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Aislamiento y control de Streptomyces spp.

Ing. Liliam Gutarra

Centro Internacional de la Papa (CIP), Lima, Per

1. Descripcin del agente causal

Streptomyces spp. estn clasificados como bacterias atpicas, debido a que carecen de ncleo,
son gram positivos. Su similitud con los hongos reside en su morfologa filamentosa, pero se
diferencian notablemente por el reducido dimetro de su filamento vegetativo
(aproximadamente una micra) y carencia de ncleo. Existen tres especies que afectan al cultivo
de la papa. S. scabies, S. acidiscabies y S. turgidiscabies. los cuales producen un substrato de
micelio vegetativo que desarrolla filamentos areos. Las esporas provienen de la fragmentacin
del micelio.
Las tres especies producen taxotominas, las cuales parecen jugar un rol importante en el
desarrollo de la enfermedad. Estas toxinas inducen los sntomas de la enfermedad, incluyendo
hipertrofia del tejido afectado y muerte de clulas. Las taxotominas A y otras se producen en el
tejido del husped y en agar avena.
Las tres especies patgenas se distinguen una de otra por la produccin de pigmento, color de
micelio, forma de filamento y habilidad de usar los azucares D- glucosa, L-arabinosa, sucrosa,
D-xilosa, I-inositol, D-manitol, D-fructuosa, rafinosa, celulosa, acido galacturonico.
S.scabies. Ocurre a nivel mundial. En medio extracto de levadura y malta (YME) forma colonias
pequeas de color gris ratn. Forma cadenas de esporas en espiral. En medio agar hierro
extracto de levadura-peptona ( PYI) produce pigmento de color marrn. Utiliza todos los
azucares. El pH mnimo para crecer en medio de cultivo es 5.0
S. acidiscabies. Ha sido detectado solamente en el Nor-este de USA. En medio YME forma
colonias pequeas de color durazno (crema) en cadenas flexuosas (onduladas) y produce un
pigmento rojo en medio agar almidn con sales modificado (MSSA). Utiliza todos los azcares
excepto la rafinosa. El pH mnimo para crecer en medio de cultivo es 4.0
S.turgidiscabies. Ha sido reportado solamente en el Japn. En medio YME forma colonias
pequeas de color gris ms claro (azul / verdoso) que S. Scabies. Forma cadenas de esporas
rectiflexuosas y no produce pigmento.

2. Control

Varios tipos de sntomas pueden ser observados:

- lesiones reticulares o superficiales,
- lesiones profundas o cncavas o protuberantes.
Diferentes especies de Streptomyces pueden provocar estas variaciones de lesiones.
En general la sarna no afecta el rendimiento, solo la calidad del tubrculo, pero hay cepas que
pueden ocasionar necrosis de las races lo que puede disminuir el rendimiento.
Los suelos alcalinos , livianos (arenosos) y secos favorecen la sarna.
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1. Evitar el uso de semilla con sarna. Los variantes de Streptomyces difieren en virulencia y al
sembrar tubrculos con sarna se puede reinfectar el campo con otro variante ms agresivo.
2. Tratamientos de la semilla con captan y mancozeb reducen el nivel de inoculo en la semilla.
3. Prolongar el tiempo entre siembras sucesivas de papa (3 a 4 aos de rotacin) reduce la
incidencia de sarna a un nivel ms o menos constante, pero rara vez elimina completamente
la poblacin de patgeno en el suelo.
4. No sembrar otros hospedantes en rotacin como betarraga, nabo, rabanito, zanahoria y
perejil.
5. La siembra de alfalfa u otras leguminosas y cereales en abonos verdes reduce el inoculo del
suelo.
6. La resistencia o susceptibilidad de las variedades determinan la incidencia de la enfermedad
y el tipo de lesin. Las variedades de papa varan considerablemente en su resistencia a la
sarna, pero ninguno es inmune. Comparar sensibilidad de las variedades y sembrar un cv.
menos susceptible.
7. Mantener altos niveles de humedad en el suelo por unas 4 a 9 semanas desde el inicio de la
tuberizacin. Sin embargo este puede en unos casos favorecer la sarna que provoca el
sntoma reticulado.
8. Mantener el pH del suelo a 5-5.2 mediante fertilizantes cidos o sulfuros.
9. Evitar la aplicacin de enmiendas como cal que incrementen el pH del suelo, o usar cal
dolomtica.
10. La aplicacin de sulfato de manganeso en suelo ha sido reportada efectiva pero a niveles no
prcticos.

3. Aislamiento de Streptomyces spp, a partir de lesiones de sarna en tubrculos

de papa

1) Lavar los tubrculos de papa con agua corriente

2) Desinfectar los tubrculos con una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto
3) Enjuagar con agua destilada estril
4) Extraer el tejido color pajizo translucido que se encuentra inmediatamente debajo de la
lesin y macerar en agua destilada estril (1g/10m) en un mortero esterilizado
5) Mezclar un 1 ml del macerado con 9 ml de una solucin fenol-agua (1:140)
6) Hacer cuatro diluciones de la mezcla
7) Sembrar 50 l de cada dilucin en medio agar agua o en medio agar agua con antibiticos
con una esptula de Drigalski e incubar a 28 oC durante 7a10 das
8) Purificar los cultivos a partir de una sola colonia en medio YME e incubar a 28C durante 14
das, al cabo de los cuales se pueden observar el color de las colonias y las caractersticas
morfolgicas del patgeno
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9) Observar la produccin de melanina de color marrn en PYI o pigmento rojo en MSSA, para
lo cual sembrar por estriado una suspensin del patgeno en PYI y MSSA e incubar a 28C.

4. Pruebas de patogenicidad

Existen muchos mtodos para probar la patogenicidad de las tres especies de Streptomyces
que afectan el cultivo de la papa. Para todos los mtodos se tiene que producir esporas en
medio agar YME y contar con tubrculos semilla libre de patgenos. Para favorecer la infeccin
es necesario mantener la humedad del suelo lo ms bajo posible durante la tuberizacin.
Temperaturas de suelo sobre los 22oC favorecen el desarrollo de la enfermedad.

Mtodo de Labruyere

1) Agregar esporas del patgeno desarrolladas en medio agar YME durante 14 das, en una
placa conteniendo perlita estril saturada con una solucin nutriente (Por litro: 20 g de
sucrosa, 1.2 g L-asparagiana, 0.6 g K2HP04, 10g de extracto de levadura)
2) Incubar las placas a 28oC durante 10 a 14 das, luego mezclar una placa de perlita (con
abundante esporas y micelio) con un kilo (aproximadamente) de una mezcla suelo ( arena,
musgo y compost ) esterilizado al vapor o con arena sola.
3) Poner la mezcla de suelo o arena infestada en una bolsa de plstico (un kilo de capacidad),
a la cual previamente se le han hecho algunos huecos en la parte inferior para permitir el
drenaje, luego colocar esta bolsa dentro de una maceta de arcilla de 12.5 cm de dimetro
por 15 cm de alto. Las bolsas se deben llenar parcialmente con la mezcla de suelo o de
arena. Ajustar las bolsas dejando que sobresalgan 10 cm del nivel de las macetas para
evitar la contaminacin durante el riego.
4) Desinfectar los tubrculos semilla de papa sanos con hipoclorito de sodio al 0.5% durante
10 minutos, luego sembrar a 5 cm debajo de la superficie de la mezcla de suelo o de arena.
5) Regar las plantas crecidas en la mezcla de suelo con agua corriente y las plantas crecidas
en arena con solucin Hoagglands.
6) Reducir el riego al mnimo, cuando el dimetro de los tubrculos sea 2 veces mayor que el
dimetro del estoln para favorecer la infeccin.
7) Los tubrculos pueden verse a travs de la bolsa y el desarrollo de la enfermedad puede ser
monitoreado durante la prueba.
8) Cosechar los tubrculos a las 10 semanas despus de la siembra y evaluar la presencia de
lesiones de sarna.
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Tabla 1. Caractersticas fisiolgicas, morfolgicas y condiciones de desarrollo

para la diferenciacin de Streptomyces spp. que afectan el cultivo de la papa

Especie Forma de Color Produccin Utilizacin Temperatura

cadena de de de de de
esporas micelio pigmento azucares crecimiento
y medio
S.scabies En espiral Gris Marrn (PYI) Todos los 28-30oC
(YME) (YME) azcares (YME)

S.acidiscabies Crema Rojo (MSSA) Todos 28-30oC

Rectiflexuosas (YME) excepto la (YME)
(YME) rafinosa
S.turgidiscabie Azul / No produce Todos los 28-30oC
s Rectiflexuosas verdoso azcares (YME)
(YME) (YME)

YME = Agar extracto de levadura y malta, PYI = Agar hierro extracto de levadura-peptona,
MSSA= Agar almidn con sales modificado.
Azcares: D- glucosa, L-arabinosa, sucrosa, D-xilosa, I-inositol, D-manitol, D-fructuosa,
rafinosa, celulosa, acido galacturonico.

5. Medios de cultivo para aislamiento

Agar agua

Agar 20.0 g
Agua destilada 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin por 15 minutos.

La mayora de las especies patognicas desarrollan y esporulan en agar agua

Medio semiselectivo

Solucin stock de antibiticos 10.0 ml

Agar 20.0 g
Agua destilada 1000 ml

Agregar el agar en el agua destilada y esterilizar en autoclave a 15 libras de presin por 15

minutos. Agregar la solucin de antibiticos al medio agar antes del plaqueado.

Solucin stock de antibiticos

Agua destilada 100 ml

Nystatina 500.0 mg
Sulfato de polymixina B 50.0 mg
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Penicilina sodica (Sodium penicillin G) 10.0 mg

Cycloheximida 500.0 mg

La solucin puede ser esterilizada por filtracin y almacenada a 5oC o a 20oC durante 4
semanas.

6. Medios de cultivo para produccin de esporas y micelio

Agar extracto de levadura y malta (YME)

Extracto de levadura 4.0 g

Extracto de malta 10.0 g
Dextrosa 4.0 g
Agar 20.0 g
Agua destilada 1000 ml

Ajustar el pH a 7.0-7.2 con hidrxido de sodio antes de agregar el agar y esterilizar en autoclave
a 15 libras de presin por 15 minutos

7. Medios de cultivo para produccin de pigmento

Agar hierro extracto de levadura-peptona (PYI)

Agar hierro peptona 36.0 g

Extracto de levadura 1.0 g
Agua destilada 1000 ml

Mezclar los ingredientes y ajustar el pH a 7.0-7.2 con hidrxido de sodio o cido clorhdrico.
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin por 15 minutos

Agar almidn con sales modificado (MSSA)

Almidn soluble 10.0 g

NaN03 1.0 g
MgCO3 1.0 g
K2HP04 0.3 g
NaCl 0.5 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1000 ml

Mezclar los ingredientes y esterilizar en autoclave a 15 libras de presin por 15 minutos