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Matria 1 teste
1 Semestre - 2010/2011
Baseado nas aulas e nos livros Principles of Gene Manipulation and Genomics
e Gene Cloning and DNA analysis
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Conjugao Triparental.................................................................................................................................... 20
Conjugao Biparental..................................................................................................................................... 21
Introduo de fagos em bactrias ....................................................................................................................... 21
Transfeco...................................................................................................................................................... 21
Introduo de DNA em organismos eucariotas ................................................................................................... 21
Introduo de DNA em Saccharomyces cerevisae........................................................................................... 21
Introduo de DNA em clulas animais ........................................................................................................... 22
Introduo de DNA em clulas vegetais .......................................................................................................... 23
PCR Polymerase Chain Reaction ........................................................................................................................... 24
Passos da PCR ...................................................................................................................................................... 24
Material necessrio ......................................................................................................................................... 24
Design de primers ............................................................................................................................................ 25
Produtos de PCR .............................................................................................................................................. 26
Vectores de clonagem para E. coli ........................................................................................................................... 27
Plasmdeos ........................................................................................................................................................... 27
Vectores de clonagem baseados no fago M13........................................................................................................ 29
Vectores de clonagem baseados no fago ............................................................................................................. 31
Bibliotecas genmicas ............................................................................................................................................. 32
Vectores de clonagem para leveduras .................................................................................................................... 32
YEps Plasmdeos epissomais de levedura ............................................................................................................. 33
Outros plasmdeos para levedura ....................................................................................................................... 33
YACs cromossomas artificiais de levedura ........................................................................................................... 34
Processo de clonagem com pYAC3: ................................................................................................................. 34
Vectores de clonagem para plantas superiores ...................................................................................................... 35
Vectores de clonagem para insectos ....................................................................................................................... 35
Obteno de clones para genes especficos ............................................................................................................ 36
Processo de preparao do cDNA: ...................................................................................................................... 36
Hibridao de Southern ....................................................................................................................................... 37
Mutagnese aleatria.............................................................................................................................................. 39
Mutantes de eliminao em bactrias ................................................................................................................ 40
Mutantes de inactivao por insero ................................................................................................................ 43
Mutantes de eliminao em S. cerevisae ............................................................................................................ 43
RNA de interferncia iRNA.................................................................................................................................... 44
Mutagnese dirigida ................................................................................................................................................ 45
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Engenharia Gentica
Potenciais benefcios da Biotecnologia/Engenharia Gentica
Diagnsticos e tratamentos mais precisos;
Melhoramento de colheitas e da sua resistncia a doenas e stress ambiental;
Produo de qumicos, enzimas, aditivos alimentares, medicamentos, polmeros, etc;
Eliminao de poluentes e resduos.
DNA recombinado: qualquer molcula de DNA criada artificialmente que conjuga sequncias de DNA que
geralmente no se encontram juntas na natureza.
Clonagem: replicao de DNA recombinado no interior de um organismo hospedeiro de modo a produzir vrias
cpias da mesma sequncia.
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Clonagem de genes
Vectores de clonagem: molculas de DNA s quais podem ser adicionados fragmentos de DNA exgeno. Tm
capacidade de replicao so geralmente replices, tendo apenas uma origem de replicao.
Sofrem replicao na clula hospedeira (necessitam por isso de uma origem de replicao para que
sejam produzidas vrias cpias do DNA recombinado (DNA de interesse)) *;
So relativamente pequenos (< 10 Kb), uma vez que as molculas grandes tendem a quebrar durante a
purificao;
Tm marcadores de seleco (como genes de resistncia a antibiticos) que permitem seleccionar os
organismos que contm o gene clonado.
Plasmdeos
Molculas de DNA circular (geralmente em cadeia dupla) que tm uma existncia independente na
clula (no fazem parte do cromossoma e replicam-se independentemente).
Existem essencialmente em bactrias (nos eucariotas s foram identificados em leveduras).
Contm um ou mais genes responsveis por caractersticas teis s clulas (embora no contenham
genes essenciais). Podem conferir resistncia a antibiticos, factores de fertilidade, produo de compostos
xenobiticos, degradao de toxinas, etc.
Estas caractersticas so importantes quando as bactrias/clulas se encontram sob presso selectiva (i.e. meio
com antibitico). Caso contrrio apenas atrasam o crescimento do organismo devido ao peso metablico
adicional do plasmdeo tornam-se uma desvantagem.
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Classificao de plasmdeos
Plasmdeos conjugativos: contm os genes tra, que sintetizam o pilus sexual das bactrias e outras estruturas
necessrias conjugao.
Plasmdeos mobilizveis: contm genes mob e so capazes de transferir cpias de si prprios (por conjugao)
para outras clulas.
Plasmdeos integrativos (epissomas): podem existir sob a forma circular ou integrados no cromossoma. A
integrao depende do factor F. Tm um nmero de cpias definido.
O nmero de cpias de um plasmdeo presente numa bactria varia (desde apenas 1 at mais de 100).
Para efeitos de clonagem preferem-se plasmdeos que apresentem mltiplas cpias de modo a que se possa
obter a maior quantidade possvel da molcula recombinada.
Gama de hospedeiros
Vasta gama de hospedeiros: ori codifica a maioria das protenas necessrias replicao e a regio promotora e
os ribossome binding sites (RBS) so reconhecidos por uma grande diversidade de bactrias - plasmdeos
promscuos.
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Bacterifagos
Bacterifagos so vrus que infectam especificamente bactrias. Tm uma estrutura simples que
consiste numa molcula de material gentico (geralmente DNA) rodeada por uma cpside (cpsula).
Head and tail: DNA linear de cadeia dupla. I.e. fago : infecta E.coli.
Filamentoso: DNA circular em cadeia simples. I.e. fago M13: infecta bactrias com pilus sexual.
Fago
DNA linear, cadeia dupla. Infecta E.coli ~ 48,5 Kb
Ciclo ltico: ciclo de vida dos bacterifagos no qual, findo o processo de infeco, as clulas lisam.
Ciclo lisognico: ciclo no qual um bacterifago se insere no genoma das clulas que infecta e se mantm na
forma de pr-fago.
So importantes aquando da infeco da bactria (para a circularizao) e tambm durante o ciclo ltico, pois
intervm no processo de multiplicao do genoma do fago.
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Mtodo do crculo rolante: mtodo de replicao do genoma do fago
O fago est sob a forma circular. Replicao tem incio na regio DSO double-strand origin. O DNA
sofre clivagem e a cadeia 3 serve de primer para a polimerase poder actuar. A cadeia complementar vai sendo
sintetizada e cresce como uma nica molcula contendo muitas cpias do fago.
Na longa cadeia simples so reconhecidos os locais cos e uma endonuclease cliva a o DNA, dando
origem a vrias molculas do genoma do fago.
Fago M13
DNA circular, cadeia simples. Infecta bactrias com pilus sexual ~ 6,5 Kb
1) Fago liga-se a um receptor nas clulas (o pilus sexual) e injecta o seu DNA.
2) DNA em cadeia simples convertido em DNA de cadeia dupla. Passa a funcionar como se fosse um
plasmdeo.
3) DNA replicado atravs do mtodo crculo rolante (produz fragmentos lineares).
4) So transcritas e traduzidas as protenas do fago.
5) DNA recircularizado introduzido na cpside e o fago completo libertado para o meio extracelular.
No se conhece bem o processo de libertao do fago.
H medida que a clula se replica o M13 passa entre progenitores e descendentes, sendo transmitido entre
geraes.
No ocorre lise das clulas pelo que o fago M13, aps infeco de uma bactria, pode ser a replicado
indefinidamente. Pelo facto de no ocorrer lise difcil identificar quais as clulas infectadas. Pode verificar-se
um crescimento mais lento devido ao peso metablico extra acarretado pela presena do fago.
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Preparao de DNA
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DNA fago
Os fragmentos de DNA (obtidos por diversos mtodos) nem sempre esto adaptados aos vectores nos
quais vo ser clonados, pelo que podem necessitar de ser modificados. Essas modificaes incluem:
Muitas destas tcnicas de manipulao fazem uso de enzimas existentes naturalmente nas clulas e que
foram purificadas e apuradas para serem utilizadas in vitro. De entre essas enzimas destacam-se:
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Nucleases
Nucleases (RNAses, DNAses): degradam cidos nucleicos atravs da quebra de ligaes fosfodisteres entre
nucletidos. Fazem hidrlise da ligao entre um grupo fosfato e um grupo hidroxilo.
Exonucleases: removem nucletidos, um de cada vez, a partir das extremidades da molcula de DNA. Encurtam
fragmentos. I.e. BAL 31.
Endonucleases: quebram ligaes internas (corte aleatrio) na cadeia de DNA. Obtm-se fragmentos de vrios
tamanhos. I.e. S1, cliva cadeias simples.
Quando se utilizam nucleases in vitro tem que se ter ateno ao tempo de incubao pois estas enzimas so
inespecficas e degradam todo o DNA indiferentemente.
DNAse I actua apenas em molculas de DNA pelo que bastante til quando se quer obter apenas RNA.
Polimerases
Polimerases sintetizam novas cadeias de DNA complementares a cadeias de DNA/RNA molde (cadeias
simples pr-existentes). A maioria necessita de um primer (iniciador) regio de cadeia dupla onde se liga a
enzima para iniciar a polimerizao.
DNA polimerase I: liga-se a pequenas zonas de cadeia simples (nicks) de molculas maioritariamente de cadeia
dupla. Sintetiza uma nova cadeia, no sentido 5 3, degradando a cadeia j existente medida que avana
acumula funo de exonuclease no sentido 5 3 (bifuncional).
Em Eng. Gentica isolou-se apenas a parte da pol I com actividade de polimerase, a que se chamou
fragmento Knelow. Evita-se o desperdcio de dNTPs devido actividade da nuclease.
Polimerases deixam um nick no incio da cadeia que sintetizam. Esse nick corrigido por ligases.
Taq polimerase provm do organismo Thermus aquaticus e termoestvel (resistente desnaturao pelo
calor), sendo a sua temperatura de ~70C. por isso usada em PCR.
Tem a desvantagem de cometer 1 erro por cada 1000 nucletidos. Podem usar-se outras enzimas
termoestveis e que so proofreading. Reconhecem e corrigem erros de replicao. Tm actividade de
endonuclease 3 5. I.e.: Pfu (Pyrococcus furiosus), Pwo (Pyrococcus woosi) e Tma (Thermologa maritima).
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Transcriptase reversa utiliza moldes de RNA para sintetizar DNA. Est envolvida na replicao de vrus
(retrovrus, i.e. HIV) e utilizada na tcnica de DNA complementar (cDNA).
Permite a clonagem de genes e a sua transferncia de eucariotas para procariotas: a partir de RNA processado
(j sem intres) sintetizada uma cadeia de DNA complementar. Essa cadeia simples pode ser ento
transformada em cadeia dupla de DNA, que agora contm o gene de interesse.
Fosfatase alcalina remove grupos fosfato das extremidades 5 de molculas de DNA. utilizada, por exemplo,
para impedir que vectores de DNA digeridos por endonucleases de restrio voltem a recircularizar.
Quando um vector restringido a probabilidade deste recircularizar superior de ser inserido um fragmento
de DNA pois a insero requer duas ligaes e no apenas uma. Ao eliminar os fosfatos 5 a enzima ligase
deixa de poder actuar e o vector no recirculariza. O fragmento de DNA exgeno (no tratado) contm
extremidades com fosfato e, portanto, consegue ligar-se a uma das cadeias do vector. Na outra cadeia fica um
nick, mas ainda assim a molcula suficientemente estvel para entrar na clula hospedeira, onde os
mecanismos de reparao da mesma vo corrigir o nick.
Transferase terminal adiciona nucletidos no terminal 3 de uma molcula de DNA (actua no sentido 5 3).
muito utilizada para adicionar caudas de homopolmeros a molculas de cDNA para poderem ser clonadas em
vectores.
Clonagem com extremidades coesivas mais eficiente do que com extremidades cegas. Incuba-se o
vector e o fragmento a inserir em meio contendo a enzima transferase terminal e um tipo de nucletidos
(nucletidos complementares em cada meio). Vo ser sintetizadas caudas que funcionam depois como
extremidades coesivas complementares aumenta a eficincia de insero.
Endonucleases de Restrio
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Um fago no metilado inserido em:
E. coli K: o fago metilado est protegido da restrio e, portanto, infecta as clulas, provocando a sua
lise e a libertao de fagos metilados (esta E. coli tem sistema de modificao) que podem infectar E.coli K e C.
E. coli C: mesmo metilado, o fago replicado (esta E. coli no tem mecanismo de restrio) e a clula
infectada, produz mais fagos e sofre lise.
ABCD
A: 1 letra do gnero
B C: 1 e 2 letras da espcie
D: ordem de isolamento
Tipo I: uma enzima com diferentes subunidades para reconhecimento, clivagem e metilao. Reconhece
e metila sequncias especficas mas metila at 1000bp frente.
Tipo II: duas enzimas (uma cliva, outra modifica) que reconhecem a mesma sequncia simtrica.
Tipo III: uma enzima com duas subunidades, uma para reconhecimento e modificao, e outra para
clivagem. Reconhece e metila a mesma sequncia, mas cliva 24-26bp depois.
Tipo IV: duas enzimas e local de reconhecimento assimtrico. Clivagem ocorre num dos lados da
sequncia de reconhecimento mas afastado at 20bp.
Tipo V: o mais usado em Eng. Gentica pois as endonucleases no tm a funo de metilao (essa
funo desempenhada por outra enzima do sistema M-R). Reconhecem sequncias simtricas de 6
nucletidos (geralmente) e cortam no meio.
3 G C T A G C 5
Algumas enzimas reconhecem sequncias degeneradas, i.e., que contm locais onde pode existir
qualquer base.
Enzimas de restrio que tm a mesma especificidade (mesmo local de restrio mas provm de
organismos diferentes) designam-se isosquizmeros.
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Tipos de extremidades
Coesivas: enzimas cortam cada cadeia de DNA num local especfico, espaado de 2 a 4 nucletidos,
originando extremidades de cadeia simples.
Endonucleases com diferentes locais de restrio podem produzir as mesmas extremidades coesivas.
Permite que se restrinjam vectores e fragmentos com enzimas diferentes e que as suas extremidades sejam
complementares. No entanto, o vector recombinado obtido pode no ser reconhecido por nenhuma das
endonucleases originais.
No se sabe ao certo quantos locais de restrio existem numa molcula de DNA para determinada
enzima. Pode prever-se 1 local em cada 44 ou 46 nucletidos para sequncias de restrio de 4 ou 6 bases. No
entanto, estes valores no so exactos, sabendo-se at que o contedo GC de uma sequncia afecta o seu
reconhecimento por diferentes endonucleases. Sequncias ricas em GC tm menos probabilidade de apresentar
sequncias de restrio AT.
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Para determinar o nmero e tamanho dos fragmentos de restrio corre-se o preparado por um gel de
electroforese.
Pode desenhar-se um mapa de restrio onde figuram os locais de restrio de vrias enzimas. Estes
mapas permitem seleccionar as endonucleases a usar nos processos de clonagem.
Digerir o DNA alvo com enzimas isoladas (digesto simples) e com combinaes (duplas, triplas,);
Determinar o nmero e tamanho dos fragmentos para cada digesto;
Dispor os fragmentos na ordem correcta.
Ligases so enzimas que fazem a ligao entre fragmentos de DNA passo final na construo de uma
molcula recombinante, na replicao ou recombinao. Promovem a formao de uma ligao fosfodister
entre nucletidos, podendo necessitar de ATP. adicionado ao tampo da enzima. No pode ser congelado
muitas vezes. Nem todas as ligases utilizam os mesmos co-factores.
Em Eng. Gentica usa-se uma ligase purificada a partir de E. coli infectada pelo fago T4, pois esta enzima
tem uma capacidade de catlise elevada.
A ligao de extremidades cegas no muito eficiente pois requer que a ligase e as pontas dos dois
fragmentos estejam simultaneamente prximas. Para aumentar a eficincia da ligao pode:
Linkers:
Pequenos fragmentos de DNA de cadeia dupla sintetizados in vitro, que tm uma sequncia de
nucletidos que contm locais de restrio para uma ou mais endonucleases.
Os linkers so ligados a ambas as extremidades cegas do fragmento de DNA (por aco de uma
ligase) e de seguida so submetidos a digesto de restrio de modo a produzir extremidades
coesivas.
O fragmento obtido pode ento ser ligado a um vector restringido pela mesma endonuclease.
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Problema: se existir um local de restrio igual ao do linker no meio do DNA.
Adaptadores:
Pequenos fragmentos de oligonucletidos sintticos que tm uma extremidade cega e outra
extremidade coesiva (correspondente a um local de restrio). Para que os adaptadores no se
liguem entre si extremidade coesiva 5 foi retirado o grupo fosfato (fosfatase alcalina).
Os adaptadores so incubados com o DNA alvo e ligam-se s suas extremidades. Tratamento
com a enzima cinase polinucleotdica fosforila a posio 5 (adiciona um grupo PO32-) e o
fragmento de DNA fica pronto a ser introduzido num vector (restringido com a mesma
endonuclease relativa ao adaptador).
Alguns adaptadores contm locais de restrio adicionais, de modo a facilitar processos de clonagem.
Caudas de homopolmeros:
Adiciona-se um tipo de nucletidos aos terminais 3 do fragmento de DNA e adicionam-se
nucletidos complementares aos terminais 3 do vector de clonagem (a reaco feita por
enzimas terminal-transferases).
As extremidades coesivas das duas molculas so complementares e podem emparelhar,
permitindo depois a aco do fragmento Knelow (caso fique algum nick) e da ligase.
O prximo passo na clonagem de um gene a introduo do DNA recombinado em clulas vivas para
que este possa ser amplificado e purificado.
A purificao necessria pois a amplificao de DNA via culturas de hospedeiros origina vrios tipos de
colnias:
Para isolar os diferentes tipos de fragmentos introduzem-se em clulas vivas (que geralmente s captam um
vector) e cultivam-se em meio selectivo (seleco depende do vector e do hospedeiro).
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Tcnicas de introduo de DNA em bactrias
O DNA recombinado pode ser introduzido em clulas vivas por diversos mtodos.
Transformao
A transformao o processo natural de captao de DNA por bactrias. Algumas bactrias (como
Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas) so naturalmente competentes e adquirem espontaneamente
fragmentos livres de DNA presentes no meio ou, atravs de um processo activo, lisam outras clulas para
obterem o seu DNA.
A competncia apenas se manifesta quando as bactrias se encontram sob stress, como no caso da falta
de nutrientes ou presena de antibiticos. Mecanismo de sobrevivncia. Englobam DNA na esperana que
alguns dos fragmentos lhes possam conferir vantagem no ambiente adverso.
Nem todas as transformaes so estveis e, portanto, nem todos os fragmentos se mantm nas clulas
que os captam.
No caso dos plasmdeos, como estes apresentam uma origem de replicao, podem manter-se na clula
sem necessidade de se integrarem no cromossoma.
Fragmento de DNA liga-se parede da bactria por adeso de uma das cadeias. H formao de um
pilus ao qual o DNA se liga por atraco electrosttica. Cargas negativas do DNA interagem com cargas positivas
dos aminocidos do pilus.
Pilus retrai-se e o DNA fica em contacto com o periplasma (entre a membrana plasmtica e a membrana
externa) e o peptidoglicano. Est no interior da parede celular.
Uma endonuclease corta o DNA em fragmentos mais pequenos (15-40Kb). H um limite para o tamanho
dos fragmentos que entram na clula. H um limite para o tamanho dos fragmentos que entram na clula. Uma
nuclease degrada a cadeia dupla, obtendo-se ssDNA.
A cadeia simples entra na clula por transporte activo e associada a ssB-proteins, no sendo
degradada. O sistema Rec-A procura regies homlogas no cromossoma e se no encontrar nenhuma o DNA
acaba por ser destrudo.
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Transformao artificial, clssica ou qumica
Bactrias E. coli no naturalmente competentes podem ser induzidas a tornar-se competentes. Para tal:
A frequncia de transformao baixa (0,01%) e varia com o tamanho dos fragmentos: ideal para
cadeias <10Kb e praticamente nula para fragmentos >50Kb.
Esta tcnica rpida e simples mas tem que ser ajustada a cada tipo de organismo, uma vez que os
parmetros elctricos, como a voltagem e a resistncia, no so universais.
Embora no seja o mtodo ideal, a electrotransformao tem uma eficincia superior transformao
clssica. Entre os factores que afectam a eficincia pode destacar-se:
Temperatura;
Parmetros elctricos;
Topologia do DNA: quanto mais pequenos e mais enrolados estiverem os plasmdeos maior a
eficincia.
Clula hospedeira: condies de crescimento, sistemas de restrio, patrimnio gentico, etc.
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Procedimento experimental
Recolher clulas numa fase de crescimento exponencial.
Centrifugar e recolher clulas.
Ressuspender clulas em gua estril e colocar em banho de gelo. Lavar as clulas vrias vezes com
gua estril/destilada elimina os sais presentes no meio e evita curto-circuito.
Adicionar DNA plasmdico e submeter choque. No deixar bolhas de ar na soluo para evitar curto-
circuito.
Adicionar imediatamente um meio nutritivo. Para promover recuperao celular.
Seleccionar transformantes. Usar meio selectivo.
Conjugao bacteriana
A conjugao bacteriana um processo de transferncia de DNA entre clulas por contacto fsico clula-a-
clula atravs de um canal proteico, o pilus sexual. As protenas necessrias para a sntese do pilus so
codificadas em plasmdeos conjugativos (tra+ mob+), como o factor F+ (fertilidade), um plasmdeo natural de E.
coli. Este plasmdeo tem 2 origens de replicao:
Ori T: origem de transferncia: local reconhecido por uma enzima (endonuclease Tray) que faz um nick
no DNA de cadeia dupla e d incio ao processo de transferncia pelo mtodo do circulo rolante.
Ori: origem de replicao do plasmdeo.
O factor F um plasmdeo bastante grande pelo que foi reduzido para poder ser mais facilmente utilizado
em Eng. Gentica.
Conjugao Triparental
A estirpe dadora adquire o plasmdeo tra+mob+ e fica conjugativa, podendo transferir o seu plasmdeo, que
contm o gene de interesse, para a estirpe receptora.
Usa-se meio selectivo que s permite a sobrevivncia da estirpe receptora. i.e. meio PIA, E. coli no
sobrevive, Pseudomonas sobrevive. (LAB1)
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Conjugao Biparental
Dadora: tem gene tra+ no cromossoma e plasmdeo de interesse com gene mob+.
Receptora: no tem gene tra+ e recebe o plasmdeo de interesse por conjugao com a estirpe dadora.
Se a conjugao for feita sobre uma membrana em vez de ser em suspenso obtm-se resultados mais rpidos
porque a proximidade entre as bactrias facilita a formao dos tubos de conjugao.
Transfeco
Qualquer fragmento de DNA pode formar um fago desde que esteja na presena das protenas da
cpsula. O fago monta-se automaticamente. Este facto aproveitado em Eng. Gentica para se introduzirem
molculas de DNA grandes (45-50Kb) em bactrias, uma vez que este processo mais eficiente que
electroporao ou transformao.
Ao introduzir uma mutao nos locais cos do fago impede-se a aco da nuclease e no so gerados os
vrios fragmentos de DNA do fago. As protenas da cpsula so sintetizadas mas no se faz a montagem dos
seus componentes. Induzindo-se a lise celular obtm-se os diversos componentes da cpside, que podem ser
usados para o empacotamento in vitro.
Utilizam-se duas estirpes independentes de E. coli infectadas com fago mas cada estirpe s produz um
tipo de protenas (da cpsula ou da cauda), pelo que os fagos produzidos no so funcionais. De cada estirpe
extrai-se um dos componentes, que podem ser juntos in vitro.
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Introduo de DNA em clulas animais
A introduo de DNA em clulas animais pode ser feita por vrios mtodos:
Nos mtodos de transfeco fsica o DNA introduzido por meios fsicos, que incluem:
Micro-injeco: utilizado apenas em clulas eucariotas grandes e um mtodo invasivo mas rpido.
Uma soluo de DNA de interesse injectada directamente no ncleo da clula por meio de uma agulha ou
pipeta muito fina.
Bombardeamento de partculas (biolstica): esta tcnica foi inicialmente desenvolvida para clulas
vegetais e consiste no bombardeamento, a alta velocidade, de microprojecteis partculas de ouro ou
tungstnio revestidas com o DNA que se quer introduzir na direco das clulas. O DNA exposto adere
superfcie das clulas-alvo e difunde-se atravs da membrana chegando eventualmente ao ncleo e integrando-
se.
Ultrassons: os ultrassons so usados para abrir poros na membrana celular e permitir a entrada de DNA.
Tem que se ter ateno frequncia utilizada pois para frequncias demasiado altas as clulas acabam por lisar.
Electrotransformao: corrente elctrica usada para abrir poros na membrana celular. Quando
comparada com a electrotransformao de bactrias, para clulas animais o pulso aplicado dever ser mais
longo e de menor intensidade (devido dimenso das clulas).
A transduo a introduo de DNA em clulas por meio de um vrus. O DNA exgeno adicionado ao
genoma completo do vrus ou usado para substituir um ou mais genes virais, sendo depois introduzido nas
clulas atravs dos mecanismo naturais de infeco viral.
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Na transferncia mediada por bactrias (bactofection) o DNA-alvo adicionado, na forma de
plasmdeo, a uma bactria que, seguidamente, infecta uma clula animal, transferindo o DNA para o seu
interior.
Tal como para a introduo de DNA em clulas animais, existem 4 tcnicas fundamentais para a
introduo de DNA em clulas vegetais:
Transduo viral
Nomeadamente por Agrobacterium tumefaciens. Esta bactria encontra-se junto s razes das plantas e
quando a planta tem um corte, que exponha as suas clulas ao exterior, a bactria infecta essas mesmas clulas.
Estas bactrias possuem o plasmdeo Ti (tumor induction) que responsvel por provocar o crescimento
descontrolado das clulas que infecta. Este plasmdeo contm uma regio, T-DNA, que copiada para o genoma
das clulas. Nesta regio existem genes onc responsveis pela formao de tumores e pela sntese de opinas,
compostos usados como fonte de energia pela bactria.
Em Eng. Gentica introduzem-se genes de interesse na regio do T-DNA de modo a que estes sejam
integrados no genoma da planta. comum alterarem-se os genes onc para evitar o crescimento celular
descontrolado.
Apesar de til, este mtodo apenas permite a transformao de clulas na zona de corte, o que no
vivel quando se quer produzir uma planta totalmente transgnica. Para isso necessrio infectar uma cultura
de clulas, cujos transformantes vo dar origem a novas plantas, j com as caractersticas desejadas.
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Inocula-se uma suspenso celular com a bactria transformante e seleccionam-se as clulas
transformantes, que so cultivadas num meio nutritivo e com um cocktail de hormonas. O plasmdeo Ti
recombinado no tem genes onc e tem uma marca de seleco que permita identificar as clulas transgnicas.
Uma reaco de PCR resulta na amplificao selectiva de uma dada regio do DNA. As fronteiras da regio a
amplificar tm que ser conhecidas e tm que ser sintetizados dois pequenos oligonucletidos (primers) que
delimitem essa regio, para que a polimerase possa iniciar a replicao das cadeias do DNA.
Passos da PCR
Desnaturar DNA por aumento da temperatura (at 94-95C).
Hibridao dos primers a temperatura de annealing (50-65C) temperatura utilizada depende das
caractersticas dos primers.
Extenso das cadeias, a 72C, pela enzima Taq polimerase termoestvel e provm do organismo
Thermus aquaticus. No proofreading. Repetem-se 25 a 30 ciclos.
Extenso final permite a sntese de cadeias que possam ter ficado incompletas.
Em cada ciclo so sintetizadas o dobro das cadeias iniciais. Por cada molcula dupla de DNA so
sintetizadas duas molculas. No final da reaco tm-se 2n-2 fragmentos (n o nmero de ciclos e a base 2
provm do facto de nos primeiros dois ciclos serem obtidas duas molculas longas) de DNA alvo.
Material necessrio
H20
dNTPs
Primers
DNA alvo
Taq polimerase
Tampo (enzima)
MgCl2 (cofactor da enzima)
Misturam-se todos os componentes no tubo de PCR. Estes tubos tm tamanho reduzido para que a temperatura
no seu interior seja sempre mais ou menos homognea.
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Design de primers
Os primers so o ponto-chave para o sucesso da PCR. Se os primers forem mal escolhidos pode no se
obter qualquer produto de PCR ou pode obter-se um ou mais fragmentos errados.
Os primers devem flanquear a regio do DNA que se quer amplificar e serem complementares cadeia
para a qual serviro de molde durante a replicao.
Primer codificante: permite a sntese da cadeia superior, no sentido 5 3. Lido directamente na sequncia
alvo. Primer codificante upper primer.
Primer codificante
5 GTAGCCTAATCCGGATCGT TAGCCTGCAA 3
3 CATCGGATTAGGCCTAGCAATCGGACGTT 5
Nota: os primers no devem ser complementares entre si para no hibridarem um com o outro.
Para garantir a eficincia da reaco de PCR os fragmentos amplificados no devem ser inferiores a 1Kb
nem superiores a 3Kb, embora seja possvel utilizar fragmentos com at 10Kb. Amplificao de fragmentos
maiores requer mtodos especiais.
Um dos primeiros aspectos a ter em conta aquando da escolha de primers o seu tamanho. Primers
demasiado pequenos podem hibridar com vrias zonas e dar origem a produtos indesejados.
8-mer (primer com 8 nucletidos) pode hibridar, estatisticamente, em 46000 locais do genoma humano. J um
17-mer espera-se que apenas encontre uma sequncia complementar em todo o genoma menos provvel
que origine produtos inespecficos.
No entanto, primers demasiado longos tambm no so aconselhveis porque levam mais tempo a
hibridar e diminuem a eficincia da PCR. Na prtica no se utilizam primers com mais de 30 nucletidos. No s
devido diminuio da eficincia da reaco mas tambm porque so muito mais caros de sintetizar.
A temperatura de ligao dos iniciadores tambm muito importante. Deve ser suficientemente alta
para que hibridaes no perfeitas sejam instveis mas no deve ultrapassar a temperatura de fuso dos
primers (Tm), qual eles se mantm sempre dissociados do DNA. 1-2C abaixo da Tm considerada a
temperatura ideal de ligao.
Os primers devem ainda ser desenhados de modo a que os primers codificantes e no-codificantes
tenham temperaturas de ligao semelhantes. Pode jogar-se com o tamanho dos primers.
25
Tm pode ser determinada pela frmula:
Nem sempre se conhece a sequncia do DNA que se quer amplificar pelo que tm que se desenhar os
primers recorrendo sequncia de aminocidos da protena codificada por esse mesmo DNA.
Nos locais em que podem estar presentes vrias bases utilizam-se bases degeneradas (que emparelham
com qualquer nucletido), como a inosina. Aos primers assim formados d-se o nome de primers degenerados.
Produtos de PCR
Electroforese em gel;
Clonagem;
Sequenciao.
A clonagem de um produto de PCR no to simples como pode parecer pois a Taq polimerase adiciona
um nucletido, geralmente adeninas, extremidade 3 de cada cadeia que sintetiza, dando origem a fragmentos
de extremidades no cegas.
Para ultrapassar este facto, pode usar-se uma exonuclease para remover as bases extra, mas difcil
prevenir que o DNA de interesse no seja tambm digerido. Pode tambm utilizar-se um vector que tenha
projeces de timina, de modo a que estas emparelhem com as adeninas do fragmento de PCR.
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No entanto, uma das solues mais utilizadas o design de primers que j incluem locais de restrio na
regio 5. Desde que a extremidade 3 do primer tenha cerca de 70% de complementaridade, o primer hbrida
com a molcula de DNA alvo inicial, permitindo que a regio de restrio seja copiada para os produtos finais de
PCR. Esses produtos podem depois ser restringidos e ligados a vectores com extremidades coesivas.
Vectores de Clonagem
Vectores de clonagem para E. coli
Plasmdeos
Nomenclatura:
pBR322
p: plasmdeo
BR: laboratrio onde foi construdo, cientistas que o desenvolveram
322: distino entre plasmdeos do mesmo laboratrio
pBR322 foi um dos primeiros plasmdeos a serem construdos e apresenta algumas caractersticas muito teis:
pequeno (4363 bp) permite clonagem de fragmentos com 6Kbp e clonado facilmente.
Tem duas marcas de seleco (resistncia a ampicilina e tetraciclina) cada uma com um local de
restrio nico.
Tem vrios locais de restrio nicos que permitem clonar genes com vrios tipos de extremidades
coesivas.
Tem um nmero de cpias razoavelmente elevado e que pode ser aumentado na presena de um
inibidor da sntese proteica, o cloranfenicol (at 1000-3000 cpias).
No entanto, este plasmdeo conjugativo, o que pode no ser muito benfico devido transferncia
indesejada de genes entre espcies.
O plasmdeo pBR322 foi construdo a partir de 3 plasmdeos naturais de E. coli que forneceram:
R1: ampR
R6.5: tetR
pMB1: ori
A seleco de transformantes utilizando-se pBR322 pode ser feita atravs da resistncia ampicilina ou
tetraciclina.
Suponhamos que restringimos o vector com BamHI e introduzimos o gene de interesse na regio que
codifica o gene tetR. As clulas transformantes vo possuir apenas resistncia ampicilina, mas este antibitico
no pode ser usado unicamente para a seleco porque tambm o vector tem ampR. Para ultrapassar este
27
problema fazem-se dois riscados de colnias transformantes em placas contendo meio nutritivo e amp ou tet.
As colnias que no crescerem em meio com tetraciclina so as que desejamos e podemos isol-las a partir do
meio apenas com ampicilina.
Amp Tet
(1) (2)
Se clonssemos o gene utilizando a enzima PstI iramos alterar o gene de resistncia ampicilina em vez de
tetraciclina e o processo de seleco seria anlogo.
28
A seleco de recombinantes em pUC8 envolve o gene LacZ. Este gene codifica a sntese da protena -
galactosidase, envolvida na degradao da lactose em glucose e galactose.
Algumas estirpes de E. coli tm o gene LacZ modificado no seu genoma e s so capazes de metabolizar
a lactose na presena de plasmdeos, como o pUC8. Em Eng. Gentica utilizam-se estas estirpes para seleccionar
recombinantes, juntamente com um composto anlogo lactose, a X-gal, mas que adquire a cor azul quando
degradado pela -galactosidase, permitindo a identificao de colnias.
A insero de um gene no vector pUC8 inactiva o gene LacZ, o que significa que colnias recombinantes
cultivadas em meio com X-gal no vo ficar azuis. A seleco pode ento ser feita num meio nutritivo com
ampicilina (sobrevivem apenas as clulas transformantes) e X-gal (as colnias brancas so as recombinantes).
Recombinantes
No-recombinantes
Os fagos contm genes necessrios replicao codificados em genes das protenas da cpsula, pelo
que no se pode eliminar essas regies. Deste modo, a liberdade para modificar fagos fica mais restringida e s
se conseguem clonar genes pequenos, at 1,5Kb.
No entanto, clonagem em vectores M13 importante pois obtm-se fragmentos de DNA de cadeia
simples, muito utilizadas para sequenciao e mutagnese dirigida.
Genoma do fago.
Gene LacZ que permite a seleco de recombinates.
Polylinker local mltiplo de clonagem, no interior do LacZ. Tem locais de restrio para EcoRI, BamHI,
SalI e PstI.
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O mtodo de seleco utilizado para o M13mp7 semelhante ao do pUC8, embora no se tenha
resistncia a ampicilina para seleccionar os transformantes.
Cultivam-se as clulas num meio nutritivo com X-gal e as colnias recombinantes so as pequenas e
brancas: colnias brancas porque significa que o gene LacZ no est funcional e pequenas porque esse facto
indica que as clulas crescem menos devido ao peso metablico adicional do plasmdeo.
Fagemdeo (i.e., pEMBL8) um vector hbrido entre um plasmdeo e um fago M13 criado de modo a permitir a
clonagem de genes de dimenso superior s 1,5Kbp permitidas pelo M13pm7.
A regio de replicao do fago, sem as protenas da cpsula mas contendo uma zona reconhecida pelas
enzimas que transformam o DNA em cadeia simples, inserida num plasmdeo como o pUC8, que apresenta os
genes LacZ e ampR.
Como um fagemdeo no contm a informao relativa sntese das protenas da cpsula, quando se
quer obter um fago tem que se infectar as clulas com um fago ajudante. mais fcil extrair o DNA utilizando as
caractersticas do fago.
Com o fagemdeo pEMBL8 podem clonar-se fragmentos de DNA de cadeia simples com 6Kbp.
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Vectores de clonagem baseados no fago
Antes de se desenvolverem vectores baseados no fago foi necessrio resolver dois problemas:
S se podiam adicionar fragmentos com 3Kbp fragmentos maiores tornam o fago demasiado grande
para ser encapsulado.
No existiam locais de restrio nicos.
A eliminao de uma regio essencial do genoma do fago, responsvel pela integrao do fago no DNA
cromossmico e sua posterior exciso, permitiu que fossem disponibilizados mais 15Kbp para a clonagem de
fragmentos, perfazendo um total de 18Kbp.
A remoo da regio referida implica que o fago deixa de ser capaz de realizar o ciclo lisognico (realiza
apenas o ciclo ltico), o que at uma caracterstica desejvel para os vectores.
Infectam-se E. coli que produzem endonucleases EcoRI. A maioria do DNA restringido mas algumas molculas
mutadas (que contm menos ou nenhum local de restrio para EcoRI) persistem, sendo seleccionadas. Ao fim
de alguns ciclos de infeco obtm-se o DNA com as caractersticas pretendidas.
Vectores de insero: tm um nico local de clonagem, adicionando-se o fragmento de DNA desejado ao vector
local.
Vectores de substituio: tm dois locais de restrio que flanqueiam uma regio do DNA que substituda
pelo fragmento pretendido.
A seleco dos fagos recombinantes feita naturalmente pois apenas os fragmentos de DNA de
dimenso 45Kbp a 52Kbp so empacotados. Deste modo, basta apenas garantir que o vector recombinado se
encontra dentro desta gama de tamanho e que o vector simples tenha menos que 45Kbp para que os nicos
fagos completos que se obtm sejam recombinados.
Um cosmdeo tem ainda uma marca de seleco (i.e.: ampR) e uma origem de replicao. basicamente
um plasmdeo com um local cos. Aprensentam um nico local de restrio e durante o processo de insero
geralmente formam-se catenanos. O processo de empacotamento ainda realizado in vitro e os fagos so
depois usados para infectar E. coli cultivadas em meio selectivo contendo ampicilina.
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Bibliotecas genmicas
Vectores e outros vectores de elevada capacidade permitem a criao de bibliotecas genmicas. Estas
bibliotecas consistem num conjunto de clones recombinantes que contm todo o DNA de um organismo, sendo
muito teis para estudar genes individualmente. Podem ser guardadas durante muitos anos e partilhadas entre
laboratrios.
O nmero de clones necessrio para fazer uma biblioteca genmica pode ser calculado pela frmula:
A maioria das estirpes de S. cerevisae tem um plasmdeo natural, o plasmdeo 2m que apresenta
algumas caractersticas:
Pequeno (6Kbp).
70-200 cpias por clula.
Tem origem de replicao.
No tem marca de seleco um problema.
Os organismos hospedeiros vo ser auxotrficos para um determinado aminocido, i.e. vo ter em falta um
gene responsvel pela sntese desse a.a. e s sobrevivem se este for suplementado ao meio de cultura.
Nos vectores para levedura introduz-se os genes que esto no funcionais no hospedeiro e cultivam-se os
transformantes em meio mnimo (sem a.a. adicionados) de modo que s os organismos que captaram o
plasmdeo vo conseguir sobreviver.
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YEps Plasmdeos epissomais de levedura
YEps so plasmdeos derivados do 2m e so do tipo vai-vm pois replicam tanto em E. coli como em S.
cerevisae.
Como a extraco de DNA plasmdico em levedura complicada (o plasmdeo pode integrar-se no genoma)
clonam-se sempre os fragmentos primeiro em E. coli. A partir das colnias recombinantes seleccionadas extrai-
se o DNA e introduz-se em S. cerevisae, seleccionando-se depois utilizando meio mnimo.
Os YEps so epissomais, o que significa que se podem integrar no DNA cromossmico da levedura e,
posteriormente, serem retirados. Epissomal Integrativo (integrativo fica inserido no cromossoma para
sempre).
A integrao d-se por recombinao homloga (gene LEU2 do plasmdeo tem regies homlogas ao gene
respectivo no funcional no genoma da levedura) e permite que todas as geraes futuras apresentem as
caractersticas pretendidas.
No entanto, quando o objectivo da clonagem a produo de uma protena para extraco mais eficiente
usar plasmdeos no integrativos pois estes tm um elevado nmero de cpias.
Quando h integrao no genoma, s possvel obter uma cpia do gene em cada organismo.
YIps, Yeast Integrative plasmids, so plasmdeos bacterianos que contm um gene de levedura. No so
replicveis em levedura (no contm regies do plasmdeo 2m) pelo que a sua sobrevivncia em S. cerevisae
depende da integrao no genoma.
URA3 um exemplo deste tipo de plasmdeos. Consiste no pBR322 ao qual foi inserido o gene URA3,
que codifica uma protena interveniente na biossntese de nucletidos pirimidinicos (T,C).
YRps, Yeast Replicative plasmids, tm uma origem de replicao para levedura e no se integram no
genoma. So instveis e podem ter entre 5 a 100 cpias.
YRp7 um exemplo deste tipo de plasmdeo e composto pelo pBR322 e tem um gene de levedura,
TRP1, que est envolvido na sntese do triptofano e adjacente a uma origem de replicao em levedura.
YRps no tendem a ser copiados para clulas filhas durante a diviso celular.
33
YACs cromossomas artificiais de levedura
YACs so utilizados para clonar longos (at 1400Kbp) fragmentos de DNA. Tm a estrutura de um
cromossoma e, portanto, apresentam 3 componentes essenciais:
pYAC3, um exemplo de YACs, contm vrios genes responsveis por diferentes caractersticas:
Tem um local de restrio para a endonuclease SnaBI. TRP1, URA3 e SUP4 so teis para a seleco de
recombinantes.
11,4 Kb
34
Vectores de clonagem para plantas superiores
Para plantas superiores, os vectores de clonagem mais usados so baseados no Ti, plasmdeo natural de
Agrobacterium tumefaciens.
O plasmdeo Ti tem grandes dimenses ( 200Kbp) e um nico local de restrio, pelo que a sua
manipulao se torna complicada. Para ultrapassar essa dificuldade utilizam-se duas estratgias:
Estratgia vector binrio: a regio do T-DNA no precisa de estar fisicamente associada ao resto do
plasmdeo Ti. Utilizam-se dois plasmdeos no processo de infeco:
Plasmdeo 170Kbp que contm a regio de virulncia e a regio de especificidade para o
hospedeiro. Este plasmdeo permite a infeco das clulas animais mas mantm-se na
agrobactria, no sendo transferido.
Plasmdeo 20Kbp que contm o T-DNA e um nico local de restrio. neste plasmdeo que
inserido o gene de interesse. transferido para as clulas vegetais e sofre recombinao,
integrando-se no DNA cromossmico.
Estratgia de cointegrao: utiliza-se um plasmdeo baseado num vector E. coli mas que contm duas
repeties de 25bp pertencentes ao T-DNA (verificou-se que estas eram as nicas regies envolvidas no
processo de infeco. J no tem oncogene a regio dos oncogenes pode ser substituda por DNA de interesse
no h formao de tumores).
Este plasmdeo, designado Ti desarmado, apresenta ainda o gene LacZ e kanR (resistncia canamicina),
necessrios para a seleco de recombinantes e, devido s repeties de T-DNA, integra-se no genoma das
clulas para os quais transferido.
A clonagem com plasmdeos de Agrobacterium tumefaciens tem a desvantagem de s poder ser usada
em plantas dicotilednias (tipo de plantas com flor). i.e. tomate, tabaco, batatas, ervilhas, feijes.
Quando se pretende uma grande expresso do DNA exgeno comum inserir o novo DNA no genoma
dos cloroplastos, pois estes existem em muita quantidade nas clulas. A introduo do DNA deve ser feita por
meios fsicos.
A clonagem de insectos como a Drosophila (mosca da fruta) faz uso de transposes designados
elementos P.
Um transposo uma curta sequncia de DNA (<10Kbp) que se pode mover entre vrias regies do
cromossoma de uma clula. So constitudos por duas repeties invertidas (IR) que flanqueiam o gene da
transposase, a protena responsvel pela mobilidade das sequncias de insero (IS).
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Para clonar genes de interesse utilizam-se vectores que contm dois elementos P:
Um deles tem a transposase interrompida pelo DNA que se quer inserir na clula.
O outro tem a transposase intacta mas no tem repeties invertidas no pode ser transferido.
O vector introduzido nas clulas alvo por microinjeco. A transposase sintetizada e a sequncia
transferida para o genoma a que contm o gene de interesse.
O mtodo mais simples para obter um clone de um determinado gene atravs de PCR. No entanto,
isso nem sempre possvel quando no se conhece a sequncia de nucletidos do gene. Existem duas
estratgias bsicas para permitir a seleco de genes:
Seleco directa de genes de interesse atravs do crescimento em meio selectivo. O gene clonado deve
conferir uma caracterstica que permita a seleco, como uma caracterstica morfolgica, a resistncia a um
antibitico ou uma protena associada a uma via biossinttica (para organismos auxotrficos). Esta tcnica pode
ser extendida a organismos (estirpes) mutantes, nomeadamente a estirpes auxotrficas.
Limitaes: deve existir uma estirpe mutante para o gene em questo e um meio onde apenas os organismos
recombinados sobrevivam.
Aplicaes: pode utilizar-se para a maioria dos genes que codificam para enzimas biossintticas e no est
restringida a E. coli, pois existem outras bactrias e at leveduras auxotrficas.
Identificao a partir de uma biblioteca genmica atravs do uso de sondas Hibridao de Southern.
Numa biblioteca genmica de eucariotas utiliza-se cDNA clonado em plasmdeos, YACs, BACs, etc. Devido
presena de intres recorre-se ao transcritema e no ao genoma das clulas. Deve ter-se tambm em ateno o
facto de clulas diferentes expressarem diferentes genes.
Para seleccionar um gene cuja protena no sintetizada no fgado utilizam-se clulas hepticas e no quaisquer
outras.
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RNase + PolI
Como a expresso dos vrios genes de eucariotas no uniforme, para alguns vo obter-se clones mais
abundantes do que para outros.
A identificao de um clone contendo o gene de interesse pode ser feita atravs de hibridao de cidos
nucleicos, nomeadamente pelo mtodo de Hibridao de Southern.
Hibridao de Southern
Extraco de DNA;
Digesto com endonucleases de restrio;
Electroforese (separam-se os diferentes fragmentos obtidos);
Desnaturao do DNA atravs de uma base (NaOH) no se desnatura por temperatura porque o gel de
electroforese iria derreter. Antes da desnaturao pode fazer-se uma depurinao com HCl.
Transferncia do DNA (cadeia simples) para uma membrana de nylon ou nitrocelulose.
Sobre o gel virado ao contrrio (para o DNA ficar mais perto da superfcie) coloca-se uma membrana de nylon,
seguida de alguns filtros de papel, guardanapos e um peso. O gel est mergulhado num tampo que absorvido
por capilaridade e arrasta consigo o DNA, que fica retido na membrana por foras electrostticas (entre cargas
negativas do DNA e cargas positivas do nylon). Para a fixao total do DNA membrana criam-se ligaes
covalentes atravs da exposio a radiao UV (3-5 min).
Realizar pr-hibridao bloquear membrana.
Adiciona-se membrana DNA heterlogo de um organismo filogeneticamente distinto (geralmente DNA de
esperma de salmo) para que haja pouca complementaridade.
A pr-hibridao feita a baixa temperatura para que todo o DNA hibride, mesmo tendo pouca
complementaridade, e a membrana fique bloqueada.
Hibridao com sonda previamente preparada.
[sais] e temperatura favorece hibridao, mas pode levar a hibridaes inespecficas e rudo de fundo.
A sonda vai competir com o DNA heterlogo e ligar-se apenas s regies onde h homologia (zonas onde
compete com o DNA de pr-hibridao). A hibridao deve ser realizada a uma temperatura suficientemente
alta para no permitir ligaes inespecficas mas no demasiado elevada para que possa ocorrer, de facto,
alguma ligao.
Lavar para remover hbridos instveis lavar a temperatura e agitao adequadas.
Identificar fragmentos-alvo no gene.
Esses fragmentos podem depois ser isolados e utilizados para diversos fins (sequenciao, clonagem, etc).
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A hibridao tambm pode ser feita directamente de colnias:
As sondas usadas na hibridao devem ter entre 100 e 1000bp (no devem ser muito grandes para no
tornar a sua marcao muito complicada, nem muito pequenas para evitar que se liguem a locais que no as
sequncias alvo), ter pelo menos parte da sua sequncia em comum com o gene de interesse e devem ser
marcadas (marcao radioactiva ou no-radioactiva) de modo a permitir a identificao dos genes alvo.
Marcao radioactiva consiste na incorporao de nucletidos que contm um istopo radioactivo de fsforo
na molcula de DNA. Essa incorporao pode ser feita por:
A deteco dos fragmentos com sonda, aps hibridao, feita por autoradiografia.
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Mutagnese e Interferncia
Mutagnese e interferncia podem ser feitas por vrios mtodos e em diferentes tipos de organismos:
Bactrias:
Mutagnese aleatria transposo.
Eliminao de genes.
Inactivao por insero.
Levedura:
Mutantes de eliminao simples ou duplos.
Eucariotas:
siRNA (RNA de interferncia).
Mutagnese dirigida.
A eliminao/inactivao de genes pode ser utilizada para criar estirpes mutantes para hospedeiros de
clonagem ou para estudar a aco de um determinado gene.
Mutagnese aleatria
Transposes so elementos mveis do DNA, com dimenso de 1 a 10Kbp, que podem ser inseridos em diversos
locais do genoma por recombinao no homloga, dando origem a um novo rearranjo dos genes (podem ficar
no funcionais).
Transposase: enzima que corta o transposo nas sequncias invertidas e cliva o DNA alvo em locais
aleatrios.
Os restantes passos da transcrio so feitos por enzimas do organismo hospedeiro.
Repeties invertidas: regies da extremidade do transposo que so reconhecidas pela transposase.
Como as sequncias esto invertidas, as duas extremidades so iguais.
Marcas de seleco: genes, por exemplo de resistncia a antibiticos, que permitem a seleco das
molculas que contm o transposo.
Um transposo pode ser inserido num vector para E. coli, onde replica, e depois ser transferido para
outro tipo de clulas. A, o transposo vai, eventualmente, inserir-se no genoma e silenciar um gene. No
entanto, como o plasmdeo no possui origem de replicao para o organismo hospedeiro diz-se um plasmdeo
suicida.
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Um plasposo um transposo que contm uma origem de replicao para bactrias entre as
sequncias invertidas, podendo ser convertido num plasmdeo.
Na mutagnese aleatria, uma vez identificadas as colnias (cultivadas em meio selectivo) que
apresentam o fentipo pretendido, necessrio recuperar a regio onde o transposo/plasposo se inseriu e
identificar o gene mutado. Para tal procede-se do seguinte modo:
No convm que um transposo se tenha inserido em mais do que uma regio do genoma pois assim
torna-se mais difcil identificar o gene de interesse. Para verificar se a insero foi nica, digere-se o genoma e
corre-se num gel de electroforese. Faz-se uma sonda a partir da sequncia do transposo e identificam-se os
fragmentos por hibridao de Southern.
Quando o fentipo alvo codificado por um opero torna-se difcil identificar qual dos genes
realmente o responsvel pela caracterstica procurada. A mutao pode ocorrer num regio promotora,
comprometendo toda a sntese, ou numa regio codificante, silenciando apenas alguns dos genes.
Para eliminar genes de bactrias utiliza-se plasmdeos no replicativos (>1Kbp*) com regies homlogas s
regies que flanqueiam o gene alvo. A eliminao vai basear-se numa recombinao homloga dupla.
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1) Clonar regies que flanqueiam o gene.
X Y Z locais de restrio
Permitem a ligao dos fragmentos na ordem
correcta.
Pode usar-se vectores suicidas: replicam em E. coli (permitem amplificao do vector) mas no no
organismo onde se quer fazer a eliminao. Como os vectores so suicidas, sabemos que vo ter de se integrar
no genoma ou ento vo ser destrudos.
Espera-se que ocorra recombinao homloga entre o vector e a zona do genoma que contm os genes
clonados. O genoma passa a ter o vector e, portanto, a bactria pode ser seleccionada.
Recombinao simples:
O stress ambiental aumenta a frequncia de recombinao e mais provvel que ocorra a recombinao que
queremos.
Recombinao dupla: o genoma vai recombinar consigo prprio, podendo ou no eliminar o gene E1.
41
4) Plaqueiam-se as colnias em meio LB suplementado com X-gluc. Seleccionam-se as colnias brancas.
gusA, uma das marcas de seleco do vector utilizado, codifica uma protena que degrada o X-gluc e lhe confere
a cor azul.
Os recombinantes simples tm o vector inserido no genoma e, portanto, degradam o X-gluc, dando origem a
colnias azuis.
5) Realizar hibridao de Southern ou PCR para distinguir as estirpes de eliminao das estirpes selvagens.
Uma outra estratgia de eliminao, mais simples em termos de seleco, a substituio do gene por uma
cassete interposo que codifica uma protena de resistncia a um antibitico.
Estratgia geral:
4) Plaquear as colnias obtidas em meios LB com gentamicina e tetraciclina. Seleccionar as colnias que
no crescem em tetraciclina.
Os recombinantes simples vo conter o vector e, por isso, tm resistncia tetraciclina, para alm da resistncia
gentamicina.
Os recombinantes duplos tm a cassete no local do gene e j perderam o vector, pelo que s apresentam
resistncia gentamicina.
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As cassetes so apropriadas para eliminar genes de operes pois contm um promotor e no tm
terminador. Garante-se que os genes seguintes ainda so transcritos.
Quando se suspeita que um gene pode ter propriedades interessantes no se procede logo sua
eliminao. Nestes casos interrompe-se o gene, silenciando-o ou levando sntese de uma protena no
funcional. Esta tcnica tambm utilizada quando no se consegue eliminar determinado gene, provavelmente,
porque ele essencial.
Utiliza-se um vector que contm uma regio homloga ao gene que se quer interromper. Por
recombinao, o vector insere-se no genoma e inactiva o gene.
Se na zona interrompida existir o promotor para genes seguintes pode comprometer-se a sua leitura, o
que pode constituir um problema.
Para eliminar genes em S. cerevisae utiliza-se a cassete KanMX, que confere resistncia geneticina. Nas
extremidades da cassete inserem-se 40 nucletidos (de cada lado) da sequncia do gene alvo, para que ocorra
recombinao homloga.
43
Estratgia geral de eliminao de ORFs:
1) Design de primers que contenham regies que flanqueiam a cassete e 40 nucletidos do gene alvo.
2) Fazer PCR e inserir produto de amplificao directamente em S. cerevisae.
Esta tcnica difere da eliminao em bactrias pois no preciso clonar fragmentos em E. coli e podem usar-se
fragmentos lineares.
Em S. cerevisae possvel fazer mutantes mltiplos, mas para isso necessrio eliminar a cassete aps
cada eliminao.
A cassete utilizada agora a KanMX4, que semelhante KanMX mas tem duas regies iguais, as loxp,
que podem recombinar entre si.
A recombinao ocorre na presena do plasmdeo pSM47 e a cassete KanMX4 eliminada. Pode ento
proceder-se eliminao de outros genes.
pSM47 codifica a recombinase Cre, responsvel pela recombinao, e bastante instvel, sendo eliminada aps
algumas replicaes.
As leveduras so organismos dimrficos (podem estar na forma haplide ou diplide) e quando se quer
eliminar um gene essencial (que no pode ser eliminado) trabalha-se com as leveduras na forma diplide.
Para testar se um gene essencial procede-se sua eliminao numa levedura diplide. Fora-se a entrada em
meiose e vo obter-se 4 clulas, das quais apenas 2 tm o gene. Se todas sobreviverem o gene no essencial.
So sintetizados RNAs de cadeia dupla (dsRNA) que se ligam a uma protena, chamada DICER, que cliva o
material gentico em pequenas sequncias de 20 nucletidos. Essas sequncias associam-se ao complexo RISC
e so separadas em cadeias simples. O RISC faz um scan ao mRNA e transcritos presentes na clula em busca de
regies homlogas e, quando as encontra, cliva e destri esse mRNA impedido a sntese proteica.
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Na prtica o gene transcrito na mesma, mas no h sntese de nenhuma protena, pelo que como se
o gene estivesse silenciado.
siRNA (small interfering RNA) so utilizados em Eng. Gentica para silenciar genes.
In vitro, sintetizam-se pequenos dsRNAs, com extemidades coesivas de timina. Introduz-se o RNA nas
clulas e forma-se o complexo RISC, que vai reconhecer e degradar os transcritos do gene que pretendemos
silenciar.
No h formao do complexo DICER porque j se fornecem dsRNAs suficientemente pequenos. Este processo
de silenciamento transitrio pois s funciona enquanto os dsRNAs no forem todos degradados. Contudo
costuma persistir o tempo suficiente para se analisarem as alteraes no fentipo em estudo.
Mutagnese dirigida
Pode usar-se o fago M13 para introduzir uma mutao pontual. Sintetiza-se um oligonucletido que
contm a mutao pretendida e este vai hibridar com o DNA de cadeia simples do fago. Aps replicao temos
uma cadeia mutada e outra no.
Para evitar que a cadeia mutada (que no est metilada) seja corrigida, eliminam-se os sistemas de
reparao do hospedeiro. A probabilidade de se obter uma cadeia mutada agora de 50:50.
Pode tambm recorrer-se a PCR para amplificar plasmdeos com mutao (j no preciso usar o M13).
Sintetizam-se 2 primers, ambos com a mutao, e amplifica-se. No final da reaco incuba-se o produto com
DnpI, uma endonuclease de restrio que s reconhece DNA metilado, e eliminam-se as cadeias originais (no
mutadas).
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