando la
polimerasa T7, con la cual era posible obtener hasta 700 bases de
secuencia con 99% de precisin, pero esta tenia la desventaja de no ser
termoestable (Ansorge et al., 1990; Church et al., 1994).