DETERMINACIN INDIRECTA DE RESIDUOS DE

PLAGUICIDAS OF y/o C EN AGUA

INHIBICIN INDIRECTA DE LA AChE In Vitro

Mtodo Limperos y Ranta modificado por Edson
Edson,, adaptado a agua

Omayda Crdenas Bustamante

Gr po Salud
Grupo Sal d Ambiental Jaime EdEduardo
ardo Orti
Ortiz Varn
Subdireccin Laboratorio Nacional de Referencia
Direccin Redes en Salud Pblica
Instituto Nacional de Salud
Colombia
PRINCIPIO DEL METODO

9 Es un mtodo colorimtrico visual en el cual ocurre

un cambio de pH (pH).

9 La sangre contiene una enzima, colinesterasa, la

cual por hidrlisis libera cido actico a partir de la
acetilcolina
til li produciendo
d i d cambio bi de
d pH.
H

9 La actividad de la colinesterasa de las muestras de

sangre total determinan el porcentaje de cambio de
color en un sistema que comprende la enzima (muestra
de sangre),
sangre) sustrato (perclorato de acetilcolina) y
solucin indicadora (azul de bromotimol soluble).

9 Se deja actuar por un tiempo determinado

establecido segn la tabla de tiempo/temperatura .

9 El cambio de pH en este tiempo es una medida de la

actividad de la colinesterasa.
 REACTIVOS
1. Solucin indicadora Azul de bromotimol
soluble en agua
g

Disolver 0,112 g de sal sdica de azul de bromotimol

soluble en agua en 250 mL de agua destilada
desionizada libre de CO2 (hervida). La concentracin
es crtica, siendo el lmite permisible 0.01 g.

El agua destilada desionizada debe ser hervida para

la eliminacin del CO2 y dejarla enfriar para preparar
la solucin. Esta solucin se prepara vaciando el
contenido de un vial de azul de bromotimol (0,112 g)
en un baln volumtrico aforado (suministrado por el
equipo) y aadir agua destilada hervida fra hasta la
mitad, tapar y mezclar suavemente, dejar en reposo
por 1 hora aproximadamente, transcurrido este
tiempo completar el volumen con agua destilada
desionizada hervida hasta la marca de 250 mL,,
mezclar la solucin por inversin 30 veces
aproximadamente. Alicuotar en el frasco gotero
destinado para el azul de bromotimol de uso diario.

Esta solucin es estable durante varios meses en

condiciones
di i adecuadas
d d d almacenamiento
de l i t (puede
( d
ser guardada en nevera bien tapada para prevenir la
absorcin de CO2).
 REACTIVOS

2. Solucin sustrato Perclorato de

acetilcolina

Disolver 0,25 g de perclorato de acetilcolina

en 50 mL de agua destilada desionizada libre
de CO2 (hervida), medida con la probeta
graduada. La concentracin no es crtica.

Esta
E t solucin
l i sustrato
t t debe
d b ser fresca
f por lo
l
cual debe preparase cada da al momento de
su uso.

Si se presenta alguna turbidez puede ser

ignorada.
ignorada
DETERMINACION ANALITICA
Mtodo de Limperos y Ranta
Ranta,, modificado por Edson

Foto: Jos Fernando Villegas, Rubn Daro Naranjo - Aranzazu, Caldas

PRE-TRATAMIENTO DE LA MUESTRA DE AGUA
Muestras de agua
g directas

MUESTRA A ANALIZAR CONTROL NEGATIVO

Mezclar 50 L (sangre total Mezclar 50 L (sangre total

heparinizada de un individuo normal heparinizada de un individuo normal
100% Actividad AChE (no expuesto a 100% Actividad AChE (no expuesto a
plaguicidas organofosforados ni plaguicidas organofosforados ni
carbamatos) carbamatos)
+ +
50 L de agua (muestra de agua Mezclar 50 L (agua destilada
problema sin concentrar) desionizada hervida)

Mezclar bien y dejar a temperatura Mezclar bien y dejar a temperatura

ambiente mnimo 30 min. ambiente mnimo 30 min.
 1. PRUEBA DE REACTIVOS

Comprobar reactivos

Mezclar 0,5 mL de solucin indicadora

(Azul de bromotimol)

0,01 mL (10 L) de sangre total

heparinizada (puncin venosa) o por
puncin en el dedo de un individuo
normal control
control (no expuesta a
plaguicidas organofosforados ni
carbamatos 100%)

0,5 mL de solucin sustrato

(Perclorato de acetilcolina)

Mezclar suavemente
evitar burbujas
Transferir inmediatamente la mezcla a una celda de 2
2.5
5 mm la cual se pone en el compartimiento
derecho del disco comparador
(el compartimiento izquierdo debe estar vaco).
 1. PRUEBA DE REACTIVOS

1. Sostener el comparador contra una fuente de luz blanca uniforme

2. Girar el disco hasta que coincida el color del disco con el color obtenido en la
solucin.
3
3. El resultado no puede ser superior al color de 12,5%
12 5% de actividad.
actividad
4. Si la lectura da mayor de 12,5%, puede ser debido a que la solucin
indicadora es muy cida, debido a la absorcin de CO2, esta puede ser
restaurada a la normalidad hirvindola momentneamente.
5. Si este procedimiento no reduce la acidez de la solucin a color de 12,5% de
actividad, entonces la solucin sustrato est fallando y esta debera ser
descartada y preparar una solucin fresca.
6. La lectura debe dar entre 0% 12.5% (p
(para p
poder realizar la p
prueba).
)
7. Determinar el tiempo de reaccin de la prueba en minutos
8. Correlacionar la temperatura a la sombra (hasta 45C) con la lectura obtenida
en la prueba de reactivos (0% o 12,5%) - ver tabla de tiempo/temperatura
 2 BLANCO DE SANGRE
2.
Blanco para las lecturas de las Mx.

Mezclar 1,0 mL de agua destilada

desionizada (hervida fra)

0,01 mL (10 L) de sangre total

heparinizada (puncin venosa) o por
puncin en el dedo de un individuo
normal control (no expuesto a
plaguicidas OF ni C 100%)

M
Mezclar
l bien
bi

Transferir la mezcla a una celda de 2,5

mm y ponerla en el compartimiento
izquierdo
q del comparador
p

Este blanco debe permanecer hasta finalizar

las lecturas de acetilcolinesterasa
 3. TUBO DE REACCION Muestra de agua
pretratada (Agua
(Agua--Sangre)
Anlisis de Mx. de agua directa

M
Mezclar
l 0,5
0 mL L de
d solucin
l i iindicadora
di d
(Azul de bromotimol)
15 a 20 pruebas

+
0,02 mL (20 L) de la mezcla agua-sangre
(muestra agua problema sin concentrar +
sangre normal)

+
0,5 mL de solucin sustrato
(Perclorato de acetilcolina)

Activar el cronmetro Tiempo cero

A it suavemente
Agitar t - evitar
it burbujas
b b j

Adicionar la solucin sustrato a los otros tubos de

reaccin a intervalos de 1 minuto,
a partir del tiempo cero

Esperar el tiempo de reaccin establecido en la

tabla de tiempo-temperatura
 4. LECTURA Y REGISTRO % ACTIVIDAD AChE

1. Una vez cumplido el tiempo de reaccin

establecido en la tabla de
tiempo/temperatura, agitar suavemente el
tubo de reaccin de cada muestra de agua
problema
bl y transferir
t f i ell contenido
t id a una
celda de 2,5 mm, colocndola en el
compartimiento derecho del comparador.

2. Leer el resultado haciendo coincidir el

color de la solucin de la muestra con el
del disco y registrar el porcentaje (%) de
actividad.

3. El procedimiento de lectura se realiza

3
con cada tubo de reaccin a intervalos de
1 minuto, teniendo en cuenta la adicin de
la solucin sustrato.
 4. Interpretacin de resultados

L a actividad de la acetilcolinesterasa en sangre es expresada como un porcentaje de la

actividad en sangre normal.

Para
P l determinacin
la d t i i de
d residuos
id d plaguicidas
de l i id OF y/o/ C en agua, se determin
d t i de
d forma
f
indirecta la actividad de acetilcolinesterasa en sangre (AChE), por el mtodo Limperos y Ranta
modificado por Edson, para lo cual se emple sangre de un individuo sano (No expuesto a
plaguicidas OF ni C) con 100% de actividad de AChE. Los patrones de plaguicidas OF y C en
cantidades de 0,0001
, mgg en un ((1)) litro de agua,
g , ppresentaron actividad de AChE hasta un
75%; por lo tanto, se infiere que las muestras analizadas tanto directamente como por
extraccin en fase slida cuyos resultados fueron de 100,0% de actividad de AChE, NO
contienen plaguicidas OF ni C en concentraciones mayores a 0,0001 mg/L.

Mximo permisible en mg/L: La Resolucin No.No 2115 de 20072 del MPS/MAVDT,

MPS/MAVDT establece
que el contenido total de plaguicidas en agua para consumo humano, no debe ser superior a
0,001 mg/L siempre y cuando no se superen los valores individuales.
 GRACIAS
Omayda Crdenas Bustamante, Bact., ESA, MSc.
Grupo Salud Ambiental Jaime Eduardo Ortiz Varn
Subdireccin Laboratorio Nacional de Referencia
Direccin Redes en Salud Pblica

Instituto Nacional de Salud

ocardenas@ins.gov.co
picc_veo@ins.gov.co
Telfono (57-1) 220 77 00 Extensin:1236-1296
Bogot, COLOMBIA
www.ins.gov.co
Lnea gratuita nacional: 01 8000 113 400