Microbiologa Industrial TP N 10

TRABAJO PRACTICO N 10
Fermentacin alcohlica
Una de las fermentaciones industriales ms importante y mejor conocida es la que da
lugar al alcohol etlico al actuar las levaduras sobre los azcares.
El alcohol etlico puede obtenerse a partir de cualquier azcar fermentescible, por accin
de las levaduras, en condiciones favorables. Puesto que el almidn y otros hidratos de
carbono pueden ser hidrolizados a azcares fermentescibles por mtodos biolgicos o
qumicos, se puede disponer de muchas fuentes de azcar.
La materia prima puede clasificarse en tres tipos principales:
a) materias sacaroideas: azcar de caa, remolacha, melazas y jugos de frutas.
b) materias que contienen almidn: comprenden los cereales (maz, malta, cebada,
avena, centeno, trigo, arroz, sorgo y otros), papas, batatas.
c) materias celulsicas: madera y los residuos de fabricacin de la pasta de papel.
Las materias sacaroideas requieren por lo general poco o ningn tratamiento preliminar
aparte de la dilucin; las materias amilceas y las celulsicas deben ser hidrolizadas a
azcares fermentescibles antes que acten sobre ellas las levaduras.
En todos los casos el xito depende de la eficacia del tratamiento preliminar (en caso de
haberlo), del empleo de una concentracin ptima de azcar, de un pH y temperatura
ptimos, del empleo de una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia alcohlica,
capaz por lo tanto de producir grandes cantidades de alcohol.
Concentracin de azcar: 10-18%. Valor ms corriente: 12%.
Sustancias nutritivas: en algunos casos, para suplir la posible deficiencia en P o N, puede
3- 2-
aadirse (PO4) o (SO4) amnico.
pH del mosto: 4-4.5. Este favorece a la levadura y es lo suficientemente bajo para inhibir
el desarrollo de muchos tipos de bacterias. Para alcanzar este pH se emplean SO4H2 y
cido lctico.
Tensin de O2 : en los primeros momentos es necesaria una alta concentracin de este
gas para la reproduccin de las clulas de levadura.
Durante la fermentacin se desprende CO2 y se establecen pronto condiciones
anaerobias.
Obtencin del alcohol a partir de harina de maz
Por ser la harina de maz una materia prima de naturaleza amilcea, debe efectuarse un
tratamiento preliminar para transformar el almidn en azcares fermentescibles.
El almidn es un polisacrido que desempea funciones de reserva en tejidos vegetales,
y est compuesto por dos tipos de polmeros: la amilosa y la amilopectina.
La amilosa es una cadena lineal formada por unidades de glucosa (en nmero elevado),
unidas entre s por uniones 1-4 (uniones entre el grupo aldehido de cada molcula con
el OH del C4 de la molcula siguiente).

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La amilopectina tiene una estructura ramificada en la que las unidades de glucosa se

unen por enlaces glucosdicos 1-4 y 1-6. En cada C6 que participa de una unin se
produce un punto de ramificacin.
En su estado natural en el tejido vegetal, el almidn se encuentra formando grnulos. El
tamao de los grnulos vara entre los 5 y 100 m y poseen una estructura interna
consistente en capas concntricas. En ellos coexisten regiones internas cristalinas y
amorfas. Las regiones amorfas representan el 70% de la estructura y contienen la mayor
parte de la amilosa. Un comportamiento particular de los grnulos de almidn es su
capacidad de gelificar al ser calentados en presencia de agua. La gelificacin del almidn
implica la ruptura de los puentes hidrgeno intercatenarios especialmente en las regiones
cristalizadas del grnulo.
Los mtodos para sacarificar materiales amilceos implican el uso de preparaciones
enzimticas, cidos diludos o una combinacin de ambos.
Entre las preparaciones enzimticas se incluye la malta y otras de origen microbiolgico
derivados de hongos y bacterias. Estas preparaciones contienen amilasas, enzimas
capaces de hidrolizar el almidn y el glucgeno a diversos productos.
Las distintas amilasas se pueden clasificar de la siguiente manera:

A amilasa (enzima licuante): Cataliza la hidrlisis de las uniones -1,4

M de la amilosa y la amilopectina a ambos lados de la unin -1,6. Produce
Endoamilasas
I maltosa, glucosa, oligosacridos.
L
A amilasa (enzima sacarificante): Cataliza la hidrlisis de las uniones -
S 1,4. Produce maltosa y dextrinas lmites.
Exoamilasas Amiloglucosidasa (enzima sacarificante): Cataliza la hidrlisis de las
A
S uniones -1,6 y -1,4. Produce glucosa.

La designacin de y amilasas no se refiere a la configuracin del enlace glucosdico

que hidrolizan, ya que ambos grupos de enzimas hidrolizan los enlaces 1-4.
La amilasa hidroliza rpidamente la fraccin amilosa a maltosa, a partir de los extremos
no reductores de la molcula. Esta conversin es prcticamente cuantitativa sin que se
formen cantidades apreciables de dextrinas (oligosacridos superiores).
Cuando la amilasa acta sobre la amilopectina, la hidrlisis se realiza en un 50-60%
aproximadamente de la mxima terica (calculada como maltosa). Este efecto puede ser
prcticamente completo en la amilosa de cadena lineal, sin ramificar; en cambio en la
amilopectina la accin enzimtica cesa en los puntos de ramificacin de la cadena, es
decir en los enlaces 1-6 glicosdicos (dejando dextrinas lmites).
En contraste con las amilasas, las amilasas hacen muy lento el ritmo de aparicin de
la maltosa. En este caso la hidrlisis del polisacrido tiene lugar en los enlaces
glicosdicos del interior de la cadena, formndose oligosacridos que se escinden
lentamente en maltosa y glucosa.

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Otra diferencia que presentan las amilasas con respecto a las amilasas, es que las
primeras pueden hidrolizar los enlaces 1-4 de las amilopectinas a uno y otro lado de las
ramificaciones formando oligosacridos del orden de los pentasacridos, unidos por
enlaces 1-6. Este acortamiento tan grande de la cadena lleva a una disminucin rpida
de la viscosidad. De ah que a las amilasas se las llame tambin enzimas licuantes.
Preparan as el camino para la amilasa a la que se llama sacarificante. En la malta
existen y amilasas. Trabajando a alta temperatura se favorece la accin de la (70-
75C) con lo cual tiene lugar la licuefaccin, mientras que a temperaturas ms bajas
(60C) trabaja la amilasa producindose la sacarificacin.
La amiloglucosidasa (enzima sacarificante), es otra amilasa que ataca las uniones 1-6 y
1-4 a partir de los extremos no reductores de la molcula de almidn, produciendo
glucosa. La velocidad de hidrlisis de la amiloglucosidasa aumenta con el peso molecular
del sustrato. La velocidad de hidrlisis de los enlaces 1-6 es un orden de magnitud
menor que para las uniones 1-4.

Estructura del almidn:

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PARTE PRACTICA
Obtencin de alcohol por fermentacin de harina de maz
La prctica tiene por objeto preparar el mosto a partir de harina de maz, mediante dos
enzimas ( amilasa y amiloglucosidasa), y la posterior fermentacin del mosto por la
accin de levaduras, en condiciones anaerbicas.
El rendimiento de la fermentacin se calcula en base al peso de etanol obtenido.

Microorganismo utilizado: Saccharomyces cerevisiae (levadura de alta).

1- Preparacin del inculo: en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, se colocan 50 ml
de caldo Sabouraud y 0.5% p/v de macerado de maz.
Se esteriliza 30 minutos a 110C. Se enfra y se siembra con un cultivo de 24 horas de la
levadura. Se incuba durante 24 horas, a 28C, en agitador rotatorio.
2- Preparacin del mosto: en un Erlenmeyer de 500 ml de capacidad previamente tarado
(incluyendo el tapn de algodn), se colocan 45 g de harina de maz y 200 ml de agua
destilada.
a) Gelificacin: el Erlenmeyer se coloca en el autoclave a 121C durante media
hora, a fin de liberar el almidn contenido en la harina de maz.
b) El Erlenmeyer se enfra a 70C, y se le agrega 2 ml de amilasa bacteriana. El
contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 15 minutos, mantenindolo
sumergido en un bao termostatizado a 70C.
c) El Erlenmeyer se retira del bao termostatizado y se coloca durante 5 minutos
en un bao de agua hirviente. Este paso tiene por objeto inactivar la amilasa.
d) Se enfra el Erlenmeyer a 55C y se le agrega 4 ml de amiloglucosidasa.
El contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 30 minutos, en un bao
termostatizado a 55C.
3- Siembra del inculo: el mosto se enfra a 28C y se siembra con 5 ml del inculo,
preparado segn 1. Luego se incuba en forma esttica a 28C, durante 72 a 96 horas,
hasta que la fermentacin haya terminado.
4- Destilacin: finalizada la fermentacin, se pesa el Erlenmeyer. Se miden 100 ml. y se
pasan a un baln de destilacin de 500 ml. y se vuelve a pesar el Erlenmeyer, para
conocer el peso de la fraccin que se va a destilar.
Se agregan al baln 100 ml de agua destilada, lavando la probeta en que se han medido
los 100 ml. Se destila lentamente, hasta asegurarse que la temperatura haya llegado a
100C. El destilado se recoge en un matraz aforado de 100 ml, se lleva a volumen con
agua destilada, y se determina su densidad por medio del densitmetro (alcoholmetro),
ajustando la temperatura al valor indicado en las tablas de concentracin adjuntas.
Obtenida la densidad, se busca la concentracin de alcohol en % p/v.

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5- Clculo del rendimiento:

a) Rendimiento terico
Ecuacin de Gay-Loussac:
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2
PM 180 PM 2 x 46 PM 2 x 44
180 g glucosa 92 g alcohol
100 g glucosa 51.1 g alcohol
(C6H10O5)n + n H2O n C6H12O6
almidn glucosa
PM (162)n n 180
n 162 g n 180 g glucosa
100 g 111 g glucosa
100 g almidn 111 g glucosa 56.7 g alcohol

b) Rendimiento prctico
Se calcula el rendimiento de etanol por 100 g de harina integral de maz por 100 g
de almidn, considerando que el contenido de almidn de la harina de maz es de
aproximadamente 60%p/p.
El rendimiento en la prctica industrial, en la que se prepara el mosto con enzimas
de la malta, es de 59 litros de alcohol por 100 kg de almidn.
Esto corresponde aproximadamente a 82% del valor terico.

c)Eficiencia de la fermentacin

Eficiencia= Rendimiento prctico x 100

Rendimiento terico

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PESO ESPECFICO DE MEZCLAS DE ALCOHOL-AGUA A 15C (WINDISH)

Peso En 100 cc. Peso En 100 cc. Peso En 100 cc.

especfico Alcohol en g especfico Alcohol en g especfico Alcohol en g

0.9979 1.12 0.9939 3.35 0.9899 5.76

8 1.17
7 1.22
6 1.28
5 1.33
4 1.39
3 1.44
2 1.50
1 1.55
0 1.60
8 3.40
7 3.46
6 3.52
5 3.58
4 3.64
3 3.69
2 3.75
1 3.81
0 3.87
8 5.83
7 5.89
6 5.95
5 6.02
4 6.08
3 6.14
2 6.21
1 6.27
0 6.34

0.9969 1.66 0.9929 3.93 0.9889 6.40

8 1.71
7 1.77
6 1.82
5 1.88
4 1.93
3 1.99
2 2.04
1 2.10
0 2.16
8 3.99
7 4.05
6 4.11
5 4.17
4 4.23
3 4.29
2 4.35
1 4.41
0 4.47
8 6.47
7 6.53
6 6.59
5 6.66
4 6.73
3 6.79
2 6.86
1 6.93
0 6.99

0.9959 2.21 0.9919 4.53 0.9879 7.06

8 2.27
7 2.32
6 2.38
5 2.43
4 2.49
3 2.55
2 2.60
1 2.66
0 2.72
8 4.59
7 4.65
6 4.71
5 4.77
4 4.83
3 4.89
2 4.95
1 5.01
0 5.08
8 7.12
7 7.19
6 7.26
5 7.33
4 7.39
3 7.46
2 7.53
1 7.60
0 7.66

0.9949 2.77 0.9909 5.14

8 2.82
7 2.88
6 2.94
5 3.00
4 3.06
3 3.12
2 3.17
1 3.23
0 3.29
8 5.20
7 5.26
6 5.32
5 5.38
4 5.45
3 5.51
2 5.57
1 5.64
0 5.70