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INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE SANTIAGO PAPASQUIARO UNIDAD

EVALUACIN SENSORIAL TEMTICA I


PRCTICA No. 3 AISLAMIENTO DE GLUCGENO, HIDRLISIS Y DETERMINACIN DE
GLUCOSA

PRCTICA No. 3 Aislamiento de glucgeno, hidrlisis y determinacin de glucosa

Objetivos:

Utiliza las metodologas de bioqumica experimental para la extraccin de glucgeno a partir de


tejido animal y realizar su determinacin cualitativa.

Determinar la funcin e importancia del glucgeno.

Marco terico:

El glucgeno es un polmero a travs del cual los animales almacenan glucosa. El glucgeno puede
ser sintetizado o degradado en la mayora de las clulas animales y solo dos tejidos lo contienen en
grandes cantidades: msculo e hgado. En el hgado puede ocupar hasta un 10% de su peso y en
msculo, un 1%. En situacin de ayuno, el glucgeno es la primera reserva que se moviliza para
mantener la glucemia, al menos durante dos horas.

El glucgeno consta de cadena de glucosa unidas por enlaces glucosdicos a (1-4) y


ramificaciones, cada 8 o 10 unidades de glucosa, mediante enlaces glucosdicos a (1-6). Para
extraer glucgeno del hgado se debe realizar una homogeneizacin del tejido y ruptura celular,
seguido de una extraccin y eliminacin de las protenas (desproteinizar) para evitar interferencias
en los anlisis posteriores. Para la obtencin de glucosa (anlisis cualitativo) hay que someter al
precipitado de glucgeno a una hidrlisis cida, de esta forma se rompen los enlaces glucosdicos y
se libera glucosa.

Algunos azcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes


suaves como el ion Fe 3+ o Cu 2+. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo carbonilo
libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azcares con un grupo
carbonilo libre son llamados azcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se
encuentra combinado en unin glicosdica se conocen como azcares no reductores. Existen varias
reacciones qumicas que permiten determinar si se est en presencia de un azcar reductor o no.

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PRCTICA No. 3 AISLAMIENTO DE GLUCGENO, HIDRLISIS Y DETERMINACIN DE
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La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reaccin o no de un


azcar con el ion Cu 2+, por lo que, la valoracin cualitativa de la cantidad de glucosa presente en
cada hidrolizado se realizar mediante esta prueba aprovechando el carcter reductor que tienen
todos los monosacridos. La aparicin de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo
evidencia la presencia de un azcar reductor.

Normas especficas de seguridad para la prctica

Cuadro de deteccin de riesgos.


Reactivo o sustancia Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso
de accidente
Reactivo de Benedict* H319: Provoca irritacin P280: Llevar guantes, P305+P351+P338: EN
ocular grave. prendas, gafas y CASO DE CONTACTO
H411: Txico para los mscara de proteccin. CON LOS OJOS: Aclarar
organismos acuticos, P273: Impida que se cuidadosamente con
con efectos nocivos libere al medio ambiente. agua durante varios
duraderos. minutos. Quitar las
lentes de contacto, si
lleva y resulta fcil.
Seguir aclarando
Hidrxido de potasio Severo dao si es No comer, lavarse las No inducir al vmito.
KOH al 30%** ingerido, irritacin severa manos despus de su Beber abundante agua,
en la piel, en contacto uso. lavar la boca con agua.
con los ojos puede P280: Llevar guantes, Lavarse al menos 15
causar dolor, prendas y gafas de min. con abundante
quemaduras proteccin. agua y jabn en caso de
posiblemente severas en contacto. Quitarse las
funcin del tiempo de ropas contaminadas.
contacto Lavar los ojos durante 15
min. con abundante
agua
cido Sulfrico Severo dao si es No inducir al vmito,
H2SO4 5N** ingerido, quemaduras beber abundante agua,
graves por contacto, lavar la boca con agua,
lesiones oculares no proceder a pruebas
graves, quemaduras de neutralizacin.
posiblemente severas en Lavarse al menos 15
funcin del tiempo de min. con abundante
contacto. agua y jabn en caso de
Corrosivo para los contacto. Quitarse las
metales. ropas contaminadas.

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Lavar los ojos durante 15


min. con abundante
agua
Fenolftalena al 1% *** Daino si es ingerido, No comer, lavarse las Inducir al vmito.
puede causar irritacin manos despus de su Beber abundante
leve por contacto; uso. agua.
puede causar cncer P280: Llevar guantes, Lavarse con
dependiendo del nivel prendas y gafas de abundante agua en
y duracin de la proteccin. caso de contacto.
exposicin. Quitarse las ropas
contaminadas
Hidrxido de sodio Severo dao si es No comer, lavarse las No inducir al vmito.
NaOH 5N ingerido, irritacin severa manos despus de su Beber abundante agua,
en la piel, en contacto uso. lavar la boca con agua.
con los ojos puede P280: Llevar guantes, Lavarse al menos 15
causar dolor, prendas y gafas de min. con abundante
quemaduras proteccin. agua y jabn en caso de
posiblemente severas en contacto. Quitarse las
funcin del tiempo de ropas contaminadas.
contacto Lavar los ojos durante 15
min. con abundante
agua
Nota: Esta prctica representa un bajo riesgo, no obstante es importante acatar el reglamento
vigente colocado a la entrada del laboratorio. Estos datos son proporcionados como gua, para
mayor informacin consulte la ficha de seguridad correspondiente. En casos graves buscar atencin
mdica inmediatamente.

Consideraciones relativas a la eliminacin:


* P501: Elimnense esta sustancia y su recipiente en un punto de recogida de eliminacin residuos
especiales o peligrosos, conforme a la reglamentacin local, regional, nacional y/o internacional.
** Neutralizacin o dilucin y desecho por la tarja.
*** No disponible.

Materiales y Sustancias.

Tubos de ensayo de plstico. KOH al 30% Fenolftalena (en etanol)


Tubos de vidrio graduados Na2SO4 15% Reactivo Benedict

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Pipetas Alcohol etlico


Centrfuga de mesa H2SO4 5N
Potencimetro NaOH 5N
Tubo de ensayo Hielo
Vaso de precipitado 600 mL Hgado

Procedimiento Experimental.

a) Extraccin del glucgeno de una muestra heptica fresca (ratn, pollo o res).

1. Pesar aproximadamente 4 g de hgado. En el caso de hgados de animales en ayuno, se cuidar


que el peso sea ligeramente superior a 4 g. Registrar el peso exacto de la muestra de hgado.

2. Introducir los fragmentos de hgado en dos tubos de ensayo (de 10 ml, de vidrio o de plstico
translcido).

3. Aadir a cada tubo 3 ml de KOH al 30%.

4. Incubar los tubos en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos con agitacin ocasional, hasta
la completa digestin del tejido (que no queden partculas en suspensin). PRECAUCION:
ALCALI HIRVIENDO!!

5. Enfriar y centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para eliminar los restos de tejido no digerido.

6. Pasar cuidadosamente los sobrenadantes (con una pipeta o por decantacin) a dos tubos de
vidrio graduado y previamente pesados, a los que se les aaden 0,2 ml de Na2SO4 al 15%, se agita
fuertemente y dejar reposar 5 min

7. Se precipita el glucgeno que est en solucin por adicin de 7 mL de etanol al 95%. Se agita y
deja en fro en un bao de hielo durante 5 minutos.

8. Dejar reposar en hielo durante un periodo de 5 a 10 minutos, para provocar la precipitacin del
glucgeno extrado.
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9. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para sedimentar el glucgeno.

10. Desechar con cuidado el sobrenadante y retener el precipitado o sedimento de color marrn-
blanco, que es el que contiene el glucgeno.

Nota.- La purificacin completa del glucgeno implicara tres o cuatro precipitaciones alcohlicas y
una precipitacin cida, pero en esta prctica haremos slo una precipitacin alcohlica.

11. Secar cuidadosamente con papel filtro y pesar el precipitado de glucgeno de cada tubo. Anotar
el resultado.

b) Hidrlisis cida del sedimento de glucgeno

1. Al sedimento de glucgeno obtenido en el tubo graduado, se le aade 1 ml de H 2SO4 5N para


proceder a su hidrlisis cida y para ello se calienta la disolucin cuidadosamente a 100C durante
45 minutos. Como el cido puede saltar en la ebullicin, es conveniente poner en la parte superior
del tubo papel filtro enrollado, para que absorba el cido si ste salta y evitar riesgos. Tener en
cuenta que en este tratamiento es donde se est obteniendo la glucosa que despus se puede
valorar, por lo cual no conviene perder muestra.

2. Ajustar a 2 ml con agua destilada y aadir de 2 a 3 gotas de fenolftalena como indicador para la
posterior neutralizacin.

3. Aadir gota a gota NaOH 5N y agitar bien hasta que se obtenga un pH 8 o superior. Se debe
comprobar el pH de la muestra con papel indicador o potencimetro.

4. Anotar el volumen de la disolucin, hidrolizado de glucgeno, puesto que es la disolucin


problema donde se va a comprobar la presencia de glucosa proveniente del glucgeno extrado.

c) Medida cualitativa del contenido de glucosa

1. Se disponen de dos tubos de ensayo en los que se introduce 0,5 ml del hidrolizado de glucgeno
de cada muestra, deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict. Coloque los tubos en un bao de agua
hirviendo por 5 minutos. Tenga cuidado de no quemarse.

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2. Observe cualquier cambio de color durante calentamiento. Saque el tubo y pngalo en una
gradilla y despus de un corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser
rojo, anaranjado o verdoso. Observar y anotar lo que ocurre en cada tubo.

Resultados y discusin.

Registra tus resultados en una tabla. Realizar la discusin luego del anlisis de los
resultados en funcin de los objetivos particulares y del objetivo general de la prctica

Conclusiones.

Presentar las conclusiones a las que se llegaron.

Cuestionario (Explica ampliamente):

1. Concuerdan sus resultados con lo esperado tericamente sobre carbohidratos reductores?


2. Qu otro reactivo se puede usar para anlisis de azcares reductores?
3. Qu funcin biolgica tiene el glucgeno heptico?
4. La enzima glucosa-6-fosfatasa se encuentra solo en el hgado, Qu importancia tiene esta
enzima?
5. Quedo demostrada la presencia del glucgeno en el hgado y se interpret adecuadamente su
funcin biolgica?

Anexos.

Incluir impresin o fotocopia de la rbrica para la evaluacin de la prctica y el diagrama de


flujo, a quin no la integre no se le tomar en cuenta la prctica.

Bibliografa.

Harry R M., Richard A F., Roger L M. 1997. Biochemistry - A Short Course. John Wiley
& Sons, Chapter 12.
Clark JM (1966): Bioqumica Experimental, 1 ed. Editorial Acribia (Zaragoza,
Espaa), pp 42-45.
Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. Editorial Omega
(Barcelona, Espaa), pp 304-305.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert
(Barcelona, Espaa), pp 577-580.

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Rbrica
TEMA: Funcin biolgica de los carbohidratos
EVIDENCIA DE APRENDIZAJE No. 3: Reporte de Prctica (10% de la calificacin final del curso)
El propsito de esta herramienta es orientar a los estudiantes sobre la funcin biolgica de los carbohidratos para la comprensin de la utilizacin
y almacenamiento de energa a nivel celular.

Nombre del participante: ___________________________________________________________

Nombre de la persona que evala: ___________________________________________________

NIVELES DE DESEMPEO Y PUNTOS A ASIGNAR PUNTAJE


CRITERIO
OBTENIDO COMENTARIOS
DESEMPEO
EXCELENTE NOTABLE BUENO SUFICIENTE
INSUFICIENTE
Entrega a tiempo: El El documento se El documento no se
documento fue entreg dentro del entreg dentro del
entregado dentro del tiempo establecido. tiempo establecido o
tiempo establecido. no se entreg.

10 puntos 0 puntos
Estructura: Contiene
los elementos, hoja de Contiene todos los Contiene al menos 5 Contiene al menos Contiene al menos 3 Contiene menos de
presentacin, elementos elementos 4 elementos. elementos 3 elementos,
resultados, discusin,
cuestionario,
conclusiones,
bibliografa.
20 puntos 15 puntos 10 puntos 5 puntos 0 puntos
Limpieza y orden: Esta Tiene limpieza y No tiene limpieza y
presentado sin orden orden
borrones,
enmendaduras,
manchas y en hojas de
igual tamao y conforme
la secuencia establecida
15 puntos 0 puntos

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Cuestionario:
Tiene los dos Tiene ms del 50% de los dos Tiene menos del 50% de los dos No tiene los dos
Responde las
requisitos requisitos, pero no est requisitos requisitos
cuestiones de una
completo o tiene errores
manera amplia y
correcta
15 puntos 10 puntos 5 puntos 0 puntos
Resultados y
discusin de los Argumenta Argumenta Argumenta Argumenta dbilmente No contiene
resultados: presenta la plenamente, y claramente, y dbilmente , y , y compara resultados o
informacin de acuerdo compara sus compara sus compara sus brevemente sus discusin de
a lo solicitado, resultados con los resultados con los resultados con los resultados
resultados con los
argumenta y compara existentes en la existentes en la existentes en la
bibliografa bibliografa existentes en la bibliografa
sus resultados con los
bibliografa
existentes en la
bibliografa
15 puntos 12 puntos 8 puntos 4 puntos 0 puntos

Conclusiones: incluye Incluye las No contiene


conclusiones en las opiniones, ideas y conclusiones.
cuales expone su punto conclusiones
de vista personal, personales

15 puntos 0 puntos
Buena caligrafa:
Los reglones estn Tiene buena No tiene buena
Tiene una caligrafa
alineados, se caligrafa caligrafa
aceptable
comprende lo escrito y
elaborado con bolgrafo

5 puntos
10 puntos 0 puntos

TOTAL 100 puntos

La rbrica abarca 100 puntos de la actividad Reporte de prctica.


Para la calificacin del curso se debe de multiplicar los puntos por 0.10

COMENTARIOS GENERALES