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Disear y preparar un medio de cultivo para llevar a cabo un cultivo lote alimentado de una
levadura en reactor de 2L (primera parte), adems del monitoreo de la cintica del cultivo a
travs de la generacin de biomasa y el consumo de sustrato a travs de la experiencia
(Segunda parte).
El cultivo por lote alimentado (CLA) o fed batch es una modalidad de fermentacin, cuyas
caractersticas propias hace atractiva su aplicacin a una variada gama de procesos de
fermentacin. Es una operacin discontinua, durante la cual los nutrientes o parte de ellos
ingresan al fermentador por una corriente de alimentacin, y que al no existir una descarga,
provoca una continua variacin del volumen de fermentacin. Las condiciones iniciales de un
cultivo por lote alimentado se logran a travs de una etapa previa obligatoria de cultivo por
lote (CL). Una vez alcanzadas estas condiciones se inicia la alimentacin, lo que marca el
comienzo del CLA.
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BIT-170 Laboratorio Bioprocesos 2016
Demanda
Oferta
En esta experiencia trabajaremos CLA con velocidad de alimentacin constante, con lo cual F y
SF son conocidos y constantes. Se requiere dividir el CLA en dos zonas de acuerdo al tipo de
crecimiento que experimenta la masa celular (XV). Una zona de crecimiento exponencial de
la masa celular, donde la oferta es superior a la demanda de nutriente limitante y como
consecuencia se tendr una acumulacin de este nutriente en el medio de cultivo, con lo cual
la masa celular crecer a su mxima velocidad especfica (max). A medida que transcurre la
fermentacin la demanda por el nutriente limitante aumentar debido al aumento de masa
celular, y a que la velocidad de alimentacin es constante generndose una zona de
crecimiento limitado de la masa celular, instante en que la demanda o velocidad de consumo
ser igual a la oferta y de all en adelante una vez consumido el sustrato acumulado, la masa
celular tendr que disminuir su velocidad especifica de crecimiento ( M) para adecuar su
velocidad de consumo a la de entrada del nutriente. El tiempo exacto en que se dividen ambas
zonas es denominado Tiempo de transicin (tT).
Tiempo de Transicin
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1. Condiciones operacionales: volumen total: 1L, 30C, 200 r.p.m., pH 4,6 (utilizar tampn
citrato 0,1 M)
1. Condiciones operacionales: 30C, 200 r.p.m., pH 4,6 (utilizar tampn citrato 0,1 M),
aireacin 1 vvm
- Volumen Inicial: 1L
- Volumen Final: 2L
- Flujo de alimentacin: 7 ml/min
- Se considera el consumo completo del sustrato limitante (S) en el cultivo por lote
alimentado.
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Principio: La cuantificacin por peso seco se realiza determinando en una balanza analtica la
masa de una muestra de levadura previo secado completo de esta a 105C. Al tratarse de una
suspensin homognea de clulas, es posible cuantificar la capacidad de absorcin de luz la
muestra utilizando un haz de luz de 650 nm.
Procedimiento:
Curva de calibrado:
Luego del ltimo lavado, el pellet obtenido en el fondo del tubo de centrfuga es resuspendido
en un pequeo volumen de agua destilada. En este punto se usa un vrtex para homogeneizar
y asegurar una resuspencin total de la biomasa.
Las muestras obtenidas son secadas en estufa a 105C durante 24 hrs, luego se enfran en la
desecadora y se llevan nuevamente a la estufa por 2 hrs. ms para asegurarnos obtener un
peso constante. La masa celular se obtiene por diferencia de masas con respecto al capacho
portador.
La concentracin celular se calcula dividiendo la masa celular en gramos por el volumen inicial
centrifugado, en litros.
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Con los datos obtenidos por espectrofotometra se correlaciona con la concentracin celular
correspondiente, con lo cual se obtiene la curva de calibrado.
Mtodo: Turbidimtrico.
Principio: Mediante el mtodo de DNS se detecta la presencia del grupo carbonilo libre (C=O)
propio de los azcares reductores. Este involucra la oxidacin del grupo aldehdo de la
glucosa. Simultneamente, el cido 3,5-dinitrosaliclico es reducido al cido 3-amino, 5
nitrosaliclico, bajo condiciones alcalinas, la cual es detectada espectrofotomtricamente.
Procedimiento:
Medicin:
1. Toma una muestra de cultivo de 2 ml, se separan las clulas mediante centrifugacin a
10000 r.p.m. durante 15 minutos; luego se toma 1 ml del sobrenadante y se diluye en
agua destilada.
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2. Agregar a un tubo de ensayo con tapa rosca 1 mL de muestra del punto anterior y 1 mL de
reactivo DNS.
3. Dejar en un bao de agua a ebullicin durante 15 minutos.
4. Enfriar en un bao de hielo por 5 minutos.
5. Adicionar 10 mL de agua destilada.
6. Dejar reposar 15 minutos a temperatura ambiente
7. Leer en espectrofotmetro a 540 nm contra un blanco
8. Blanco reemplazar muestra por agua destilada (1mL)
Curva de calibrado:
pHmetro
Estufa
Shaker o agitador orbital
Espectrofotmetro
Centrifuga para tubos de 50 mL
Centifuga para tubos eppendorf
Desecadora
Balanza granataria
Balanza analtica
Vrtex
Tubos eppendorf 2 mL
Gradilla para tubos eppendorf
Mangueras esterilizables n 13
Celdas plsticas para espectrofotmetro de 2 mL
10 Capachos de centrifuga de 50 ml (tubos falcon)
1 placa agitadora con calefaccin
2 barra magntica.
2 esptulas
1 Probeta de 100, 500 mL y 1L
2 Vasos precipitados de 100, 250 mL, 500 mL y 1 L.
1 Matraz de aforo de 500 mL
1 Matraz de aforo de 250 mL
1 Matraz de aforo de 100 mL.
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