Universidad Veracruzana

Facultad de Ciencias Qumicas

Ingeniera Ambiental

Proyecto de Microbiologa Ambiental

Degradacin de aceites utilizados por vehculos automotrices por medio de bacterias del
gnero Bacilos.

Experiencia Educativa

Microbiologa Ambiental

Catedrtico

Dra. Celia Cecilia Acosta Hernndez

Equipo 7

Juan Rogelio lvarez

Daniela Berenice Cruz Hernndez
Mauricio Garrido Nakazona
Jorge Luis Silva Gmez
 PRCTICA No. 1
PREPARACIN DEL MATERIAL DE LABORATORIO, MEDIO DE
CULTIVO NUTRITIVO Y DEL CALDO MINERAL.

En la naturaleza los microorganismos se presentan como poblaciones mixtas que conviven en

un hbitat determinado. A partir de la toma de muestras de estas poblaciones es factible
obtener cultivos mixtos. Si se quiere estudiar solo una especie, es necesario realizar
aislamientos, que aseguren el obtener una cepa pura, es decir, un cultivo que contiene una sola
especie.

Para poder lograr esto, es necesario cumplir con ciertos requerimientos como son los
nutrientes necesarios, tales como, fuente de carbono, nitrgeno, minerales y factores de
crecimiento, condiciones ambientales apropiadas con son pH, temperatura, presin osmtica y
oxgeno atmosfrico, adems, de condiciones aspticas estrictas. (Acosta, 2014).

Preparacin del material para introducirlo a la autoclave

Lo que hicimos inicialmente fue verter 9 ml de agua destilada en tres tubos de ensaye. Estos
estaban cerrados perfectamente, pues cada uno tena su tapn hecho con algodn y base
esterilizada.

Posteriormente se pesaron 1.035 g de agar nutritivo marca Dibico, y se diluyeron en 45 ml en

un vaso de precipitados de 250 ml. Se coloc sobre una malla y se calent con el mechero
bunsen, para que la dilucin sea ms eficiente. Luego, cuando la disolucin estaba
homognea, la vertimos en un matraz Erlenmeyer de 100 ml, y de la misma manera le
colocamos su respectivo tapn, antes de cerrarlo completamente con unos dobleces de papel
revolucin y masking tape. De la misma manera, envolvimos cuatro pipetas volumtricas en
papel revolucin y procurando que estn lo ms compactas y seguras posibles.

Una vez que tenamos todo envuelto correctamente, y con los volmenes necesarios, llevamos
el material a la autoclave para esterilizarlo y poderlo utilizar durante las prcticas posteriores
de la Experiencia Educativa de Microbiologa Ambiental.

Pasos a seguir para la utilizacin de la autoclave

1. Llenar la autoclave con agua, hasta el lmite indicado en su parte exterior con una marca
negra.
2. Sacar la cubeta perforada que est en el interior de la autoclave, y colocar dentro el
material de los equipos de la Experiencia Educativa. Debe revisarse previamente que el
material est etiquetado, para evitar confusiones acerca de lo que se desea esterilizar.
3. Revisar que no quede nada de aire dentro de las bolsas donde se coloc el material, ya
que de esta manera se evitan impurezas.
4. Cerrar la autoclave, utilizando las manijas que estn en el borde de la tapa de la
autoclave. stas deben estar cerradas de dos en dos, y siempre debe cerrarse el lado
 contrario; es decir, los inversos, buscando que se les aplique la misma fuerza para que
ejerzan la misma presin.
5. Etapa de pre-calentamiento. Una vez que la autoclave est lleno con agua hasta su lmite,
se tiene que ajustar a nivel mnimo o mediano. Se saca la cubeta y se baja la tapa. La
vlvula de escape debe quedar abierta hasta que comience a salir vapor.
6. Ya que se haya observado la presencia de vapor, debe cerrarse la vlvula de escape
completamente, y se debe verificar que la aguja llegue a una presin total de quince
libras. Esto se logra mediante la regulacin de la temperatura de la autoclave.
7. Se deja la autoclave a las condiciones antes mencionadas, durante un tiempo de 45
minutos.
8. Se abre la tapa cuidadosamente. Para este paso, uno debe colocarse detrs de donde se
abre la orientacin de la autoclave, debido a que la temperatura del vapor es elevada, y
puede ser peligroso abrirla directamente.
9. Se deja reposar unos minutos y se saca la cubeta perforada, con el propsito de que se
regule la temperatura del material de laboratorio esterilizado con el ambiente.
10. Los equipos toman de manera ordenada su material ya esterilizado y listo para comenzar
a trabajar.

Preparacin del medio de cultivo en las cajas Petri

Para verter el medio de cultivo en las cajas Petri, es crucial que se haga correctamente, ya que
lo que se busca es que haya la menor cantidad de microorganismos presentes.

Para comenzar a trabajar en la sesin del 17 de abril, lo primero que hicimos fue sacar las
cajas Petri de refrigeracin, ya que las habamos dejado ah la sesin anterior, con el propsito
de que las temperaturas ms bajas ayuden a que las bacterias sigan con vida.

Fueron tres cajas Petri, que contenan el agar nutritivo preparado, junto con la muestra
utilizada para la realizacin de las prcticas (muestra slida de aceites usados de motor de
vehculos automotrices, provenientes de un taller mecnico ubicado en la Av. Circuito
Presidentes, en la Ciudad de Xalapa).

Cabe mencionar que para el medio nutritivo, un paso consista en diluir la muestra (una asada)
en tubos de ensaye con agua estril. Sin embargo, debido a que las propiedades fsicas de la
muestra que utilizamos impedan que podamos hacer diluciones con el agua (por la viscosidad
y alta consistencia del aceite), nos vimos en la necesidad de dar la asada de nuestra muestra de
aceite directamente en las cajas Petri con el agar nutritivo, procurando que al realizar el
cultivo no se contamine el interior de la caja con otras bacterias o microorganismos presentes
en el ambiente. Para lograr dicho objetivo, procuramos siempre exponer los materiales
utilizados a altas temperaturas, teniendo cerca los mecheros bunsen prendidos, y acercando al
fuego todo el material utilizado durante este parte del procedimiento (matraz Erlenmeyer,
cajas Petri, asa bacteriolgica, etc.)

Lo que se hizo a la siguiente sesin fue sacar las cajas de refrigeracin, y analizar si hubo
cambios. Observamos que efectivamente la refrigeracin mantuvo las colonias de bacterias
sin cambios significativos. Las bajas temperaturas favorecieron a que la colonia desarrollada
 en cada caja Petri permanezca en las mismas condiciones aparentemente.

Para poder continuar con la experimentacin en el laboratorio, despus de analizar las cajas
las metimos inmediatamente a la incubadora, a una temperatura de 30 C.

Posteriormente procedimos a preparar el medio mineral.

Para la preparacin, el primer paso fue verter en un matraz Erlenmeyer de 500 ml el medio
mineral M-9, que habamos preparado la sesin anterior.

Este contena fosfato monopotsico, sulfato de hierro, cloruro de sodio, cloruro de calcio y
sulfato de magnesio. Despus, le aadimos un gramo de agar bacteriolgico y mezclamos
utilizando un agitador.

Para lograr que la dilucin sea ms eficiente, colocamos el matraz en una rejilla sobre un
tripie, y debajo estaba prendido el mechero bunsen. Una vez que se encontraba bien
mezclado, procedemos a colocarle el tapn y el pedazo de papel revolucin bien doblado en la
boca del matraz. Lo pegamos con masking tape y lo introducimos a la autoclave para
esterilizar.

Cuando el matraz con el caldo mineral sali del autoclave, utilizamos 3 cajas Petri para
realizar el cultivo de bacterias, de la misma manera que lo realizamos con el medio nutritivo.
Sin embargo, debido a que no solidifica, optamos por conservar el medio mineral nicamente
en el matraz.

Tcnicas de siembra

Mtodo de siembra por estra en placa

Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa
de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre
la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les
denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada
vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se
flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la
siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este
proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se
incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero
suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente
representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas
quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para
asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a
partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la
segunda vez, sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos.
 Mtodos de vertido en placa y extensin en placa

En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en

placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la
dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones
de clulas por mililitro debe ser diluida 10 veces para obtener una suspensin con un centenar
de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas),
normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (de

medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las
clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder
de dos maneras diferentes.

Fig.1.1 Tipos de siembra

En el mtodo de vertido en placa (Fig. 1.1), las muestras diluidas se mezclan con agar fundido
y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la
superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes.

En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente

en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal
estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la
superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como
en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en
las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del
vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de
siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de
colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de
seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para
obtener un cultivo axnico mediante este mtodo:

a) Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener una muestra con slo
 unos pocos cientos de bacterias.

b) Verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el contenido en una
placa Petri.

c) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms pequeas) y en su

superficie (ms grandes).

Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa: Para obtener un cultivo axnico:

a) Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

b) Introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra.

c) Sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri.

d) Volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo

grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una
cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas
aisladas.

e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el

cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por
estras una segunda placa.

Resultados

La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el

rendimiento de un producto en especial adems de los requerimientos nutricionales del
microorganismo. Se prepar el medio en un matraz de acuerdo a las instrucciones del envase
y se dej enfriar hasta que el alumno lo pudo soportar con las manos y de vaci en las cajas de
Petri; despus se dej hasta que enfre y gelifique. Se tapan las cajas de Petri y se envuelven
en papel almacenadas hasta que se vayan a utilizar en un refrigerador.

Es as como se tuvo que volver a esterilizar el material contaminado, despus de transcurrir el

tiempo pasamos hacer diluciones para preparar de nuevo el cultivo, nuestro medio mineral
est conformado por 0.2 gr de sulfato de magnesio. Para crear nuestro medio de cultivo
esperamos que solidifiquen las cajas petri. Al ltimo preparamos las diluciones teniendo 1:10,
1:100. 1:1000 para hacer nuestro siguiente proceso. Sin embargo, como nuestra muestra era
aceite usado, es difcil trabajar con diluciones, as que hicimos siembra directa en el medio
nutritivo. Otro importante suceso durante nuestra prctica es que no solidifico el agar, as que
se procedi a dejarlo en el matraz Erlenmeyer, se volvi hacer siembra de las cajas Petri al
matraz y como fuente de energa se introdujo aceite de motor.

Los desechos no contaminados (no infecciosos) pueden reutilizarse o reciclarse o eliminarse

como si fuera basura en general. Del material contaminado (potencialmente infeccioso)
despus de ser tratado en autoclave, se obtuvo material esterilizado, desinfectado e inhibido la
 capacidad reproductora de bacterias, levaduras y mohos, por lo que ya se pudo lavar todo el
material utilizado en las prcticas anteriores. Tambin se limpi la autoclave y la pulimos.

Fig. 1.2 Cajas Petri con medio nutritivo.

Fig. 1.3 Colonias de bacterias formadas en las cajas Petri del medio nutritivo.

Conclusin

Eliminar toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por
medios fsicos, por ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos
qumicos u otra va. Excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a
los microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo.

Aprendimos a sellar correctamente para que no haya presencia de bacteria y nos dae nuestro
medio de cultivo y as evitar hacer de nuevo todo el proceso, las causas por las cuales se
contamin y tuvimos que repetir la esterilizacin fueron las siguientes:

No sellamos correctamente las muestras.

presencia de corriente de aire a la hora de hacer el llenado.
no usar cubre bocas y as causar bacterias a la hora de exhalar.
no tener completamente cerrado ventanas y puertas que acarrean bacterias.
Por lo cual es necesario tener mucha precaucin a la hora de hacer este tipo de trabajo, porque
cualquier alteracin se puede contaminar el medio mineral y el medio del cultivo.

Consideramos desecho todo aquello que debera descartarse o eliminarse para ya no ser
utilizado nuevamente. En los laboratorios, la descontaminacin y eliminacin de desechos son
operacin es estrechamente relacionadas. En el trabajo cotidiano, son pocos los materiales
contaminados que es preciso retirar del laboratorio o destruir. La mayor parte de la cristalera,
los instrumentos y la ropa del laboratorio vuelve a utilizarse o se recicla, y que el principio
bsico es que todo material infeccioso hade ser descontaminado, esterilizado en autoclave o
incinerado en el laboratorio.

Referencias
Acosta, C. (2014) Manual de prcticas Microbiologa Ambiental.Facultad de Biologa,
Universidad Veracruzana.
https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-metodos-de-aislamiento-y-
seleccion-de-microorganismos/
 PRCTICA No. 2
OBSERVACIN DE LA MORFOLOGA DE LAS COLONIAS
BACTERIANAS POR TINCIN SIMPLE

Una colonia es un grupo de bacterias formado por la reproduccin de una unidad formadora
de colonia (UFC) sobre un medio slido y generalmente visible a simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una
misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como
los estafilococos o los estreptococos.
"Las bacterias son microorganismos que se reproducen mediante fisin binaria, y que
presentan tres formas bsicas: las bacterias esfricas o cocos, las alargadas o bacilos y las
bacterias curvadas o espirilos que pueden ser tambin comas, espiroquetas y vibrias. Algunos
cocos, reciben otro nombre, por ser achatados se denominan cocobacilos. Las bacterias
pueden presentar ciertas variaciones morfolgicas, entre estas se encuentran las que tienen
forma de estrella, las planas y rectangulares, las alargadas en forma de pera y por ltimo
aquellas que forman pednculos no celulares."(Vargas flores T. y Kuno Vargas A., 2014)
Para la identificacin de las colonias bacterianas se consideran algunas caractersticas como:
Tamao de las colonias: es constante dentro de las especies y puede ir desde las
colonias diminutas hasta varios milmetros.
Forma: est determinada por su borde y espesor.
Consistencia y textura: la consistencia puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con un asa, hasta una colonia viscosa que se pega en el asa y
forma filamentos o hilos mucosos cuando se separa el agar. La textura puede parecer
granular o amorfa, la superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser
estriada con muescas concntricas.
Pigmentacin: En bacterias saprofitas las colonias aparecen rojas, amarillas,
anaranjadas, etc. El pigmento no se aprecia en clulas individuales ya que son
grnulos intercelulares muy pequeos para verse con la luz transmitida.
Turbidez: En cultivo de caldo la opacidad es ms o menos densa, signo de
crecimiento.
Pelcula: Es un crecimiento casi continuo sobre el lquido.
Sedimento: Es un sedimento de clulas en el fondo del tubo que se re suspende al
agitar.

Resultados

Se esterilizaron las herramientas de trabajo, ya se tena preparado el cultivo re sembrado por

lo que se procedi a hacer morfologa e identificacin para posteriormente hacer tincin de
Gram.

Consiste en ocupar una muestra de la cosecha,

Pasar a fuego lento el asa bacteriana para despus,
Slo observar las caractersticas de la colonia.
Dentro de nuestros medios de cultivo se pudieron apreciar distintas cepas de bacterias, todo
eso se pudo determinar de manera simple, ya que cada cepa presenta diferentes caractersticas
macroscpicas, que vienen diferencindolas unas de otras como fueron tamao, elevacin o
margen, pero dentro de nuestras colonias se pudo notar que resaltaban 2 grandes familias, los
bacilos y los cocos, debido a que su pigmentacin es la misma e incluso la forma no discrepa
mucho de las dems.

Los cocos presentan formas casi esfricas y agrupaciones homogneas, en cuanto a su tamao
se puede decir que no sobrepasa 1 cm, aunque pueden presentar distintas formas que esto es
producto de 2 factores importantes como lo son la tendencia de las clulas a mantenerse
unidas y los planos de divisin celular.

En cuanto a lo que se refiere a los bacilos estas bacterias forman agrupaciones bastante
heterogneas por su variedad de subtipos morfolgicos, que pueden ser cilndricos, en forma
de bastn, largos y delgados, pequeos y gruesos, tambin pueden presentar variaciones en
sus extremos pudiendo ser rectos, afilados o redondeados y al igual que los cocos pueden
presentar distintas formas.

Tabla 2.1
Caractersticas de colonias bacterianas
caja TC(cm) F Elevacin Cons. Margen Pigm. Turbidez
1 0.5 Granula Convexa Viscoso Entera Beige
r
2 6.5 Granula Convexa Viscoso Dentada Beige
r
3 4.5 Granula Plana Viscoso Lobulada Beige
r
3.1 2.5 Rizoide Umbilicad Viscoso Ondulada Beige
a
Caldo Gris Alta

Todo esto se pudo determinar gracias a lo que se pudo observar de nuestras cajas petri, ya que
presentaban una coloracin nica en todas las cajas, a excepcin de algunas colonias que se
encontraban aisladas de las dems, el tamao no variaba significativamente al igual que su
consistencia en todas las colonias fue la misma. Como se puede apreciar en las siguientes
imgenes:
Fig. 2.1, Caja Petri 2 Fig. 2.2 Caja Petri 3

Ahora que dentro de nuestro experimento se llev a cabo un caldo

mineral, que debido a malos clculos en su preparacin result de
tal manera, se aplic posteriormente su morfologa, que dentro de
ella se pudo observar un aumento en la turbidez del mismo caldo,
por lo que pudimos determinar que hubo crecimiento de bacterias
que aprovecharon la fuente de carbono proporcionada por el
hidrocarburo. Aunque ms adelante se observ que dentro del caldo
hubo una disminucin de la actividad bacteriana, lo que llev a una
disminucin de la misma turbidez.

Fig. 2.3, Caldo mineral

Conclusin
Durante la prctica se aprendi la identificacin de las colonias por medio de su morfologa.
Para poder reconocer las distintas bacterias que se encuentran creciendo dentro del medio
nutritivo.

"Entre las principales caractersticas de las bacterias se encuentran su tamao, forma,

estructura y tipo de agrupacin. Todas estas caractersticas van a constituir la morfologa
propia de las clulas bacterianas. Dicha observacin como se ver en las siguientes unidades
de trabajo puede llevarse a cabo mediante exmenes directos en fresco o por medio de
tinciones ms o menos especficas segn los casos." (UNN Facultad de agroindustrias 2006)

Se logr identificar a simple vista tamao, color y elevacin, entre otras caractersticas que
forman parte de la colonia. Pero para poder determinar de manera ms especfica que tipo de
bacteria es la que se tiene como objeto de estudio se requiere hacer ms que una simple
observacin macroscpica y llevar a cabo una tincin simple o tincin de Gram.

Referencias

Facultad de agroindustrias. (2006). Trabajo prctico 6. 23/05/17, de UNN Sitio web:

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp6.pdf
Vargas-Flores, T. & Kuno-Vargas, A.. (2014). Morfologa bacteriana. 23/05/17, de Revista
de Actualizacin Clnica Sitio web:
http://metabase.uaem.mx/bitstream/handle/123456789/1466/280_2.pdf?sequence=1
 PRCTICA No. 3
TINCIN DE GRAM

La tincin es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una

superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico.

Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se
encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algn tratamiento previo. De
acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:

a) Tincin Simple

El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular como se muestra en la
Fig. 3.1. En este caso, se utiliza azul de metileno.

Fig. 3.1 Identificacin de bacterias con tincin simple.

b) Tincin de Gram

Utiliza cuatro reactivos: cristal violeta, yodo de Gram, etanol al 95% y safranina. Existen
algunas modificaciones de la tincin original, sin embargo el principio fundamental es el
mismo para todas (Benson, 1979).

En primer lugar el cristal violeta, que es el colorante inicial, tie a todos los microorganismos
ya que es un colorante bsico, el yodo que es el siguiente, acta como mordiente para
incrementar la afinidad con la clula y el colorante inicial. El agente decolorante es el etanol
al 95%, el cual actuar sobre los microorganismos eliminando el colorante inicial, sin
embargo algunos organismos retienen este colorante, esto nos permite distinguir dos grupos.

El colorante usado para contraste que es la safranina teir a los microorganismos que se
decoloraron. Las clulas que conservan el color inicial (cristal violeta) se conocen como Gram
(+) (Fig. 3.2) y las que son decoloradas y retienen la safranina sern las Gram (-) (Fig. 3.3).

Fig. 3.2 Pared celular de las bacterias Gram positivas. Fig. 3.3 Pared celular de bacterias Gram negativas.

El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las

bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las
bacterias Gram tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica
externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con
etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el
colorante queda retenido y las clulas permanecern azules (Clavell, 1992). Las clulas Gram
(-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse
como se muestra en la Fig. 3.4.

Fig. 3.4 Pasos para la Tincin de Gram.

Resultados

Se realiz Tincin de Gram con el medio nutritivo, preparndose un frotis de cultivo, se le

agrego posteriormente cuatro reactivos dejando reposar el tiempo requerido para cada uno de
ellos. Finalmente se deja secar para examinar al microscopio. Obteniendo en nuestra muestra
Bacterias cocobacilos Gram (-).

Fig. 3.5 Preparacin de frotis Fig. 3.6 Proceso de tincin de Gram.

Fig. 3.7 Observacin en un microscopio ptico.

Fig. 3.8 Identificacin de bacterias.

Fig. 3.9 Bacteria Coco-bacilos

Para el caldo mineral (Fig 3.10), se realizaron dos: tincin simple y tincin de Gram, debido a
que la primera Tincin no permiti la visualizacin de nuestras bacterias, por lo tanto se
volvi hacer la tincin de Gram (Fig. 3.11), siguiendo el mismo proceso, y finalmente se
observaron bacilos Gram (-) (Fig. 3.12 y Fig. 3.13).

Fig. 3.11 Tincin de Gram

Fig. 3.10 Caldo Mineral

Fig. 3.12 Observacin e identificacin de bacterias.

Fig. 3.13 Bacterias Bacilos.

Finalmente se pudo visualizar las bacterias de nuestro proyecto, encontrando Coco-bacilos y
bacilos en nuestra muestra de estudio, este tipo de bacterias es comn encontrarlas como
degradadoras de aceites, como son las pseudomonas, que es un gnero de bacilo, Gram
negativos.

Conclusiones

Se puede concluir que se tiene que considerar algo muy importante en la tincin de Gram, es
de no sobrepasar los tiempos de tincin y decoloracin. Los cultivos viejos hacen que las
bacterias Gram positivas se tian parcial o totalmente de color rosa. Hay que tomar en cuenta
que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que: los gram (+)
pueden hacerse gram (-) al aumentar la acidez y los gram (-) pueden hacerse gram (+) al
aumentar la alcalinidad.

Para obtener una buena lmina de Gram, es necesario tomar en cuenta ciertas precauciones
tanto en su preparacin como en su observacin bajo el microscopio con el objetivo de
inmersin. Por ejemplo el proceso de extendido, es importante ya que la preparacin debe ser
fina y no gruesa. Si se coloca demasiada muestra del cultivo bacteriano, el extendido quedar
muy grueso y una vez teido, sin la ayuda del microscopio se observar una gran mancha
coloreada, pero vista bajo el microscopio, con el objetivo de inmersin, se observar una masa
oscura de estructuras que no pueden ser distinguidas en forma individualizada y el proceso de
identificacin de la bacteria se dificulta.

El segundo paso muy importante es el de la fijacin, ya que si el extendido bacteriano no se

fija adecuadamente, las clulas bacterianas se pierden durante el proceso de tincin que
involucra varios lavados y trae como consecuencia la ausencia de bacterias teidas. Por el
contrario un sobrecalentamiento puede ocasionar la aparicin de artefactos y la ruptura de la
morfologa de las clulas bacterianas.

Tambin antes de colocar la lmina en la platina determine en cul lado de la lmina

portaobjeto est localizado el extendido, sin embargo se tiene que observar varios campos
hasta encontrar aqul que permita una identificacin de la morfologa, estructura y reaccin al
Gram.

La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la

microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor
de las clulas bacterianas.

Referencias

Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory Manual in General

Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers. Dubuque, lowa
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales
(segunda edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth edition. Mc Graw-Hill
Book Company.

Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en accin. Manual de Laboratorio para

Microbiologa. Editorial Blume. Madrid-Espaa.