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1) TINCION GRAM
Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas gram negativas son
rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.
Colorantes y reactivos :
Lugol de Gram
Solucin de Safranina al 1 %
Procedimiento:
Despus de fijado el frotis a la llama del mechero, colocar la lmina sobre el
puente de coloracin.
Secado de lmina :
TINCION
ZIEHL NEELSEN
Fundamento
Las
paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos)
de cadena larga (50-90 tomos de C) que les confieren la propiedad de resistir a la
decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por
esto se denominan cido-alcohol resistentes (o cidorresistentes). Las
micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por
sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-
Neelsen requiere de calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento aumenta la energa
cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las
bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo, sobre un
color azul (que lo provee el colorante de contraste Azul de metileno).
Procedimiento:
a) Frotis
Colocar los frascos con las muestras en orden consecutivo de izquierda a
derecha
Poner las lminas en la mesa (en este caso dentro de la CSB) y numerarlas
con los nmeros correspondientes a las muestras usando 1/3 de la lmina al
reverso (para que al momento de hacer la decoloracin no se borre)
Abrir el frasco de la muestra de manera firme y lenta
Ver el contenido del frasco y obtener la parte ms purulenta
Con un palillo de madera escoger la porcin ms
purulenta/sanguinolenta/slida, no se debe batir demasiado la muestra
Extender la muestra en un frotis de una capa no muy gruesa (sobre loso 2/3 de
lmina sobrante) sin llegar a los bordes
Si es necesario, desmenuzar las partculas grandes con las puntas del palillo
de madera quebrado por la mitad
Desechar el aplicador en un frasco de boca ancha con alcohol o cloro
Dejar secar el frotis
Tomar la lmina por el extremo numerado con la muestra hacia arriba, pasarla
tres veces por la llama del mechero para fijar el frotis, dejar enfriar el frotis (2-3
min.)
b) Tincin:
Cubrir todo el portaobjeto con fucsina filtrada
Calentar hasta la emisin de vapores (aprox. 5 min.)
Lavar con agua (poniendo la lmina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
Cubrir con solucin decolorante durante 2 min.
Lavar con agua (poniendo la lmina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
Cubrir con azul de metileno de 45seg.-1min.
Lavar con agua y luego poner en la tabla de secado (para escurrir)
3) TINCION FLAGELAR DE LEIFSON
Los flagelos son estructuras, cuyo dimetro no excede de los 30mm, lo cual est
muy por debajo del poder de resolucin del microscpico ptico. Para hacer
visibles a los flagelos se requiere aumentar su grosor, para lo cual se emplea una
suspensin de cido tanico que al precipitarse sobre su cubierta forman una capa
que aumenta aparentemente su dimetro. Lo que propicia que al ser
posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposicin con respecto al
bacilo se hagan visibles al microscopista.
Colorantes y reactivos
Solucin A:
Solucin B
Preparacin
Para que la tincin de los flagelos sea efectiva se requiere cumplir con los
siguientes requisitos
Los medios de cultivo empleado para el desarrollo de las cepas deben ser
adecuados.
Procedimiento
Eche sobre cada lmina portaobjetos 1mL del colorante de Leifson y djelo
actuar con un tiempo diferente para cada preparacin. Una de las lminas
por espacio de 8 minutos, la segunda por espacio de 10 minutos y la
tercera 15 minutos.
Fundamento:
La cpsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la
sintetizan a partir de polipptidos, polmeros de glucosa u otros amino azucares
que contienen nitrgeno, que despus de combinarse con el agua es segregada
por todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la
cpsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreado por el mtodo
de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se requiere ver la
cpsula con ms detalle o inducir su produccin se recurre a coloraciones
especiales.
5) TINCION WIRTZ-CONKLIN
Fundamento:
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil
tincin.
Realizacin
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias
produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder
obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las
instrucciones.
Secar la preparacin.
Son estructuras variables presentes en las clulas bacterianas con una funcin,
probablemente, de reserva.
Puede ser de Polimetfosfato, como en Corynebacterium difteriae y otros
difterioides, pueden ser de cido beta amino butrico, o polmeros de glutamato
como en Corynebacteriun Glutmicum.
Procedimiento
Cubra la muestra con el colorante de Albert por un minuto.
Escrrala placa sin lavar.
Cubra cuidadosamente con Lugol de Albert.
Lave cuidadosamente con agua, escurra y seque con papel secante o al
aire.
Observe al microscopio con aceite de inmersin.
Los grnulos metacromticos se observan de azul oscuro