PRACTICA N04.

FERMENTACION ALCOHOLICA: EVALUACION DE LA CAPACIDAD

FERMENTATICA Y APROVECHAMIENTO DE CO2 EN LAVADURA.

I. OBJETIVOS

Determinar los rendimientos experimentales de la produccin de alcohol de una

levadura en soluciones de sacarosa (10 Brix) y de glucosa (10 y 20 Brix).

Determinar la eficiencia de produccin alcohlica de una levadura en soluciones de

sacarosa (10 Brix) y de glucosa (10 y 20 Brix).

II. FUNDAMENTO TEORICO

La humanidad emplea la fermentacin alcohlica desde tiempos inmemoriales para la

elaboracin de cerveza (empleando cereales) y del vino (empleando el fruto de la vid: la
uva en forma de mosto) fundamentalmente. Los griegos atribuan el descubrimiento de
la fermentacin al dios Dionisio.

En Alemania (1837) descubren que las bacterias (organismos microscpicos

unicelulares) son la causa del proceso, pero no fue hasta que Eduard Buchner en el ao
879 a.C descubre que la enzima zimasa es la responsable final de la fermentacin
alcohlica trabajo por el que recibe el Premio Nobel de Qumica. Con el advenimiento
de los descubrimientos qumicos en el ao 1815 el investigador francs Joseph Louis
Gay-Lussac fue el primero en determinar una reaccin de fermentacin obteniendo
etanol a partir de glucosa, a pesar de este logro los fundamentos de la fermentacin
alcohlica eran completamente desconocidos. Louis Pasteur en el ao 1875 demostr
que la fermentacin era un proceso anaerbico (en ausencia de oxgeno).

Los descubrimientos posteriores a partir del periodo que va desde mediados del siglo XX
hasta comienzos del siglo XXI se centran exclusivamente en la mejora de los procesos de
fermentacin alcohlica y conciernen ms a la optimizacin del rendimiento industrial
bien sea mediante una buena seleccin de cepas de levaduras, de una temperatura de
funcionamiento ptima, de cmo realizar fermentacin en un proceso continuo.

La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico realizado por las levaduras y

algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azcar en alcohol
etlico y dixido de carbono. La fermentacin alcohlica, comienza despus de que la
glucosa entra en la celda. La glucosa se degrada en un cido pirvico. Este cido pirvico
se convierte luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso
para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el mismo
microorganismo que es: la levadura comn o lo Saccharomyces cerevisae
III. MARCO TEORICO
A) GLUCOLISIS

La glucolisis representa el comienzo del metabolismo de la glucosa en todas las clulas

y da como producto dos molculas de tres carbonos, el piruvato. Una pequea cantidad
de la energa almacenada en la glucosa es capturada en formas utilizables. La glucolisis
no utiliza O2.

La fase inicial del catabolismo de los hidratos de carbono catabolismo de los hidratos de
carbono catabolismo de los hidratos de carbono catabolismo de los hidratos de carbono
es la gluclisis, proceso que ocurre en el citoplasma tanto de clulas aerbicas como
anaerbicas; en las clulas procariontes y las clulas eucariontes.- Este proceso ocurre en una serie
de nueve reacciones, cada una catalizada por una enzima especfica. Durante este
proceso, la molcula de glucosa se divide en dos molculas de un compuesto tricarbonado
llamado cido pirvico o piruvato. Los primeros pasos de la gluclisis requieren energa:
en los pasos 1 y 3 se generan enlaces de alta energa por transferencia de un grupo
fosfato desde una molcula de ATP a una molcula de azcar.

Figura 1. Glucolisis y fermentacin alcohlica.

En la prctica se trabajara con sacarosa, la cual se convertir en glucosa mediante

hidrlisis. La frmula correspondiente a la transformacin de sacarosa en glucosa es la
siguiente:

12 22 11 + 2 26 12 6 (Ecuacin 1)

B) RESPIRACIN CELULAR
La respiracin celular uso O2 (por tanto es aerobia) del medio y convierte cada molcula
de piruvato en tres molculas de CO2, a travs de una serie de reacciones metablicas.
Durante el proceso, una gran cantidad de la energa almacenada en los enlaces
covalentes del piruvato es liberada y transferida al ADP y al fosfato formando ATP.

La ecuacin correspondiente a la transformacin de la glucosa en agua y dixido de

carbono durante la respiracin celular es la siguiente:
6 12 6 + 62 62 + 62 + (Ecuacin 2)

C) FERMENTACIN

La fermentacin no involucra O2, (es anaerobia) y convierte el piruvato en acido lctico

o en alcohol etlico (etanol), que son molculas aun bastante ricas en energa. Como la
degradacin de la glucosa es incompleta, se libera mucha menos energa con la
fermentacin que a travs de la respiracin celular.

6 12 6 22 5 + 22 + (Ecuacin 3)

Figura 2. Fermentacin alcohlica

Fermentacin desde el punto de vista Bioqumico

Desde el punto de vista bioqumico una fermentacin se define como un proceso

mediante el cual las sustancias orgnicas (sustratos) sufren una serie de cambios
qumicos (reducciones y oxidaciones) que producen energa. Al finalizar la
fermentacin se presenta una acumulacin de varios productos, unos ms oxidados
(aceptaron electrones) y otros ms reducidos (donaron electrones) del sustrato, con
un balance total de energa positivo. Esta energa es utilizada en el metabolismo de
los microorganismos. (1)Es importante mencionar que en el concepto bioqumico,
no se consideran como fermentaciones los procesos en los que participa el oxgeno.
 Cuando el aceptor final de electrones es el oxgeno molecular y no una sustancia
orgnica el proceso se conoce como respiracin.

Fermentacin desde el punto de vista microbiolgico

Concepto microbiolgico de fermentacin: desde el punto de visa microbiolgica,

en la actualidad, se entiende por fermentacin aquel proceso en el que los
microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilizacin de
sustancias orgnicas, en ausencia o presencia de oxgeno. La descomposicin de los
sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por los microorganismos para
llevar a cabo tal finalidad. Se debe observar que el concepto llega a excluir a los
microorganismos que se encuentren presentes siempre y cuando estn presentes
sus enzimas; sin embargo, en esto casos, la velocidad del producto y los
rendimientos son menores.

Un proceso de fermentacin est compuesto por tres etapas:

La preparacin del inoculo
La seleccin del medio de cultivo
La produccin de la biomasa o de los metabolitos de inters

En la fermentacin alcohlica, el piruvato se convierte en etanol (alcohol etlico) en

dos pasos.- En el primer paso libera dixido de carbono del piruvato, que
se convierte en el compuesto de dos carbonos acetaldehdo
acetaldehdo acetaldehdo acetaldehdo. En el segundo paso, el acetaldehdo es
reducido por el NADH a etanol etanol etanol etanol.Esto regenera la provisin de
NAD + necesaria para la continuacin de la gluclisis. Muchas bacterias llevan a cabo
la fermentacin alcohlica en condiciones anaerbicas. La levadura (un
hongo) tambin lleva a cabo la fermentacin alcohlica. Durante miles de aos los
seres humanos han empleado las levaduras en la fabricacin de cerveza, de vinos y
en la panificacin. Las burbujas de CO2 generadas por la levadura del pan permiten
que este leude.

IV. MATERIALES Y MTODO

A. Materiales

Cultivo del microorganismo (Saccharomyces cerevisiae)

Baln (500 ml)
Algodn
Agua destilada
Glucosa
Sacarosa
B. EQUIPOS
Balanza Analtica
C. METODOLOGA

1. Pesar 4 balones de 500 ml y rotularlos.

2. Preparar 250g de sacarosa a 10Brix, 250g de sacarosa a 20Brix, 250g de glucosa a

10Brix y 250g de glucosa a 20Brix.

3. Colocar cada una de las soluciones preparadas en uno de los balones de 500 ml.

4. Introducir en cada solucin levadura ente 0.5 1% p/p. Si son 250 de solucin, agregar
2.5g de levadura.

5. Tomar el peso de cada uno de los balones ms sus respectivas soluciones para el tiempo
cero.

6. Tomar el peso de los cuatro balones cada 12 horas.

7. Encontrar la prdida de peso y cantidad de glucosa consumida (Brix) para el caso de

soluciones de sacarosa se tendr que realizar una conversin a glucosa.

8. Determinar el peso del CO2 formado (A+B), glucosa consumida por fermentacin (X) y
glucosa consumida por respiracin (Y).

9. Determinar el rendimiento experimental de la capacidad fermentativa de las levaduras

con la siguiente frmula:

()
=
()

10. Calcular finalmente la eficiencia de la capacidad fermentativa de las levaduras con la

siguiente frmula:

= 100

V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Sadava, D; Heller, H; Orian, G; Purves, W y Hills, D. 2009. Vida-La ciencia de la Biologa.

Octava Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Argentina

Campbell, N; Reece, J; Molles, H; Urry, L y Heyden, R. 2005. Biologa. Sptima Edicin.

Editorial Pearson Education

Garca, M; Quintero, R y Lpez, A. 2004. Biotecnologa alimentaria. Editorial Limusa.

Mxico.

Oviedo, L.; Lara, C y Mizger, M. 2009. Levaduras autctonas con capacidad fermentativa
en la produccin de etanol a partir de pulpa de excedentes de pltano Musa (AAB
Simmonds) en el departamento de Crdoba, Colombia. Revista Colombiana de
Biotecnologa. Universidad Nacional de Colombia.
PRCTICA N 5: CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA Saccharomycces cerevisiae
MEDIANTE EL MODELO MATEMTICO DE GOMPERTZ

I. OBJETIVOS

Determinar mediante recuento en cmara de Neubauer, el nmero de levaduras por

cada perodo de tiempo.
Modelar mediante la ecuacin matemtica de Gompertz la cintica de crecimiento
microbiano.
Determinar los parmetros de Gompertz.

II. FUNDAMENTO TERICO

La aplicacin de modelos matemticos para describir el crecimiento de los

microorganismos en alimentos ha tenido un notable desarrollo en los ltimos aos.

En esencia, los modelos microbianos, se basan en expresiones matemticas que

describen el comportamiento de los microorganismos. Esto incluye expresiones que
muestran los cambios en las poblaciones microbianas con el tiempo y cmo influyen las
condiciones ambientales sobre ese cambio (Whiting y Buchanan, 1994).

Los modelos microbianos constituyen valiosas herramientas, en la industria alimentaria,

para predecir el crecimiento o supervivencia de los microorganismos. Los modelos
pueden, de esta forma, aportar informacin muy til para tomar decisiones acerca de la
higiene y la vida til de un producto, pudindose estimar los riegos potenciales debidos
al crecimiento de patgenos en un alimento tras un perodo de almacenamiento en
determinadas condiciones, o establecer una fecha de caducidad para un producto
mediante la estimacin del tiempo necesario para alcanzar un nivel especificado de
alteracin del producto o de poblacin microbiana. Adems tambin son tiles en otro
tipo de situaciones relacionadas con la prediccin del control de calidad, el desarrollo
de nuevos productos, planes de trabajo y anlisis de datos en laboratorios y en
educacin.

Tipos de modelos microbianos

Los distintos modelos pueden ser clasificados en funcin del suceso que estudian o de
las variables consideradas. Whiting y Buchanan (1993) proponen una clasificacin en
tres niveles, denominados primario, secundario y terciario. En el nivel primario se
incluyen los modelos que describen los cambios de la poblacin microbiana con el
tiempo en unas determinadas condiciones. Aqu se incluyen los modelos de crecimiento
y de inactivacin/supervivencia microbiana. Los modelos del nivel secundario describen
la variacin de los parmetros de los modelos primarios con respecto a uno o ms
factores de cultivo o ambientales (pH, temperatura, atmsfera, etc.). En el nivel terciario
se encontraran las aplicaciones que ayudan a un mejor manejo de los modelos
primarios y secundarios de forma que, mediante un uso adecuado de la informacin
obtenida, permiten calcular y formular las predicciones, comparaciones y grficas
deseadas.

Dentro del nivel primario, los modelos matemticos para describir el crecimiento
microbiano pueden ir desde las, relativamente simples, apreciaciones basadas en las
respuestas de crecimiento o no crecimiento a tratamientos ms complejos donde se
describen cuantitativamente cada una de las fases del ciclo de crecimiento microbiano.
Un ejemplo del anterior mtodo fue desarrollado por Meyer et al. (1989) para
determinar los efectos del pH y la actividad de agua en el crecimiento de levaduras que
producan alteraciones en diferentes grupos de alimentos. Para modelar el crecimiento
microbiano en funcin del tiempo se utilizan con frecuencia curvas sigmoidales. Este
tipo de funciones se eligen debido a que presentan cuatro fases, similares a las curvas
de crecimiento microbiano, que comprenden una fase inicial de cambio lento, una fase
de cambio acelerado, otra fase de cambio desacelerado y, finalmente, una fase
estacionaria (Stannard et al., 1985; Gibson, et al., 1987; Baranyi, 1992). De este modo,
los modelos primarios permiten estimar parmetros cinticos de las curvas de
crecimiento microbiano como la fase de latencia, el tiempo de generacin, el ratio de
crecimiento mximo y la densidad de poblacin mxima de un microorganismo bajo
determinadas condiciones (Skinner y Larkin, 1994). Los dos modelos primarios usados
con mayor frecuencia son las funciones de Gompertz y la logstica (Gibson, et al., 1987).
Si bien ambas funciones son sigmoidales, la diferencia entre ellas radica en que la
funcin logstica es simtrica alrededor del punto de ratio de crecimiento mximo,
mientras que la funcin de Gompertz es asimtrica.

Modelo de Gompertz

El modelo ms ampliamente utilizado para describir el crecimiento microbiano es la

funcin de Gompertz modificada segn Gibson et al. (1987). Se trata de una ecuacin
sigmoidal asimtrica de cuatro parmetros que viene dada por la expresin:

L(t) = A + C exp (exp(B(tM))) Ecuacin (1)

Siendo:

L(t) = logaritmo decimal del recuento de microorganismos a un tiempo t log (ufc/ml).

A = logaritmo decimal del recuento inicial de microorganismo log (ufc/ml).

C = logaritmo decimal del incremento final de microorganismos log (ufc/ml).

M = tiempo al cual el cultivo alcanza su mximo ratio de crecimiento (h).

B = ratio de crecimiento relativo a M log (ufc/ml)/h.

 t = tiempo (h).

A partir de los parmetros A, B, C y M de la ecuacin de Gompertz es posible calcular

otros parmetros de crecimiento derivados como son el ratio de crecimiento
exponencial (RCE), el tiempo de generacin (TG), la fase de latencia (FL) y la densidad
mxima de poblacin (DMP) mediante las siguientes ecuaciones asociadas:

= [log(ufc/ml)/h] Ecuacin (2)

(log 2)
= [(h)] Ecuacin (3)

1
= [(h)] Ecuacin (4)

= + [log(ufc/ml)] Ecuacin (5)

Este modelo ha sido muy utilizado ltimamente por varios autores para describir la
cintica de crecimiento en diversas especies bacterianas aisladas de alimentos:
Salmonella y Escherichia coli (Gibson y Roberts, 1986; Buchanan y Bagi, 1994),
Aeromonas hydrophila (Marchetti et al., 1992), Listeria monocytogenes (Dalgaard et al.,
1994), Yersinia enterocolitica (Bhaduri et al., 1994). Sin embargo la bibliografa existente
sobre modelizacin de poblaciones de mohos y levaduras es mucho ms escasa.

III. MATERIALES Y MTODO

A. Materiales

M. Biolgico y Qumico

Saccharomycces cerevisiae
Sacarosa

Materiales de Laboratorio

Algodn
Baln de 2L
Cucharas
Pipeta de 10mL
Termmetro

Equipos

Balanza
Bao mara
Bioreactor con agitador mecnico
 Cmara de Neubauer
Microscopio
PHmetro
Refractmetro

Reactivos

Agua destilada 2L
Alcohol (desinfectar)
Azucar (sacarosa)
Tiocianato de amonio: NH4SCN (0.1N)
Cloruro de hidrxido de amonio: NH2OH.HCL
Cloruro de zinc: ZnCl2
Sulfato de Magnesio Heptahidratado: MgSO4.7H2O
Fosfato cido de Dipotacio Trihidratado: K2HPO4.3H2O

b) Metodologa

El medio de cultivo para el crecimiento de Sacharomyces cerevisiae, contena:

Tabla 1. Preparacin del medio de cultivo.

Componente Aporte Requerimiento por Cantidad

levadura (g) adicionada (g)
Azcar (sacarosa) Carbono Carbono: 400 400
Agua destilada H2O Agua:1594.7 1594.7
Tiocianato de amonio: Nitrgeno y Nitrgeno:2.6 7.08
NH4SCN azufre
Azufre:2.98
Cloruro de hidrxido de Nitrgeno Nitrgeno:72.08 72.08
amonio: NH2OH.HCL
Cloruro de zinc ZnCl2 Zinc Zinc:0.032 0.032
Sulfato de Magnesio Azufre, Azufre: 0.02 0.152
Heptahidratado MgSO4.7H2O magnesio y
agua Magnesio:0.015

Agua:0.08
Fosfato cido de Dipotacio Fosforo y agua Fosforo: 3 22.06
Trihidratado: K2HPO4.3H2O
Agua: 5.22

Procedimiento:

1. Limpieza y esterilizacin de todos los materiales a emplear.

2. Agregar el agua destilada requerida, y luego todos los dems ingredientes del medio de
cultivo previamente pesados.
3. Si fuese necesario disolver en bao mara cada uno de los componentes.
4. Ajustar Brix y Ph de la solucin segn requerimiento de levadura (20Brix y pH 5)
5. Esterilizar el medio preparada y colocar en bioreactor (previamente esterilizado
conjuntamente con agitador mecnico)
6. Agregar levadura (220g, debido a que mi solucin de 2L representa el 90% del medio el
10% restante representa la levadura)
7. Comenzar a medir crecimiento desde momento de agregar levadura, cada 15 minutos
las 2 primeras horas y luego cada media hora, todo en la cmara de Neubauer.
8. Determinacin de parmetros cinticos por mtodo de Gomperz.

IV. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

BaduriA K., Ray S., Rodriguez P. (1994). Evaluation of the minimum toughness in a dissimilar
metal weld joint by the tension test. Mis-matching of welds, ESIS-17 (eds) K-H Schwalbe, M
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Baranyi, J. (1992). Letters to the Editor: a note on reparameterization of bacterial growth

curves. Food Microbiology, Vol.9, pp. 169-171.

Buchanan, R. y Bagi, L. (1994). Expansion of response surface models for the growth of
Escherichia coli O157:H7 to include sodium nitrite as a variable. Int. J. Food Microbiol.
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Dalgaard, P., Ross, T., Kamperman, L., Neumeyer, K. y McMeekin, T. (1994). Estimation of
bacteria1 growth rates from turbidimetric and viable count data. Int. J. Food Microbial. 23,
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Gibson, E., Riccio, G., Schmuckler, A., Stoffregen, A., Rosenberg, D., y Taormina, J. (1987).
Detection of the traversability of surfaces by crawling and walking infants. Journal of
Experimental Psychology: Human Perception and Performance, 13, 533544.

Marchetti, R., Casadei, M. y Guerzoni, M. (1992). Microbial population dynamics in ready-

to-use vegetable salads. Ital. J. Food Sci., 2, 97-108.

Meyer, A., Nakane, J., Miller, J. y Ferdows, K. (1989). Flexibility: the next competitive battle-
the manufacturing futures survey. Strategic Management Journal, 10: 135-144.

Skinner, G. y Larkin, J. (1994) Mathematical modeling of microbial growth. Journal of Food

Safety. 14: 175-217.

Stannard, C., Abbis, J. y Wood, J. (1985). Efficiency of treatments involving ultraviolet

irradiation for decontaminating packaging board of different surface composition. Journal
of Food Protection 48, 786-789.
 PRACTICA 6. EXTRACCION DE UN PREPARADO ENZIMATICO
CRUDO (AMILASICO)

I. INTRODUCCION

A lo largo de los aos, el aumento del uso de microorganismos como fuente de

protenas, particularmente enzimas, ha conducido a la mejora en la eficiencia de
produccin y a productos ms reproducibles. La gran mayora de las enzimas de uso
industrial son protenas extracelulares procedentes de organismos como: Aspergillus sp.
Bacillus sp. incluye a las enzimas -amilasa, -glucanasa, celulasa, dextrinasa, proteasas
y glucoamilasa1. Muchas de estas son producidas a partir de cepas silvestres de
microorganismos. Sin embargo, en la produccin de protenas para uso en el campo del
diagnstico clnico y para aplicaciones teraputicas, la ingeniera gentica y proteica est
comenzado a jugar un papel muy importante da a da. La ingeniera gentica de ms de
permitir enormes incrementos del rendimiento, ha permitido la transferencia del
material gentico de animales bacterias. De esta forma, esos productos slo disponibles
en pequeas cantidades en los tejidos animales pueden ser producidos ahora en
cantidades virtualmente ilimitadas a partir de bacterias crecidas de forma muy sencilla.

Las enzimas o las protenas producidas por los microorganismos pueden ser
intracelulares, periplsmicas o secretadas al medio de cultivo. Para extracelulares, el
grado de purificacin requerido es mnimo y los procesos a gran escala pueden rendir
toneladas de producto proteico. Podra ser aceptable adems, en funcin de la finalidad
deseada, que el producto final no presente una fuerza absoluta, particularmente si el
material va a ser destinado a su uso industrial. Muchas otras enzimas sin embargo, son
producidos en mezclas intracelulares ms complejas y representan un mayor desafo
implicado en la purificacin proteica. Los productos para un uso teraputico deben
presentar una caracterstica de pureza muy exigente y exacta y para obtener esto puede
ser necesario desarrollar protocolos de purificacin.

II. OBJETIVOS

Extraer preparados enzimticos crudos de papaya, hgado de pollo y pepas de pacae.

Realizar un anlisis cualitativo de los preparados enzimticos crudos para observar si
existe actividad enzimtica.

III. FUNDAMENTO TEORICO

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas,
siempre que sean termodinmicamente posibles: Una enzima hace que una reaccin
qumica que es energticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja,
sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia
de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas
denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas
 productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran a
unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina
reacciones enzimticas.
Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su
velocidad crece slo con algunas reacciones, el conjunto (set) de enzimas sintetizadas
en una clula determina el tipo de metabolismo que tendr cada clula. A su vez, esta
sntesis depende de la regulacin de la expresin gnica.
Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de
activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de
reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que
intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen
acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reaccin que se produce bajo el
control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho ms
deprisa que la correspondiente reaccin no catalizada.
Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las
reacciones que catalizan, ni alteran su equilibrio qumico. Sin embargo, las enzimas
difieren de otros catalizadores por ser ms especficas. Las enzimas catalizan alrededor
de 4.000 reacciones bioqumicas distintas. No todos los catalizadores bioqumicos son
protenas, pues algunas molculas de ARN son capaces de catalizar reacciones (como la
subunidad 16S de los ribosomas en la que reside la actividad peptidiltransferasa).
Tambin cabe nombrar unas molculas sintticas denominadas enzimas artificiales
capaces de catalizar reacciones qumicas como las enzimas clsicas.
La actividad de las enzimas puede ser afectada por otras molculas. Los inhibidores
enzimticos son molculas que disminuyen o impiden la actividad de las enzimas,
mientras que los activadores son molculas que incrementan dicha actividad. Asimismo,
gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad. Muchas drogas o
frmacos son molculas inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por la
temperatura, el pH, la concentracin de la propia enzima y del sustrato, y otros factores
fsico-qumicos.

IV. MARCO TEORICO

A. Amilasas

La amilasa, denominada tambin sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene

la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -
Amilosa al digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce
principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el
pncreas. Tiene actividad enzimtica a un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se
inflama, como en la pancreatitis, aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado
su nivel en sangre (amilasemia). Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por
Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de "diastasa".
B. -Amilasa

Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en

ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los
carbohidratos, descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede
actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales
es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2.

C. Almidn

El almidn es un polisacrido de reserva alimenticia predominante en las plantas,

constituido por amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las caloras
consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidn como los productos
de la hidrlisis del almidn constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles
de la dieta habitual. Del mismo modo, la cantidad de almidn utilizado en la preparacin
de productos alimenticios, sin contar el que se encuentra presente en las harinas usadas
para hacer pan y otros productos de panadera.
El almidn se diferencia de todos los dems carbohidratos en que, en la naturaleza se
presenta como complejas partculas discretas (grnulos). Los grnulos de almidn son
relativamente densos, insolubles y se hidratan muy mal en agua fra. Pueden ser
dispersados en agua, dando lugar a la formacin de suspensiones de baja viscosidad que
pueden ser fcilmente mezcladas y bombeadas, incluso a concentraciones mayores del
35%.

V. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. MATERIALES

Tubo de ensayos.
Gradilla.
Morteros.
Pipetas.
Fiolas.
Muestra: papaya madura, hgado, pepas de pacae.

B. EQUIPOS
Bao Mara.

C. REACTIVOS

Cloruro de potasio KCl 0.154 N.

Solucin de almidn 400 ppm.
Solucin Iodada I2.
Acido Clorhdrico HCl.
 D. METODOLOGIA

MUESTRA Papaya, hgado,

pepas de pacae.

LAVADO KCl 0.154 N.

HOMOGENIZADO En un mortero
adicin de KCl.

FILTRADO Con gasa.

4000 rpp x 10
CENTRIFUGACION
min.

SOBRENADANTE

Para cada muestra de sobrenadante obtenida se agregara las siguientes soluciones teniendo
como parmetros de comparacin un tubo testigo y un blanco, para el posterior anlisis
comparativo.

Tabla 1. Procedimiento a realizar en el tubo testigo, problema y blanco

TESTIGO PRUEBA BLANCO

Solucin de almidn 400 ppm. 2.5 ml 2.5 ml -

Agua destilada 0.4 ml 0.4 ml 2.9 ml
PEC - 0.1 ml 0.1 ml
Incubar a 35C x 15 min - - -
Agregar HCl 0.1 N 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
PEC 0.1 ml - -
Solucin de iodo. 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
VI. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Voet, D y Voet, J. 2006. Bioqumica. Tercera Edicin. Editorial Mdica Panamericana

McGivery, R. 1977. Conceptos Bioqumicos. Editorial Revert. Barcelona, Espaa.

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Sandoval, E. 2005. Tcnicas aplicadas al estudio de la anatoma vegetal. Instituto de

Biologa. Universidad Nacional Autnoma de Mxico.

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San Jos de Costa Rica.

Conn, M. 1996.Bioqumica Fundamental. Editorial Limusa. Mxico.

 PRACTICA 7. CURVA DE CALIBRACION

I. OBJETIVOS

Realizar un anlisis cuantitativo de los preparados enzimticos crudos mediante una

curva de calibracin.

Realizar la marcha analtica de cuantificacin de la actividad, utilizando la curva de

calibracin y determinar las Unidades Street Close (USC) de un preparado
enzimtico crudo (PEC).

II. MARCO TEORICO

a. Espectrofotometra

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones

biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin
absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de
soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro
visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.

La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la

estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa

radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la
luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes
de onda no absorbida.

b. Curva de calibracin

La curva de calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la

Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abscisas). Se ensayan
varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A, construyndose la
curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su
concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema en la
curva de calibracin.
 Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del
cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y
Concentracin.

c. Unidades enzimticas

La accin de las enzimas se mide determinando la cantidad de sustrato consumido, de

producto formado o el nmero de las acciones elementales realizadas por unidad de
tiempo, en condiciones estandarizadas. A veces, esta medicin requiere el anlisis de un
tercer o cuarto compuesto relacionado estequiomtricamente con la accin enzimtica
propiamente dicha.

As se define como unidad internacional de actividad enzimtica, U, a la cantidad de

enzima necesario para transformar un micromol de sustrato por minuto, a 25C y en
condiciones estandarizadas; por ejemplo, la concentracin de sustrato debe ser
saturante.

La actividad especfica es el nmero de unidades internacionales por mg de protena

(U/mg) o por ml de disolucin (U/ml). Estas mediciones pueden realizarse sin haber
conseguido la purificacin completa o el aislamiento previo de la enzima.

III. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. MATERIALES
Tubo de ensayos.
Gradilla.
Morteros.
Pipetas.
Fiolas.
Muestra: papaya madura

B. EQUIPOS
Bao Mara.

C. REACTIVOS
Cloruro de potasio KCl 0.154 N.
Solucin de almidn 400 ppm.
Solucin Iodada I2.
cido Clorhdrico HCl.

D. METODOLOGIA

1. Realizar la extraccin del preparado enzimtico crudo (PEC) a partir de 20g de

muestra.
2. Construir la curva de calibracin utilizando para ello cinco tubo con soluciones de
almidn a diferentes c concentraciones y un tubo blanco como se muestra en el
siguiente cuadro:

Tabla 1. Soluciones para la construccin de la curva de calibracin

COMPONENTE Blanco 1 2 3 4 5
Solucin de 0 0.5 1 1.5 2 2.5
almidn
Agua destilada 3 2.5 2 1.5 1 0.5
HCl 0.1N 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
solucin iodada 0.1 2.5 0.1 0.1 0.1 0.1

3. Leer en el espectrofotmetro la absorbancia de cada uno de los 5 tubos, utilizando

calibrando con el blanco (tubo B) y a una longitud de onda de 550 nm.

4. Graficar la curva de calibracin enfrentando la absorbancia vs. La concentracin de

almidn y determina el factor de conversin.

CURVA DE CALIBRACION

y =A x
Absorvancia (A)

A: Facto de
conversion

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentracion de almidon

Figura 1. Construccin de la curva de calibracin.

5. Cuantificar la accin de PEC enfrentndolo al sustrato, para lo cual se tendr un tubo

blanco (B) y un tubo problema (P) como se muestra en el siguiente cuadro:
 Tabla 2. Cuantificacin de la accin de PEC.

COMPONENTE TUBO BLANCO TUBO

PROBLEMA
Solucin de almidn - 2.5
Agua destilada 2.9 0.4
PEC 0.1 0.1
Incubar 35 C x 15 min - -
HCl 0.1 N 0.25 2.5
Solucin de iodo 0.1 0.1

6. Llevar al espectrofotmetro y leer la absorbancia a 550 nm del tubo blanco (B) y del
tubo problema (P).

7. Determinar los miligramos de almidn hidrolizados y USC que es cantidad de enzima

capaz de hidrolizar 20mg de almidn a 35C por 15 minutos y a pH 7.0, realizando para
ello la lectura corregida del tubo problema (P), luego los miligramos de almidn residual,
para lo que se utiliza el factor de conversin A determinado en la curva de calibracin.
Con los miligramos de almidn residual se puede determinar los miligramos de almidn
hidrolizado y con este las USC; siguiendo los pasos como se muestra en el siguiente
cuadro :

Tabla 3. Determinacin de los miligramos de almidn hidrolizados y de las USC.

Muestra Lectura Lectura Almidn Almidn USC

de Abs. corregida residual hidrolizado (mg)
(mg)
Blanco (b) LB Abs= LP - LB Lectura Almidn inicial- Almidn
Problema LP corregida * almidn residual hidrolizado *0.20
(p) %A
IV. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Silva, M.; Garca, M; Del castillo, L; Ania, J y Gmez, D. 2006. Tcnicos especialistas de
laboratorio del Servicio Vasco de Salud-Osakidetza. Segunda Edicin. Editorial MAD.

Quesada, S. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para Bioqumica. Editorial de

la Universidad Estatal a Distancia. San Jos de Costa Rica.

Hernndez, L y Gonzales, C. 2002. Introduccin al Anlisis instrumental. Primera Edicin.

Editorial Ariel. Espaa

Miller, J y Miller, J. 1993. Estadstica para qumica analtica. Editorial Addison-Wesley

Iberoamericana.

Castillo, F y Roldn, M. 2005. Biotecnologa Ambiental. Editorial TEBAR. Madrid,

Espaa.

MacFaddin, J. 2003. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de

Importancia Clnica. Tercera Edicin. Editorial Panamericana.
 PRACTICA 8. INMOVILIZACION ENZIMATICA

I. OBJETIVOS:

Lograr inmovilizar enzimas de -amilasa y -amilasa altamente concentradas, por

mtodo de atrapamiento en gel.
Determinar la actividad de la enzima antes y despus de ser inmovilizada.

II. FUNDAMENTO TEORICO

La inmovilizacin de enzimas es el proceso en el cual se restringen, parcial o totalmente,

los grados de libertad de movimiento de las enzimas, clulas, etc., mediante la unin o
adhesin a un soporte. El uso de enzimas inmovilizadas tiene importantes ventajas para
los procesos enzimticos, como el aumento de la estabilidad de la enzima, la
disminucin de costos -ya que en muchas ocasiones se pueden reutilizar los derivados
enzimticos- y adems la posibilidad de disear un reactor adaptado al proceso que sea
fcilmente manejable y controlable. Sin embargo, tambin pueden existir algunas
desventajas en el proceso de inmovilizacin debido a que la unin entre la enzima y el
soporte puede darse de tal manera que el sitio activo de sta quede impedido
estricamente, evitando as el paso del sustrato, disminuyendo o eliminando la actividad
enzimtica. Tambin es posible que la unin de la enzima al soporte origine un cambio
conformacional que produzca una forma inactiva.

Las enzimas inmovilizadas tienen aplicacin en diversas reas como el diseo de

biosensores, utilizados principalmente en la medicina; control del medio ambiente y de
la calidad de los alimentos; asimismo, en la industria farmacutica para la fabricacin de
antibiticos; dentro de la industria alimentaria para la obtencin de edulcorantes y
aditivos, y en la industria mdica para la remocin de tejido necrtico en heridas
drmicas, inmovilizadas en forma de apsitos o vendas.

Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella fsica/qumicamente asociada a, o

contenida en, un soporte/matriz no esencial para su actividad.
La inmovilizacin permite la utilizacin de las enzimas en procesos continuos, lo que
permite aumentar su productividad, bien para facilitar la separacin del catalizador de
sus productos, simplificando la etapa posterior de purificacin.
La utilizacin de enzimas inmovilizadas o no depender de una evaluacin econmica
de las alternativas, donde se considerarn datos de cintica y estabilidad, costo,
propiedades fisicoqumicas, eficiencia de inmovilizacin y carga del soporte.
Se torna evidente que si el costo de una enzima es muy bajo, la factibilidad de su
utilizacin en forma inmovilizada es poco probable.
Las enzimas normalmente se inmovilizan a travs de algn tipo de interaccin entre sus
residuos aminoacdicos y el soporte. Esto puede producir prdidas considerables de
actividad, al comprometer los aminocidos en el, o vecinos del, sitio activo. Para
minimizar este problema se inmoviliza por intermedio de las molculas de carbohidratos
(enzimas glicoproteicas) o por la utilizacin de espaciadores.
III. MARCO TEORICO

A. INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

El proceso en el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de

movimiento de enzimas, orgnulos, clulas etc. por su unin a un soporte. El
confinamiento fsico de una enzima o clula en una determinada regin del espacio, de
manera que su actividad cataltica se retenga y pueda ser reutilizada.

El uso de enzimas en la industria presentan una clara ventaja frente a los catalizadores
clsicos, como son la alta especificidad y actividad a condiciones normales, sin embargo,
a pesar de estas ventajas su uso en la industria es restringido por algunas dificultades
como: separar el producto de la enzima y que su actividad es dependiente de las
condiciones experimentales (pH, temperatura).

B. ATRAPAMIENTO
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz
slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o
polmeros del tipo oliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de
poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la
enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un
cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento
puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer
caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso
la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El
atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca
cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima
no sufre ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere
un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de
que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.

C. MICROENCAPSULACIN

En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que

permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas
membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin
interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas
reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos
mtodo se pueden
encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas,
permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples
pasos.

IV. MATERIALES Y METODOLOGA:

A. MATERIALES

Material Biolgico

-amilasa
-amilasa

Reactivos y Soluciones

Agua destilada
HCl (0.1 N)
Solucin yodada
Solucin de almidn (1000 ppm)
Alginato de sodio

Material de Vidrio y otro

Pipetas de 1 y 2 ml
Pipetas de 5 y 10 ml
Tubos de ensayo.
Jeringa

B. Equipos

Balanza analtica
Equipo de bao Mara
Micropipeta

C. METODOLOGA

Inmovilizacin de la enzima por atrapamiento en gel

Para :

Colocar en un tubo de ensayo (1) 6 ml de solucin de alginato de sodio al 2% y

agregarle 200 de .
Tomar con una jeringa la nueva solucin que contiene el tubo de ensayo (1).
Agregar gota a gota la solucin de enzima alginato de sodio a otro tubo de
ensayo que debe contener una solucin de cloruro de calcio.
Se formaran pequeas perlas las cuales deben ser separadas con el uso de un
colador para luego extraer el exceso de solucin acuosa con papel absorbente.

Para :

Colocar en un tubo de ensayo (2) 10 ml de solucin de alginato de sodio al 2% y

agregarle 200 de .
 Tomar con una jeringa la nueva solucin que contiene el tubo de ensayo (2).
Agregar gota a gota la solucin de enzima alginato de sodio a otro tubo de
ensayo que debe contener una solucin de cloruro de calcio.
Se formaran pequeas perlas las cuales deben ser separadas con el uso de un
colador para luego extraer el exceso de solucin acuosa con papel absorbente.

a) Anlisis cualitativo de la accin de la enzima inmovilizada.

Preparar una solucin de almidn soluble de 1000 ppm.

Marcar tubos de ensayo para el tubo testigo, tubo problema y el blanco y realizar lo
que se indica en el siguiente cuadro.

Tabla 1. Procedimientos a realizar en el tubo testigo, problema y blanco para la

enzima inmovilizada.
TESTIGO PROBLEMA BLANCO
Agregar la solucin de 2.5 ml 2.5ml -
almidn de 1000ppm

Agregar agua destilada 0.4ml 0.4 ml 2.9ml

Agregar la enzima - 20 perlitas 20 perlitas
inmovilizada

Incubar a 35C por 15 minutos

Agregar HCL 1.5 N 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agregar la enzima 20 perlitas - -
inmovilizada
Agregar la Solucin de Iodo 0.1ml 0.1ml 0.1ml

b) Anlisis cualitativo de la accin de la enzima libre.

Preparar una solucin de almidn soluble de 1000 ppm.

Marcar tubos de ensayo para el tubo testigo, tubo problema y el blanco y realizar lo
que se indica en el siguiente cuadro.
 Tabla 2. Procedimientos a realizar en el tubo testigo, problema y blanco para la
enzima libre.
TESTIGO PROBLEMA BLANCO
Agregar la solucin de 2.5 ml 2.5ml -
almidn de 1000 ppm

Agregar agua destilada 0.4ml 0.4 ml 2.9ml

Agregar la enzima libre - 20 20

Incubar a 35C por 15 minutos

Agregar HCL 1.5 N 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agregar la enzima libre. 20 - -
Agregar la Solucin de Iodo 0.1ml 0.1ml 0.1ml

V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Hartmeier, W. (1985) Immobilized biocatalysts: from simple to complex systems. Trends

Biotechnol. 3: 149-153.

Garca, C. (1995) La pared celular: componente fundamental de las clulas vegetales.

Universidad Autnoma de Chapingo. Mxico. 75 pp

Martinek, K.; Mozhaev, V.,(1987) Immobilization of enzymes: an approach to fundamental

studies in biochemistry. Adv. Enzymol. 57: 179-249.

Taylor, R.. (1991) Protein Immobilization: fundamentals and applications, Marcel Dekker,
New York.

Wingard, L., (1972) Enzyme Engineering, Interscience Publishers, New York.