UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

INFORME N 1
CURSO: Laboratorio de Microbiologa General

TTULO: Tincin simple con colorantes bsicos

MESA N

INTEGRANTES:

20130318 Capistrano Feliciano Elvis

LA MOLINA
2016
 INTRODUCCIN
El microscopio de campo claro es el ms til para la observacin de
especmenes teidos. Los colorantes son compuestos qumicos utilizados
para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales,
que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto,
colorean clulas vivas. No obstante, la mayora de los colorantes son
solamente efectivos despus de que los microorganismos hayan sido
fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la
fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra
lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa
la preparacin de Forma rpida sobre la llama de un mechero. El calor de la
llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas.
Las protenas coaguladas unen las clulas a la lmina. Cuando se desea fijar
especmenes delicados se utiliza la fijacin qumica, ya que es menos lesiva
que el calor. Para ello se aade una gota del fijador, por ejemplo, cido
smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre la muestra lquida con los
microorganismos.

La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona

la apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la identificacin; adems,
no permite la observacin del movimiento de los microorganismos. Despus
de la fijacin, se aade el colorante, que debe permanecer el tiempo
suficiente en contacto con el espcimen, para que pueda ser absorbido. A
continuacin, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con
agua.

Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones
cargados. Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que
tie es el ion cargado positivamente, mientras que en los cidos, el
colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes ms utilizados
son los de tipo bsico, ya que la mayor parte de las clulas microbianas
Poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su
unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se encuentran la
safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los
colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas
positivamente. Se utilizan para teir tejidos animales infectados con
microorganismos. Entre los ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida
y el rojo Congo.
I-Objetivos:
realizar tinciones simples empleando tres tipos de colorantes (azul de
metileno, cristal violeta, carbolfucsina).
Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los
diferentes tipos de agrupaciones.
Practicar la observacin con el microscopio al mximo aumento y
familiarizarse con el correcto empleo del aceite de inmersin.

II-Marco terico
La mayor parte de las bacterias son transparentes, por lo que suele ser
necesario recurrir al uso de tinciones si se desea observar a estos seres
vivos con un microscopio ptico convencional de campo claro. Las tinciones
aumentan artificialmente el contraste entre las clulas bacterianas y el
medio circundante. A continuacin daremos a conocer los tipos de
colorantes:

1. Tipos de Colorantes
1.1 Colorantes segn su origen
a) C. Naturales: son extrados principalmente de plantas, pero tambin de
animales.
Ejemplo: La Hematoxina: extrada de un tronco. El Azul de ndigo:
extrada de una leguminosa. El Carmn: extrada de un animal (la
cochinilla).

b) C. Artificiales: son preparados artificiales, obtenidos en su mayora del

carbn del alquitrn de la hulla. Son colorantes de Anilina. Pueden ser
cidos y bsicos, que pueden presentarse formando Sales, as como
Colorantes Neutros.
 Ejemplo: Cristal Violeta, azul de Metileno,Ac. Pcrico y fucsina bsico.

1.2 Colorantes segn su comportamiento Qumico

En general un colorante dependiendo de su estructura fisicoqumica, se

unir de una forma ms estable a la estructura que tia. Este tipo de
colorantes esta constituidos fundamentalmente por su anillo bencnico
al que se une distintos Radicales, de los cuales uno ser coloreado y
corresponde al Radical Cromoforo. A mayor nmero de Radicales
Cromoforos mayor ser el poder del colorante de la solucin. Si al anillo
bencnico se le une unos radicales No Coloreados o Auxocromos, estos
no poseern capacidad tintorial, pero proporcionara estabilidad,
posibilitando que se tian los radicales coloreados.

a) C. cidos o Aninicos: son aquellos donde la carga del radical

colorante es (-), corresponde principalmente a colorantes
Citoplasmticos, ya que los citoplasmas son bsicos y captan muy bien
los colorantes cidos. Ejemplo: Eosinas, Auraminas, etc.
b) C. Bsicos o Catinicos: aqu la carga del ion Cromoforo es (+),
correspondern a colorantes que tien estructuras de carcter Nuclear o
similar que son cidos, es decir cargados negativamente. Ejemplo:
Fucsina bsica, Cristal violeta (v. De Genciana), etc.
c) C. Neutros: es una sal compuesta de un colorante cido y colorante
bsico. Ejemplo: Eosinato azul de Metileno, etc.
d) C. Indiferentes: son Insolubles en agua, pero solubles en alcohol. No
predomina ninguna carga, pero tampoco tiene carcter neutro. Son los
colorantes de los lpidos. Ejemplo: Sudan III, Negro Sudan, etc.
2. Tcnica de Tincin
El proceso de Tincin supone una reaccin de intercambio de Iones entre
el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula
bacteriana, de tal manera que los iones teidos del colorante remplazan
iones celulares. Permitiendo contrastar el microorganismo con el medio
que lo rodea.

3. Ventajas de la Tcnica de la Tincin

Observar ms adecuadamente la morfologa de los microorganismos.
 Permite diferenciar distintos tipos morfolgicos.
Informacin sobre estructuras internas y/o externas, que al realizarse
por examen fresco no son visibles.
Permite diferenciar grupos de microorganismos y ordenarlos por
algunas caractersticas presentadas.

4. Tipos: Tinciones Bacterianas.

a) Tincin Simple: caracterizado por:
Necesita fijacin de las bacterias.
Utiliza un solo colorante.
Permite observar la morfologa bacteriana.
Se dividen a su vez en:
Tinciones Simples con colorantes bsicos.

Tinciones Simples con colorantes cidos.

Tinciones Simples con colorantes neutros.

b) Tincin Negativa:
Es un tipo de Tincin simple, pero adems de observar su morfologa se
aprecia caractersticas estructurales. Se caracteriza por:

No necesita fijacin.
Utiliza un solo colorante.
Permite observar sobre un fondo oscuro, la forma de la bacteria y
algunas caractersticas estructurales (presencia de cpsula).

c) Tinciones Diferenciales: se caracterizan por:

Necesita fijacin previa por calor.
Utilizan dos colorantes (l ltimo es el colorante de contraste).
Se puede observar la morfologa y otras caractersticas, como
composicin de la pared bacteriana, etc., como sucede en la Tincin
de Gram.
d) Tinciones Estructurales: presentan las siguientes caractersticas:
Requiere fijacin previa por calor.
Utiliza al menos dos colorantes.
Se observa la morfologa bacteriana.
Permite visualizar caractersticas.
Estas se clasifican en:

Tincin de cpsulas.

Tincin de esporas.

Tincin de flagelos, etc.

5. Factores que determinan una buena Tincin

Para llevar a cabo una buena Tincin, se debe tener en cuenta algunos
factores que pueden alterar los resultados finales, estos son:

Pureza del colorante, el colorante debe estar limpio de pureza, para

que no modifique la morfologa del microorganismo.
Concentracin del colorante, existe un rango de 0.2 a 2%, a una
mayor o menor concentracin se obtendr malos resultados.
PH del colorante, factor principal, este determina la fijacin o no del
colorante a las estructuras.
Conservacin del colorante, colocados en lugares frescos, secos,
oscuros, que estn bien envasados y etiquetados.
Elaboracin, algunos colorantes necesitan estar en soluciones
acuosas o hidroalcoholicas, por lo que debern pasar primero por un
proceso de preparacin.
Tcnica empleada, realizar todo meticulosamente, no olvidando
ningn paso y teniendo muy en cuenta la limpieza.
Temperatura, cada tcnica usa un determinado colorante, por lo que
la temperatura optima vara en cada caso.
Cantidad de muestra, es fundamental que la muestra tomada sea
representativa y homognea, de tamao ni muy grande ni muy
pequea.
Realizar correctamente la fijacin, ser muy importante a la hora de
realizar una Tincin, ya que al agregar el colorante, cabe el riesgo de
que el microorganismo sea arrastrado con los colorantes.
 Soluciones mordientes, estas soluciones fijan los colorantes a las
estructuras bacterianas.
Tiempo de Tincin, es vital el tiempo en que va estar expuesto el
microorganismo con el colorante, el tiempo se encuentra entre 1 a 10
minutos.

6. Fijacin del Microorganismo

La fijacin de un microorganismo juega un rol muy importante, debido a
que si no se hubiese fijado correctamente este correra el peligro de ser
retirado al momento de enjuagar con el decolorante por ello debes
seguir los siguientes pasos:

a) Si es Lquido, se coloca un porta objeto previamente esterilizado,

usando el Asa de Kolle, se extiende la muestra sobre el portaobjeto, de
tal forma que quede una capa fina y homognea, si fuera espesa, se
agrega agua destilada.

b) Si es Slido, se deposita sobre el porta objeto esterilizado, una

pequea gota de agua, en ella se agrega una cantidad pequea de
cultivo, al igual que en l liquido se extiende para obtener una pelcula
fina y homognea de la muestra, para ello usando el Asa de Kolle, que
tambin debe estar esterilizado.
Para ambos casos la muestra se fija mediante le flameado de la
preparacin con calor, debido a que las protenas se coagulan
rpidamente quedando adheridas al porta objetos.

1. Toma de muestra.
2. La gota del inoculo se extiende sobre el porta objeto.
3. Secar al aire.
4. Fijar.

III-Materiales:

-Asa de kolle
-Muestra conteniendo
bacterias

-Laminas portaobjetos

-Mechero de alcohol

-Piseta con agua

IV- PROCEDIMIENTO PARTE EXPERIMENTAL

Ejercicio 1:

PREPARACION DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS PARA TINCIN

Antes de desarrollar una tcnica de tincin, el material a observar debe ser

fijado, a una lmina de vidrio (portaobjetos) sobre la cual ha de realizar la
tincin. Si la preparacin no es fijada tiende a perderse durante el
procedimiento de tincin. El procedimiento de fijacin mata al
microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesin a la
lmina de vidrio.

papel secante
Los materiales que usamos fueron:

Bacterias (se encontraban en cultivo dentro de un tubo de ensayo)

Asa de kolle
Lmina porta objeto
Mechero

Procedimiento

Tomamos el porta objeto, para limpiar la grasa y otras impurezas que tiene
usamos algodn y alcohol y frotamos varias veces el porta objetos, una vez
limpio colocamos una gota de agua sobre el portaobjeto, luego escogemos
el tipo de bacteria que queremos fijar, en esta ocasin realizamos tres
muestras, la primera con E. coli, la segunda Bacillus y la tercera
staphylococcus. Para empezar la fijacin de la muestra debemos encender
el mechero ya que este esteriliza la zona de trabajo antes de abrir el tubo
de ensayo que contiene el agar en cultivo de la bacteria, ahora
esterilizamos el asa de kolle introducindolo en la llama, luego abrimos el
tubo de ensayo que contiene al agar en cultivo de la bacteria y raspamos
cuidadosamente para no daar el agar, despus esparcimos en todo el
porta objeto tratando de que se forme una pelcula delgada, despus
secamos la lmina al aire y para que termine de secar podemos pasar la
lmina a travs de la llama del mechero unas tres veces, cuidando siempre
que no se recaliente ya que se puede alterar la forma y la estructura del
microorganismo. Es asi que como resultados obtenemos una muestra fijada.

Ejercicio 2:

TINCIN SIMPLE CON COLORANTES BSICOS

La tincin simple es una tcnica muy sencilla y directa que a travs del uso
de un colorante, nos permite observar, contrastar y diferenciar los
microorganismos de su entorno.

Los colorantes que usamos en esta oportunidad son de naturaleza bsica,

ya que estos pintan con facilidad las partes cidas de la clula.
En la siguiente tabla detallaremos la reactividad de los colorantes que
usamos.

TABLA 1 Colorantes usados en la tincin.

Colorante Tiempo que necesita para teir la

muestra

Azul de metileno (reacciona con clulas 60 segundos

cargadas - )

Cristal violeta 10 segundo

fucsina 5 segundos

Materiales:

Lminas fijadas de Cristal violeta

microorganismos fucsina
Aceite de inmersin Papel secante
Colorantes bsicos Piseta de agua
Azul de metileno Soporte de tincin
 Procedimiento:
Colocamos las lminas fijadas de microorganismos sobre soporte para
tincin, luego agregamos de 4 a 5 gotas de colorante dejando que
acte el tiempo que necesita para teir la muestra en el caso de azul
metileno ser 6os, cristal violeta 10 s y fucsina 5s. Una vez cumplido
el tiempo, lavamos cada lmina con la piseta de agua, luego para
retirar los excesos de agua secamos con papel o al aire. Para terminar
el proceso una vez seco la muestra agregamos una gota de aceite de
cedro o inmersin y lo llevamos a observar el microscopio con el lente
1000X. Los resultados se detallaran a continuacin.

V-Resultados:

G.A: 1000X
Forma: cocos

Agrupacin: racimo (estafilo)
Gnero: Staphylococcus
sp.

Colorante: Cristal violeta

VI-DISCUSIONES

VII-CONCLUSIONES

Bibliografa

-Madigan, Michael T; Martinko, John M; Dunlap, Paul V; Clark,

David P. Brock, Biologa de los Microorganismos. 12da Ed.
(2009). Pearson Education Inc.(pp. 30-31)

-Gamazo, Carlos; Lpez-Goi, Ignacio; Daz, Ramn. Manual

prctico de MICROBIOLOGIA. 3ra Ed. Masson(2005). pp.24-25

-Robertson J, Gomersall M, Gill P. (1975). Mycoplasma hominis:

growth, reproduction, and isolation of small viable cells. J
Bacteriol. 124 (2): pp. 10071018.

-MICROBIOLOGIA, SEGUNDO CURSO GUIN DE PRCTICAS

Curso 2007-2008.
 -Morfologa y estructura bacteriana. M. Prez, M. Mota

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000024/leccione
s/cap01/01_03_05.htm

-M.C. Evangelina Olive E. Manual de laboratorio de

microbiologa bsica. Universidad autnoma de ciudad de
Jurez. Primera edicin. 2001 [

-Rodrguez E. Gamboa M. Hernndez F. Garca J. Bacteriologa

general. Principios y prcticas de laboratorio. [Consulta: 8 abril
2015]. Disponible en: