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INSTITUTO TECNOLGICO DE

CD. ALTAMIRANO

MANUAL DE LABORATORIO DE
SECUENCIACION DE ADN POR MTODO
SANGER

M. C. Francisco Javier Puche Acosta

PRESENTA:

Emmanuel Alejandro Gutirrez


Rentera

LIC. BIOLOGA
CD. ALTAMIRANO, GRO. MAYO 2017
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS TERMINALES CON GRUPO
ALFA AMINO LIBRE. MTODO DE SANGER.

El primero en lograr esta tcnica fue Frederick Sanger, quin diseo un mtodo, el
cual consiste en el marcaje del amino terminal a travs del uso de DNFB. Este
compuesto qumico color amarillo reacciona con los grupos amino libres en
condiciones ligeramente bsicas formando los dinitrofenil derivados (DNP-aa),
tambin reaccionar con los grupos imidazol, fenlicos y epsilonamino, por lo que
se dar una dinitrofenilacin en la cadena lateral de la tirosina, histidina y lisina. Al
hidrolizar el pptido o la protena ya dinitrofenilada, se da una ruptura total de los
enlaces peptdicos lo que nos da como resultado un hidrolizado que contendr
aminocidos libres y DNP derivados que se conservan intactos, ya que su enlace
es ms difcil de romper. Los DNP de aminocidos terminales, a diferencia de los
dems DNP y de los aas libres, son no polares por lo que se pueden extraer muy
fcilmente con un disolvente no polar. Estos DNP son sometidos a cromatografa,
y se determina al aminocido amino terminal de la protena en comparacin con
otros DNP derivados.
DESARROLLO
Se colocaron 30 mg de hemoglobina en un tubo y se disolvi con bicarbonato de
sodio al 4.2%, esto debido a que la reaccin con el DNFB se lleva a cabo en
condiciones ligeramente bsicas. Despus de esto se agreg al tubo DNFB al 1%
y se agit, procurando mantener el pH entre 8 y 9. Se agreg HCL 3N, con la
finalidad de detener la reaccin de dinitrofenilacion, despus se realizaron 3
extracciones con ter y solucin acuosa de FeSO4, posteriormente se evaporaron
los residuos de ter. Se centrifug a 3000 rpm durante 15 minutos, se elimina el
sobrenadante y posteriormente se agrega HCL 6N y se coloca el tubo en la
autoclave a 15lb/in^2 durante 3 horas, con esto se logra la ruptura de los enlaces
peptdicos de la hemoglobina, obtenindose un caldo de aminocidos que
contiene al amino cido n-terminal, mismo que se extrae con ter, se pasa a una
parrilla y se evapora casi a sequedad , el residuo se disuelve en 5 ml de etanol y
se aplica en una tira de papel Whatman junto con otros DNP derivados.
Posteriormente se coloca el cromatograma en una cmara previamente saturada
con solvente de cido ctrico y citrato de sodio, saturar durante dos horas y
desarrollar la cromatografa en forma ascendente durante 4 o 5 horas. Medir las
distancias correspondientes y calcular los valores de RF.