1. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN.

A menudo, la inmovilizacin altera significativamente el componente de las

enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo
lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los
componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos,
inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interface: en el
medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como
consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo
difusional, estrico y del microentorno.
Efectos en la estabilidad.
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas
despus de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes
razones:
1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de
uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la
enzima adquiere una mayor rigidez y se hace ms resistente a la
desactivacin trmica o qumica. Este tipo de estabilizacin se obtiene
nicamente en aquellos mtodos en los que intervienen en laces de tipo
covalente, como el reticulado o la unin de soportes activados (Figura
4). La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar con la
adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura
de la enzima.
2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la
unin de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y
evita su autolisis.
3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de
enzimas retenidas en una determinada regin del espacio.
4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la interaccin
de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al
oxigeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la
superficie de un soporte cargado, la fuerza inica efectiva en el
microentorno de la enzima ser muy alta y, como consecuencia, la
concentracin de oxigeno disuelto ser mucho menor en esa zona que
en el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto
tamponador de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en
su microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios
importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas
por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgnicos, la
acuofilia del soporte o su capacidad para retener agua, regula la
actividad de la enzima. Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, mas
agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su
microentorno para mantener su conformacin activa.
Efectos en la actividad enzimtica.
Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso
perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica
puede ser debido a que:
1) La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al
centroactivo esta impedido.
2) Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que
forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad
cataltica de la enzima.
3) La inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar
a una forma inactiva.
4) Las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin
o desactivacin de la enzima.
Si la perdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios
(disminucin o aumento en la actividad enzimtica) se debern principalmente
a efectos difusionales, electrostticos, esfricos y/o del microentorno.
1) Efectos difusionales: como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin
de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar
impedida por resistencias de tipo externo e interno.
a) Resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el
medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula liquida
estacionaria (capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En
las proximidades de un soporte no cargado, la concentracin de
sustrato es menor que en el resto de la disolucin, puesto que existe
un gradiente de concentracin a travs de la zona de difusin. Por
tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre
aparentes (km,).
b) Resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen
que atravesar al interior del gel, microcapsula, fibra o poro del
soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.
Existe diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como
por ejemplo: disminuir el tamao del biocatalizador, aumentar la
concentracin de sustrato, incrementar la agitacin o el flujo en el
reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa
de Nernst, y como consecuencia, el valor de km, disminuye.
2) Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que,
si tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las
cargas son opuestas hay atraccin. Cuando el sustrato y el soporte
tienen cargas opuestas, el valor de km, aparente puede verse reducido
hasta varias veces por debajo del obtenido en disolucin. Hornby y Cols
desarrollaron una expresin matemtica que permite calcular la actividad
de las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto los factores de
 difusin como los electrostticos. La expresin de Michaelis-Menten en
este caso es:

v max[S ] xv max RT
v= donde k m =( k m + )
k m +[S ] D RT xzFV

Termino de difusin trmino electrosttico

Donde:
x= espesor de la capa de Nernst.
D= coeficiente de difusin.
T= temperatura (oK).
z= valencia del sustrato.
F= constante de Faraday.
R=constante universal de los gases.
V= gradiente de potencial en el soporte.

Se puede disminuir el valor de k m,, variando tanto el termino de difusin

como el termino electrosttico. En el primer caso, la disminucin del
valor de km,, se consigue al disminuir el tamao del soporte (con lo que
disminuye el trmino x) o al aumentar el flujo o la agitacin. En el
termino electrosttico, si z y V tienen el mismo signo, es decir si el
soporte y el sustrato tienen la misma carga, el termino electrosttico es
menor de 1 y km, aumenta. Si tienen cargas opuestas, la k m, disminuye. Si
no poseen carga, km, solo depender del trmino de difusin.
3) Impedimentos esfricos o de tamao de sustrato. En un principio,
cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya prdida
apreciable de su actividad. Este hecho suele ser vlido en el caso de
que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos
con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada
disminuye drsticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas
covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son muy activas
frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia
protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Este efecto esfrico se
puede evitar mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo
espaciador enzima-soporte ms largo.
4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un
entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene
grupos carados elctricamente. El efecto observado suele ser un
desplazamiento en el valor del pH ptimo de la catlisis enzimtica y,
muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la
enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a un soporte
carado negativamente (v.g. CM-sephadex) tendr en su microentorno
una concentracin mayor de hidrogeniones que en el medio de reaccin.
Como resultado, la enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms
 alcalino. La enzima sera ms activa a pH ms cido si estuviera unida
a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-sephadex).
1. ELECCIN DEL MTODO DE INMOVILIZACIN
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas tcnicas de inmovilizacin a
numerosos enzimas, se reconoce que no existe un mtodo universal vlido
para todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la
informacin disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones
sobre cada mtodo de inmovilizacin y as, podremos seleccionar el ms
adecuado para cada aplicacin especfica. La eleccin ha de tener en cuenta
las condiciones de la reaccin biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a
utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.

En general, los mtodos de preparacin difcil y de mayor coste proporcionan

biocatalizadores ms estables y duraderos; en cambio aquellos mtodos ms
sencillos como el atrapamiento o la adsorcin, donde la unin de la enzima con
el soporte es dbil, originan derivados inmovilizados que presentan prdidas de
actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el mtodo
ms conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados
segn las indicaciones establecidas por el Working Party on Immobilized
Biocatalysts:
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS: MTODOS Y APLICACIONES
 2. APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS
Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden
clasificar en:
Aplicaciones analticas: biosensores
Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica,
alimentaria y de tratamiento de residuos.
2.1. Biosensores
Los biosensores son de gran utilidad en el campo del diagnstico clnico. Los
niveles sricos de glucosa, lactato y cido rico se pueden detectar mediante
electrodos enzimticos disponibles comercialmente. Actualmente, el desarrollo
de nuevos biosensores va dirigido a la deteccin de frmacos, clulas y virus
patgenos.
En el caso del control de calidad en las industrias alimentarias, los
biosensores pueden determinar el grado de contaminacin microbiana, o por
ejemplo, cuantificar el azcar presente en bebidas.
Finalmente, los biosensores pueden ser muy tiles en el control de la polucin
del medioambiente. Los analizadores de contaminantes en el agua se basan en
el empleo de biosensores capaces de detectar la presencia de residuos
txicos, pesticidas, herbicidas o microorganismos.
2.2. Aplicaciones mdicas
Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o carencia de una
determinada enzima.
Tambin hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras
acciones teraputicas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas
permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms resistente a la accin
de las proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de
Leucemias y cnceres diseminados que requieren asparragina para
desarrollarse. En la actualidad se ha diseado un hemodializador de fibra
hueca que contiene asparaginasa inmovilizada.
La tripsina ola colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de
heridas, quemaduras, lceras, etc.; para acelerar el crecimiento de nuevos
tejidos e injertos de piel, y tambin para inhibir el crecimiento de algunos
microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar
en celulosas o fibras que formarn parte del tejido de apsitos y vendas.
2.3. Aplicaciones en la Industria Farmacutica
La Industria Farmacutica trabaja con molculas lbiles, y en muchos casos
con molculas quirales. El empleo de enzimas inmovilizadas es una alternativa
seria a la sntesis qumica en pasos clave, donde no conviene trabajar a
temperaturas altas o se requiere una elevada especificidad de sustrato. Los
enzimas son unos reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores con
una estructura tridimensional asimtrica definida que permiten la obtencin de
productos de gran pureza ptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando
las reglamentaciones exigen la sntesis de compuestos pticamente puros, ya
sean frmacos, hormonas o antibiticos.
1) Obtencin de antibiticos -lactmicos
Los antibiticos -lactmicos semisintticos, se sintetizan a partir del cido 6-
amino penicilnico (6-APA) y del cido 7-amino cefalospornico (7-ACA) o el
cido 7-amino desacetoxi-cefalospornico (7-ADCA). El 6-APA, precursor de
las penicilinas semisintticas (amoxicilina, ampicilina, etc.), se obtiene
industrialmente mediante la hidrlisis de la penicilina G catalizada por las
penicilina G acilasas inmovilizadas de E. coli o Bacillus megaterium.
Se calcula que la produccin anual mundial de 6-APA mediante este mtodo
fue de 7500 toneladas en 1992. La produccin industrial de 7-ACA o 7-ADCA a
partir de la cefalosporina C es ms compleja, aunque ya se han desarrollado
procesos enzimticos para su produccin.
2) Obtencin de frmacos pticamente puros
La actividad biolgica, la toxicidad, la distribucin y el metabolismo de un
frmaco dependen en gran medida de su estereoqumica. Hay muchos
ejemplos que ilustran el diferente comportamiento farmacolgico de los
enantimeros de una mezcla racmica. En algunos casos, un enantimero
presenta actividad mientras que el otro no tiene efecto farmacolgico; uno es
txico frente al otro que demuestra ser seguro y activo; e incluso hay casos en
los que uno es agonista frente al otro que se comporta como antagonista. A
pesar de todo, la mayora de estos frmacos se han vendido como mezclas
racmicas hasta hace poco al no existir una normativa clara al respecto, ni
mtodos econmicos para realizar la separacin de enantimeros. La Industria
Farmacutica ha empezado a superar este ltimo problema introduciendo
mtodos enzimticos en la obtencin de frmacos pticamente puros. Un
ejemplo es el empleo de lipasas microbianas inmovilizadas en la obtencin de
antiinflamatorios no esterodicos. El ismero S de estos cidos (ibuprofeno,
naproxeno o ketoprofeno) es el que posee actividad teraputica, y tambin se
ha obtenido con una gran pureza ptica empleando cristales reticulados de
lipasa de Candida rugosa (CLEC-CR).
2.4. Aplicaciones en la Industria Alimentaria
Los aminocidos son ampliamente empleados en la industria de los alimentos,
nutricin, medicina y cosmticos as como materiales iniciadores de sntesis
qumicas. Las aplicaciones alimenticias y de nutricin solo emplean los L-
ismeros activos de aminocidos. Uno de los aminocidos que se producen
desde 1973 con enzimas inmovilizadas es el L-asprtico, por medio de un
sistema continuo que consta de una columna con enzima inmovilizada.
En el sistema, la aspartasa extrada de clulas de Escherichia coli se
inmovilizaron por la tcnica de atrapamiento en gel de acrilamida y la columna
se emple para la produccin continua industrial. Aos ms tarde, esta matriz
fue sustituida por carragenina y la produccin del aminocido aument hasta
tener un rendimiento de 100ton/mes utilizando un reactor de 1 kilolitro.
Otros ejemplos de enzimas inmovilizadas son la enzima penicilina acilasa,
ahora es utilizada es ampliamente en la produccin del cido-6-
aminopenicilanico de la pencilina G y la glucosa isomerasa, se utiliza en la
produccin de jarabe de alta fructosa a partir de la glucosa.
Como ejemplo para el tratamiento de residuos, tenemos a Thiobacillus
denitrificans, el cual es utilizado en el tratamiento de aguas residuales que
contienen nitrato, utilizando el mtodo de tres veces congelado/descongelado
para inmovilizarlo con PVA.
Otras enzimas empleadas en de la industria alimentaria, son las carbohidrasas
que tienen una gran aplicacin. Con estas enzimas es posible obtener
diferentes tipos de jarabes de azcar, prebiticos e isomaltulosa.
Las carbohidrasas ms importantes son de origen microbiano e incluyen
amilasas, invertasas, inulinasas, galactosidasas, glucosidasas,
fructosiltransferasas, pectinasas y glucosiltransferasas. Para que estas
enzimas sean rentables para la industria, requieren una tcnica de
inmovilizacin eficiente, simple y de bajo costo. En la siguiente tabla se
muestran dichas enzimas y su mtodo de inmovilizacin, as como su
aplicacin en la industria.
Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la preparacin y la
conservacin de los alimentos. Normalmente, las enzimas solubles aadidas
son inactivadas por calentamiento una vez que el tratamiento ha concluido. En
ocasiones se permite que contine su actividad para que los alimentos
desarrollen el aroma y la textura deseados, pero nunca se reutilizan. La
inmovilizacin permite que las enzimas puedan ser reutilizadas repetidamente
en operaciones continuas o discontinuas. De todas maneras, existen
limitaciones a su empleo relacionadas con los requisitos econmicos y
sanitarios inherentes al procesado de alimentos. A continuacin se resumen
algunas de las aplicaciones conocidas de las enzimas inmovilizadas en la
industria alimentaria:
1) En la hidrlisis de protenas:
Las enzimas proteolticas se emplean en la modificacin del contenido proteico
de los alimentos.
De esta forma se han conseguido hidrolizados de protenas de trigo mediante
el uso de pepsina y proteasa coinmovilizadas en chitosan. Otras proteasas
inmovilizadas han sido empleadas en la disminucin del contenido de
lactoglobulina en la leche, en la industria quesera y en la solubilizacin de
concentrados protenicos de pescado.
2) En la hidrlisis de hidratos de carbono:
La presencia de lactosa en la leche (4,3-4,5%) y en algunos derivados lcteos
es perjudicial para aquellas personas que carecen de lactasa intestinal, y su
ingesta provoca diarreas y diversos trastornos intestinales. La eliminacin de
este azcar se puede conseguir tratando la leche con -galactosidasa de
levaduras inmovilizada en fibras de acetato de celulosa y es de gran
importancia en la preparacin de productos lcteos dietticos. Su eliminacin
tambin es interesante en la preparacin de helados, ya que la lactosa tiende a
cristalizar a temperaturas bajas.
El proceso de degradacin del almidn, procedente de diversas fuentes
vegetales como el maz, se realiza mediante la utilizacin de amilasa,
glucoamilasa y glucoisomerasa inmovilizadas. De esta manera, se consigue un
jarabe enriquecido en fructosa, que sirve de edulcorante en bebidas
refrescantes como la Coca-Cola o Pepsi.
La pectinasa se emplea para hidrolizar la pectina, componente estructural de
frutas y verduras.
Esto permite la obtencin de un zumo menos viscoso y ms concentrado. La
pectinasa se emplea inmovilizada sobre diferentes soportes (PVC, politeres,
poliacrilamidas, almina, etc.).
3) En la mejora de las caractersticas organolpticas de ciertos alimentos.
As el empleo de clulas de Arthobacter globilis atrapadas en poliacrilamida
permite eliminar el sabor amargo del zumo de los ctricos. Por otra parte, las
clulas de Leuconostoc oenos inmovilizadas en alginato se han utilizado en la
desacidificacin del vino. Endo--glucosidasas inmovilizadas en esferas
acrlicas permiten incrementar el aroma de vinos y zumos. Finalmente ciertas
lipasas y protesas encapsuladas se estn aplicando en la maduracin de
quesos.
4) En la obtencin de edulcorantes y aditivos alimentarios
En la obtencin industrial del cido L-mlico interviene la fumarasa de
Brevibacterium flavum atrapada en k-carragenato. Este es un aditivo importante
para zumos de frutas, refrescos, mermeladas y dulces. Tambin, las enzimas
inmovilizadas permiten la obtencin industrial de edulcorantes alimentarios
como el aspartamo, fructooligosacridos, diversos dipptidos, etc.
5) Otras aplicaciones:
Las lipasas inmovilizadas de diversos microorganismos se han empleado en la
nteresterificacin de aceites y grasas. Este mtodo permite transformar el
aceite de palma en un sucedaneo de la manteca de coco, componente principal
del chocolate. El chocolate contiene aproximadamente un 30% de manteca de
coco, por lo que este proceso es potencialmente muy interesante en la
industria. Mediante el empleo de la lipasa inmovilizada adecuada, se puede
sustituir el cido palmtico de las posiciones 1 y 3 del aceite de palma por cido
esterico.

2.5. Aplicaciones en la Industria Qumica:

Un ejemplo lo protagoniza la obtencin industrial de acrilamida, compuesto
ampliamente utilizado en la preparacin de diferentes polmeros, aditivos y en
el tratamiento del petrleo. Para ello se emplean clulas de R. rhodochrous
inmovilizadas en un gel de poliacrilamida. Este microorganismo es rico en nitrilo
hidratasa, una enzima que es capaz de convertir el acrilonitrilo en acrilamida.
La obtencin de productos de alto valor aadido es tambin un campo
importante para la sntesis catalizada por enzimas inmovilizadas. Como
ejemplos podramos citar la sntesis de pptidos, fragancias e insecticidas.

2.6. Tratamientos de aguas residuales

Recientemente, se ha desarrollado un mtodo para la reduccin de nitratos a
nitritos en aguas residuales que emplea enzimas inmovilizadas. El benceno es
otro compuesto muy txico que puede ser degradado mediante clulas de
Pseudomonas putida atrapadas en geles de poliacrilamida.