Abstracts

The polymerase chain reaction (PCR) is a technique in molecular biology to amplify a single or a few
copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating thousands to millions of copies of
a particular DNA sequence. PCR is now a common and often indispensable technique used in medical and
biological research labs for a variety of applications. There are three major steps involved in the PCR
technique: denaturation, annealing and extension. PCR is useful in the investigation and diagnosis of a
growing number of diseases. PCR is also used in forensics laboratories. PCR can identify genes that have
been implicated in the development of cancer. The present paper is an attempt to review basics of PCR in
relation to its methods, application and use.
Keywords: PCR, Principles, Application, Methods, Steps

1. Introduction:
The polymerase chain reaction (PCR) is a scientific technique in molecular biology to amplify a
single or a few copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating thousands to
millions of copies of a particular DNA sequence. Polymerase Chain Reaction was developed in 1984 by
the American biochemist Kary Mullis. Progress was limited by primer synthesis and polymerase
purification issues. PCR is now a common and often indispensable technique used in medical and
biological research labs for a variety of applications. The polymerase chain reaction is a powerful
technique that has rapidly become one of the most widely used techniques in molecular biology because it
is quick, inexpensive and simple. The technique amplifies specific DNA fragments from minute quantities
of source DNA material, even when that source DNA is of relatively poor quality1 -7.
PCR is a quick and easy method for generating unlimited copies of any fragment of DNA. From
the daily practicalities of medical diagnosis to the theoretical framework of systematics, from courts of law
to field studies of animal behavior, PCR takes analysis of tiny amounts of genetic material - even damaged
genetic material to a new level of precision and reliability. Furthermore, many important contributions to
the development and application of PCR technology have been made; however the present paper is an
attempt to review basics of PCR like methods, use and applications 8 - 15.

2.1 Principle of PCR16 - 22: The basic PCR principle is simple. It is a chain reaction and one DNA
molecule is used to produce two copies, then four, then eight and so forth. This continuous doubling is
accomplished by specific proteins known as polymerases, enzymes that are able to string together
individual DNA building blocks to form long molecular strands. To do their job polymerases require a
supply of DNA building blocks, i.e. the nucleotides consisting of the four bases adenine (A), thymine (T),
cytosine (C) and guanine (G). They also need a small fragment of DNA, known as the primer, to which
they attach the building blocks as well as a longer DNA molecule to serve as a template for constructing
the new strand. If these three ingredients are supplied, the enzymes will construct exact copies of the
templates. PCR is a method used to acquire many copies of any particular strand of nucleic acids. Its a
means of selectively amplifying a particular segment of DNA. The segment may represent a small part of a
large and complex mixture of DNAs e.g. a specific exon of a human gene. It can be thought of as a
molecular photocopier. PCR can amplify a usable amount of DNA (visible by gel electrophoresis) in ~2
hours.
The template DNA need not be highly purified a boiled bacterial colony. The PCR product can be
digested with restriction enzymes, sequenced or cloned. PCR can amplify a single DNA molecule, e.g.
from a single sperm. The polymerase chain reaction relies on the ability of DNA copying enzymes to
remain stable at high temperatures. PCR has transformed the way that almost all studies requiring the
manipulation of DNA fragments may be performed as a result of its simplicity and usefulness. In Mullis's
original PCR process, the enzyme was used in vitro. The double-stranded DNA was separated into two
single strands of DNA by heating it to 96C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase
was destroyed, so that the enzyme had to be replenished with new fresh enzyme after the heating stage of
each cycle. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast
amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process.

2.2 Steps in PCR: There are three major steps involved in the PCR technique: denaturation, annealing,
and extension. In step one; the DNA is denatured at high temperatures (from 90 97 degrees Celsius). In
step two, primers anneal to the DNA template strands to prime extension. In step three, extension occurs at
the end of the annealed primers to create a complementary copy strand of DNA. This effectively doubles
the DNA quantity through the third steps in the PCR cycle. To amplify a segment of DNA using PCR, the
sample is first heated so the DNA denatures, or separates into two pieces of single-stranded DNA. Next, an
enzyme called Taq polymerase synthesizes - builds - two new strands of DNA, using the original strands as
templates. This process results in the duplication of the original DNA, with each of the new molecules
containing one old and one new strand of DNA. Then each of these strands can be used to create two new
copies, and so on, and so on. The annealing phase happens at a lower temperature, 50-60C. This allows
the primers to hybridize to their respective complementary template strands, a very useful tool to forensic
chemistry 23.
The newly-formed DNA strand of primer attached to template is then used to create identical
copies off the original template strands desired. Taq polymerase adds available nucleotides to the end of
the annealed primers. The extension of the primers by Taq polymerase occurs at approx 72C for 2-5
minutes. DNA polymerase I cannot be used to elongate the primers as one would expect because it is not
stable at the high temperatures required for PCR. The beauty of the PCR cycle and process is that it is very
fast compared to other techniques and each cycle doubles the number of copies of the desired DNA strand
24. After 25-30 cycles, whoever is performing the PCR process on a sample of DNA will have plenty of
copies of the original DNA sample to Y X conduct experimentation. Assuming the maximum amount of
time for each step, 30 cycles would only take 6 hours to complete. As the process of denaturation,
annealing, and polymerase extension is continued the primers repeatedly bind to both the original DNA
template and complementary sites in the newly synthesized strands and are extended to produce new
copies of DNA. The end result is an exponential increase in the total number of DNA fragments that
include the sequences between the PCR primers, which are finally represented at a theoretical abundance
of 2n, where n, is the number of cycles 25.
The thermo-stable properties of the DNA polymerase activity were isolated from Thermus
aquaticus (Taq) that grow in geysers of over 110C, and have contributed greatly to the yield, specificity,
automation, and utility of the polymerase chain reaction. The Taq enzyme can withstand repeated heating
to 94C and so each time the mixture is cooled to allow the oligonucleotide primers to bind the catalyst for
the extension is already present. After the last cycle, samples are usually incubated at 72C for 5 minutes to
fill in the protruding ends of newly synthesized PCR products. To ensure success, care should be taken
both in preparing the reaction mixture and setting up the cycling conditions. Increasing the cycle number
above ~35 has little positive effect because the plateau occurs when the reagents are depleted; accumulate.
The specificity of amplification depends on the extent to which the primers can recognize and bind to
sequences other than the intended target DNA sequences 26.

3. Methods:
In molecular biology, real-time polymerase chain reaction, also called quantitative real time polymerase
chain reaction is a laboratory technique based on the PCR, which is used to amplify and simultaneously
quantify a targeted DNA molecule. Traditionally, PCR is performed in a tube and when the reaction is
complete the products of the reaction (the amplified DNA fragments) are analyzed and visualized by gel
electrophoresis. However, Real-Time PCR permits the analysis of the products while the reaction is
actually in progress. This is achieved by using various fluorescent dyes which react with the amplified
product and can be measured by an instrument. This also facilitates the quantitation of the DNA.
Quantitative PCR (QPCR), as this technique is known, is used to measure the quantity of a PCR product
(usually in a real-time PCR procedure). It is the method of choice to quantitatively measure starting
amounts of DNA, cDNA or RNA. PCR is therefore often used to determine whether a DNA sequence is
present in a sample and the number of its copies in the sample 27.
Another advantage of Real-Time PCR is rapidity of the assay, since it is not necessary to perform
electrophoresis or other procedure after the DNA amplification reaction. Digital PCR concept was
conceived in 1992 by Sykes et al. It is a refinement of conventional polymerase chain reaction methods
that can be used to directly quantify and clonally amplify nucleic acids including DNA, cDNA or RNA.
The key difference between dPCR and traditional PCR lies in the method of measuring nucleic acids
amounts, with the former being a more precise method than PCR. PCR carries out one reaction per single
sample. The dPCR also carries out a single reaction within a sample, however the sample is separated into
a large number of partitions and the reaction is carried out in each partition individually. This separation
allows a more reliable collection and sensitive measurement of nucleic acid amounts. Inverse PCR is a
variant of the polymerase chain reaction that is used to amplify DNA with only one known sequence 28.
Nested polymerase chain reaction is a modification of polymerase chain reaction intended to
reduce the contamination in products due to the amplification of unexpected primer binding sites.
Touchdown polymerase chain reaction is a method of polymerase chain reaction by which primers will
avoid amplifying nonspecific sequences. The earliest steps of a touchdown polymerase chain reaction
cycle have high annealing temperatures. The annealing temperature is decreased in increments for every
subsequent set of cycles 29.

4. PCR Applications: PCR is helping in the investigation and diagnosis of a growing number of diseases.
It has also long been a standard method in all laboratories that carry out research on or with nucleic acids.
Even competing techniques such as DNA chips often require amplification of DNA by means of PCR as an
essential preliminary step. The polymerase chain reaction is used by a wide spectrum of scientists in an
ever-increasing range of scientific disciplines. The use of reverse transcriptases to evaluate RNA levels
and the extension of PCR technology to quantify DNA amplification in real time has brought major
advances to the application of PCR 30.
By allowing the determination and quantification of changes in gene expression, these techniques
have provided a greater understanding of disease processes and now serve as a foundation for diagnostics
and basic science research. In microbiology and molecular biology, for example, PCR is used in research
laboratories in DNA cloning procedures, Southern blotting, DNA sequencing, recombinant DNA
technology, to name but a few. In clinical microbiology laboratories PCR is invaluable for the diagnosis of
microbial infections and epidemiological studies. PCR is also used in forensics laboratories and is
especially useful because only a tiny amount of original DNA is required, for example, sufficient DNA can
be obtained from a droplet of blood or a single hair. In fact, a number of trials using PCR for detection of a
broad range of bacteria in CSF specimens have been reported. Since the culture of C. pneumonia is
difficult in most clinical laboratories, determination of this bacterium in clinical specimens has been
widely performed using the PCR technique even though there is no standardized PCR method for detection
of this organism. Nested PCR is one of these protocols for detection of only a few bacteria in clinical
specimens 31.
Qualitative PCR can of course be used to detect not only human genes but also genes of bacteria
and viruses. One of the most important medical applications of the classical PCR method is therefore the
detection of pathogens. Many viruses contain RNA rather than DNA. In such cases the viral genome has to
be transcribed before PCR is performed, and RTPCR is therefore used. Sometimes it is also necessary to
detect pathogens outside the body. Fortunately, the PCR method can detect the DNA of microorganisms in
any sample, whether of body fluids, foodstuffs or drinking water. Quantitative PCR provides additional
information beyond mere detection of DNA. It indicates not just whether a specific DNA segment is
present in a sample, but also how much of it is there. This information is required in a number of
applications ranging from medical diagnostic testing through target searches to basic research 32. Another
important application of quantitative PCR is in molecular diagnosis, i.e. the diagnosis of diseases based on
molecular findings rather than on physiological symptoms. In this connection the diagnosis of viral
diseases is an area that is gaining increasing importance. PCR is the most sensitive test for herpes simplex
virus, varicella-zoster virus, and human papilloma virus infections. Other diagnostic uses, including tests
for genetic diseases, cancers, and other infectious diseases, are evolving. Another important application in
which quantitative PCR is used in the field of infectious diseases is AIDS. It can detect the AIDS virus
sooner during the first few weeks after infection than the standard ELISA test. Genetic factors are always
involved in the development of cancer. Their contribution varies greatly depending on the type of cancer.
Genes not only help to determine progression of the disease but can also have a substantial influence on the
effectiveness of the available treatments. Identifying the genes that play a role in the development of
cancer is therefore an important step towards improving treatment. Both qualitative and quantitative PCR
play a crucial role in the fight against cancer. PCR can identify genes that have been implicated in the
development of cancer. There are numerous applications for real-time polymerase chain reaction in the
laboratory. It is commonly used for both basic research and is deployed as a tool to detect newly emerging
diseases, such as flu, in diagnostic tests 33.
Digital PCR has many potential applications, including the detection and quantification of
lowlevel pathogens, rare genetic sequences, copy number variations, and relative gene expression in single
cells. Clonal amplification enabled by single-step digital PCR is a key factor in reducing the time and cost
of many of the next generation sequencing methods and hence enabling personal genomics. Inverse PCR is
especially useful for the determination of insert locations. For example, various retroviruses and
transposons randomly integrate into genomic DNA. To identify the sites where they have entered, the
known, internal viral or transposon sequences can be used to design primers that will amplify a small
portion of the flanking, external genomic DNA. Nested polymerase chain reaction is a key part of many
genetics research laboratories, along with uses in DNA fingerprinting for forensics and other human
genetic cases 34.
Conventional PCR requires primers complementary to the termini of the target DNA. A commonly
occurring problem is primers binding to incorrect regions of the DNA, giving unexpected products. RT-
PCR is commonly used in studying the genomes of viruses whose genomes are composed of RNA, such as
Influenza virus A and retroviruses like HIV. PCR can be used for the diagnosis of Indian visceral
leishmaniasis with great accuracy. PCR can also be employed with significant precision to predict cure of
the disease. Molecular cloning has benefited from the emergence of PCR as a technique. Direct cloning
was first conducted using a DNA fragment amplified by PCR and oligo-nucleotide primers which
contained restriction endo-nuclease recognition sites added to their 5 ends 35.

5. Conclusion:
The advancement of science has transformed our lives in ways that would have been unpredictable just a
half-century ago. Molecular methods have shown a promise in this aspect. PCR and its applications hold
scientific and medical promise. PCR has very quickly become an essential tool for improving human
health and human life. PCR has completely revolutionized the detection of RNA and DNA viruses and is
also valuable as a confirmatory test. PCR is a rapid technique with high sensitivity and specificity. PCR
has also been credited to have been able to detect mixed infections with ease in many studies. PCR, a more
sophisticated technique, requires infrastructural support, is expensive but nevertheless, one cannot discount
its utilitarian advantages which are many compared to the existing conventional diagnostic methods.

References:
1. Grond S, Radbruch L, Meuser T, Loick G, Sabatowski R. High-dose tramadol incomparison to low-dose
morphine for cancer pain relief. Journal of pain and Symptom Management. 1999; 18: 174 79.
2. Sindrup S, Jensen T. Pharmacologic treatment of pain in poly neuropathy. Neurology. 2000; 55: 915 20.
3. National Health and Medical Research Council, Acute pain management, scientific evidence, Commonwealth
of Australia, 1999.
4. http://en.wikipedia.org/wiki/talk:Nested _ polymerase_ chain_ reaction
5. Bartlett, J. M. S., & Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction. Methods in Molecular
Biology. 2003; 226, 3 6.
6. Kleppe. Polymers. J. Mol. Biol. 1971; 56, 341 46.
7. Saiki, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of
betaglobin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985;
230 (4732): 1350 4.
8. http://en.wikipedia.org/wiki/talk:Inverse_ polymerase_ chain_ reaction
9. Erlich H.A. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications. Stockton Press, NY. 1989.
10. Gibbs R.A. DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction.Analytical Chemistry. 1990; 62: 1202
14.
11. http://www.pcrstation.com/discovery
12. Ochman, H, Gerber A, Hartl D.Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics.
1988; 120: 621 23.
13. Arnheim N, Erlich H. Polymerase Chain Reaction Strategy. Annual Review of Biochemistry. 1992; 92: 131
56.
14. Erlich H. A, Gelfand D, Sninsky J. Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction. Science. 1991; 252,
1643 51.
15. Saiki R, Gelfand H, Stoffel S, Scharf J, Higuchi R, Horn G, Mullis K, Erlich A. Primerdirected enzymatic
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988; 239 (4839): 487 91.
16. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression
analysis. Biotechniques. 2008; 44 (5): 619 26.
17.
http://web.archive.org/web/20080610163803/www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpc
r.pdf Real-Time PCR Vs. Traditional PCR
18. Sykes J, Neoh H, Brisco J, Hughes E, Condon J, Morley A. Quantitation of targets for PCR by use of
limiting dilution. Biotechniques. 1992; 13 (3): 444 9.
19. Ruoff GE. Slowing the initial titration rate of tramadol improves tolerability. Pharmacotherapy. 1999; 19:
88 93.
20. Pang WW, Huang S, Hung CP, Huang M H. Intra operative loading attenuates nausea and vomiting of
tramadol patient-controlled analgesia. Can. J. Anesth. 2000; 47: 968 73.
21. Faoud T. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician.
Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 2008; 4: 437 43.
22. Klein A, Barsuk, Dagan, Nussbaum D, Shouval, Galun E. Comparison of methods for extraction of nucleic
acid from hemolytic serum for PCR amplification of hepatitis B virus DNA sequences. J. Clin. Microbiol. 1997;
35: 1897 99.
23. Kleinschmidt-DeMasters, DeBiasi, Tyler L. Polymerase chain reaction as a diagnostic adjunct in herpes
virus infections of the nervous system. Brain Pathol. 2001; 11:452 64.
24. Layh-Schmitt, Bendl U, Hildt T, Dong-Si E. Juttler, P. Evidence for infection with Chlamydia pneumoniae in
a subgroup of patients with multiple sclerosis. Ann. Neurol. 2000; 47: 652 55.
25. Apfalter P, Blasi J, Boman C, Gaydos M, Kundi M. Multicenter comparison trial of DNA extraction methods
and PCR assays for detection of Chlamydia pneumoniae in endarterectomy specimens. J. Clin. Microbiol. 2001;
39: 519 24.
26. Budd K, Langford R. Tramadol revisitedition. Brit. J. Anaesth. 1999; 82: 493 95.
27. Wilder H, Schimke J, Osterwalder B, Senn J. Oral tramadol a -opioid agonist and monoamine reuptake-
blocker and morphine for strong cancer-related pain. Ann. Oncol.1994; 5: 141 46.
28. A C Lo, S R Feldman. Polymerase chain reaction: basic concepts and clinical applications in dermatology.
Journal of the American Academy of Dermatology. 1994; 30: 250 60.
29. Maurya, Kumar B, Salotra, Rai M. Evaluation of PCR for Diagnosis of Indian Kala-Azar and Assessment of
Cure. J Clin Microbiol. 2005; 43 (7): 3038 41.
30. Scharf S, Horn T, Erlich A. Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic
sequences. Science. 1986; 233 (4768): 1076 8.
31. Rauck RL, Ruoff GE, Mc Millen JI. Comparison of tramadol and acetaminophen with codeine for long-term
pain management in elderly patients. Current Therapeutic Research. 1994; 55: 1417 31.
32. Muller FO, Odendaal CL, Muller FR, Raubenheimer J, Middle MV. Comparison of the efficacy and
tolerability of a paracetamol/codeine fixed dose combination with tramadol in patients with refractory chronic
back pain. Arzneimittel for schung Drug Research. 1998; 48: 675 79.
33. Roth SH. Efficacy and safety of tramadol in breakthrough musculoskeletal pain attributed to osteoarthritis.
J. Rheumatol. 1998; 25: 1358 63.
34. http://en.wikipedia.org/wiki/talk:Digital_polymerase_ chain_ reaction
35. Don R, Cox P, Wainwright B, Baker K, Mattick J. Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during
gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991; 19 (14): 4008.
 Polymerase Chain Reaction
Abstrak

Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik biologi molekuler untuk memperkuat satu atau beberapa salinan
dari sepotong DNA beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu.
Sekarang PCR merupakan teknik umum dan sangat diperlukan untuk digunakan di laboratorium penelitian
medis dan biologi untuk berbagai penggunaan. Ada tiga langkah utama yang terlibat dalam teknik PCR:
denaturasi, annealing dan ekstensi. PCR berguna dalam penyelidikan dan diagnosis semakin banyak penyakit.
PCR juga digunakan dalam laboratorium forensik. PCR dapat mengidentifikasi gen yang telah terlibat dalam
perkembangan kanker. Tulisan ini merupakan upaya untuk meninjau dasar-dasar PCR dalam kaitannya dengan
metode-metode, aplikasi dan penggunaan.

Kata kunci: PCR, Prinsip, Aplikasi, Metode, Langkah

1. Perkenalan:

Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik ilmiah dalam biologi molekuler untuk memperkuat satu
atau beberapa salinan dari sepotong DNA di beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari
urutan DNA tertentu. Polymerase Chain Reaction dikembangkan pada tahun 1984 oleh ahli biokimia Amerika
Kary Mullis. Kemajuan dibatasi oleh sintesis primer dan masalah pemurnian polymerase. Sekarang PCR
merupakan teknik umum dan sering sangat diperlukan digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi
untuk berbagai penggunaan. Polymerase chain reaction adalah teknik yang kuat yang telah menjadi salah satu
teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler karena cepat, murah dan sederhana. Teknik ini
menguatkan fragmen DNA dari jumlah bahan DNA sumber, bahkan ketika itu DNA sumber berkualitas relative
rendah 1 -7.

PCR adalah metode cepat dan mudah untuk menghasilkan salinan terbatas setiap fragmen DNA. Dari
praktis sehari-hari diagnosis medis untuk kerangka teoritis sistematika, dari pengadilan ke lapangan studi
perilaku hewan, PCR membutuhkan analisis dalam jumlah kecil bahan genetik - bahkan rusak materi genetik ke
tingkat yang baru presisi dan kehandalan. Selain itu, banyak kontribusi penting untuk pengembangan dan
penerapan teknologi PCR telah dilakukan; Namun tulisan ini merupakan upaya untuk meninjau dasar-dasar
PCR seperti metode, penggunaan dan aplikasi 8-15.

2.1 Prinsip PCR 16-22: Prinsip PCR dasar sederhana. Ini adalah reaksi berantai dan satu molekul DNA
digunakan untuk menghasilkan dua salinan, kemudian empat, kemudian delapan dan sebagainya. Penggandaan
ini terus-menerus dilakukan oleh protein spesifik yang dikenal sebagai polimerase, enzim yang mampu string
bersama blok bangunan DNA individu untuk membentuk untaian molekul panjang. Untuk melakukan
polimerase pekerjaan mereka memerlukan pasokan blok bangunan DNA, yaitu nukleotida yang terdiri dari
empat basa adenin (A), timin (T), sitosin (C) dan guanin (G). Mereka juga membutuhkan sebuah fragmen kecil
dari DNA, yang dikenal sebagai primer, yang mereka melampirkan blok bangunan serta DNA molekul lebih
lama untuk melayani sebagai template untuk membangun untai baru. Jika tiga bahan ini dipasok, enzim akan
membangun salinan tepat dari template. PCR adalah metode yang digunakan untuk memperoleh banyak salinan
dari setiap untai tertentu asam nukleat. Ini adalah cara selektif memperkuat segmen tertentu dari DNA. Segmen
dapat mewakili sebagian kecil dari campuran besar dan kompleks dari DNA misalnya sebuah ekson tertentu dari
gen manusia. Hal ini dapat dianggap sebagai mesin fotokopi molekul. PCR dapat memperkuat sejumlah
digunakan DNA (terlihat dengan elektroforesis gel) di ~ 2 jam.

DNA template yang tidak perlu sangat murni koloni bakteri rebus. Produk PCR dapat dicerna dengan
enzim restriksi, sequencing atau kloning. PCR dapat memperkuat molekul DNA tunggal, misalnya dari satu
sperma. Reaksi berantai polimerase bergantung pada kemampuan enzim DNA menyalin tetap stabil pada suhu
tinggi. PCR telah mengubah cara bahwa hampir semua studi yang memerlukan manipulasi fragmen DNA dapat
dilakukan sebagai akibat dari kesederhanaan dan kegunaan. Dalam proses PCR asli Mullis ini, enzim digunakan
dalam vitro. DNA untai ganda dipisahkan menjadi dua untai tunggal DNA dengan memanaskan ke 96 C. Pada
suhu ini, bagaimanapun, polimerase E. Coli DNA dihancurkan, sehingga enzim harus diisi ulang dengan enzim
segar baru setelah tahap pemanasan setiap siklus. Proses PCR asli Mullis ini sangat tidak efisien karena
memerlukan banyak waktu, sejumlah besar DNA-Polymerase, dan perhatian terus-menerus selama proses PCR.

2.2 Langkah-langkah dalam PCR: Ada tiga langkah utama yang terlibat dalam teknik PCR: denaturasi,
annealing, dan ekstensi. Pada langkah satu; DNA didenaturasi pada suhu tinggi (90-97 derajat Celsius). Dalam
langkah kedua, primer anil untuk untai DNA template untuk ekstensi prima. Pada langkah ketiga, ekstensi
terjadi pada akhir primer anil untuk membuat salinan untai komplementer DNA. Hal ini secara efektif
menggandakan jumlah DNA melalui langkah-langkah ketiga dalam siklus PCR. Untuk memperkuat segmen
DNA menggunakan PCR, sampel pertama dipanaskan sehingga DNA denatures, atau memisahkan menjadi dua
bagian DNA untai tunggal. Selanjutnya, enzim yang disebut Taq polymerase mensintesis - membangun - dua
helai baru DNA, menggunakan untaian asli sebagai template. Proses ini menghasilkan duplikasi DNA asli,
dengan masing-masing molekul baru yang berisi lama dan satu untai baru DNA. Kemudian masing-masing dari
helai ini dapat digunakan untuk membuat dua salinan baru, dan seterusnya, dan seterusnya. Tahap anil terjadi
pada suhu yang lebih rendah, 50-60 C. Hal ini memungkinkan primer untuk berhibridisasi ke helai template
mereka masing-masing yang saling melengkapi, alat yang sangat berguna untuk forensik kimia 23.

Untai DNA yang baru terbentuk dari primer melekat template kemudian digunakan untuk membuat
salinan identik dari helai template asli yang diinginkan. Taq polymerase menambahkan nukleotida tersedia
untuk akhir primer anil. Perpanjangan primer oleh Taq polymerase terjadi pada kira-kira 72 C selama 2-5
menit. DNA polimerase I tidak dapat digunakan untuk memanjangkan primer sebagai salah satu harapkan
karena tidak stabil pada suhu tinggi yang diperlukan untuk PCR. Keindahan siklus PCR dan proses adalah
bahwa hal itu sangat cepat dibandingkan dengan teknik lain dan setiap siklus menggandakan jumlah salinan dari
untai DNA yang diinginkan 24. Setelah 25-30 siklus, siapa pun yang melakukan proses PCR pada sampel DNA
akan memiliki banyak salinan dari sampel DNA asli untuk YX perilaku eksperimen. Dengan asumsi jumlah
maksimum waktu untuk setiap langkah, 30 siklus hanya akan mengambil 6 jam untuk menyelesaikan. Sebagai
proses denaturasi, annealing, dan ekstensi polimerase dilanjutkan primer berulang kali mengikat baik yang asli
cetakan DNA dan saling melengkapi situs di untai baru disintesis dan diperluas untuk menghasilkan salinan baru
dari DNA. Hasil akhirnya adalah peningkatan eksponensial dalam jumlah fragmen DNA yang mencakup urutan
antara primer PCR, yang akhirnya diwakili pada kelimpahan teoritis 2n, dimana n, adalah jumlah siklus 25.

Sifat termo-stabil aktivitas DNA polimerase diisolasi dari Thermus aquaticus (Taq) yang tumbuh di
geyser lebih dari 110 C, dan telah memberikan kontribusi besar terhadap hasil, spesifisitas, otomatisasi, dan
utilitas dari reaksi berantai polimerase. Enzim Taq dapat menahan diulang pemanasan 94 C dan begitu setiap
kali campuran didinginkan untuk memungkinkan primer oligonukleotida untuk mengikat katalis untuk ekstensi
sudah ada. Setelah siklus terakhir, sampel biasanya diinkubasi pada 72 C selama 5 menit untuk mengisi ujung
yang menonjol dari produk PCR yang baru disintesis. Untuk memastikan keberhasilan, perawatan harus
dilakukan baik dalam mempersiapkan campuran reaksi dan menyiapkan kondisi bersepeda. Meningkatkan
jumlah siklus di atas ~ 35 memiliki efek positif sedikit karena dataran tinggi terjadi ketika reagen yang habis;
mengumpulkan. Kekhasan amplifikasi tergantung pada sejauh mana primer dapat mengenali dan mengikat
urutan selain target yang dimaksud sekuens DNA 26.

3. Metode:

Dalam biologi molekuler, real-time polymerase chain reaction, juga disebut kuantitatif real time polymerase
chain reaction adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk memperkuat dan sekaligus
mengukur molekul DNA yang ditargetkan. Secara tradisional, PCR dilakukan dalam sebuah tabung dan ketika
reaksi selesai produk dari reaksi (fragmen DNA diamplifikasi) dianalisis dan divisualisasikan dengan
elektroforesis gel. Namun, Real-Time PCR memungkinkan analisis produk sementara reaksi sebenarnya
berlangsung. Hal ini dicapai dengan menggunakan berbagai pewarna fluorescent yang bereaksi dengan produk
diperkuat dan dapat diukur dengan instrumen. Ini juga memfasilitasi kuantisasi DNA. PCR kuantitatif (qPCR),
sebagai teknik ini dikenal, digunakan untuk mengukur kuantitas produk PCR (biasanya dalam real-time
prosedur PCR). Ini adalah metode pilihan untuk mengukur secara kuantitatif jumlah awal DNA, cDNA atau
RNA. PCR karena itu sering digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah
salinan dalam sampel 27.

Keuntungan lain dari Real-Time PCR adalah kecepatan dari assay, karena itu tidak perlu untuk
melakukan elektroforesis atau prosedur lain setelah reaksi amplifikasi DNA. Konsep Digital PCR dikandung
pada tahun 1992 oleh Sykes et al. Ini merupakan penyempurnaan dari metode polymerase chain reaction
konvensional yang dapat digunakan untuk langsung mengukur dan klonal memperkuat asam nukleat termasuk
DNA, cDNA atau RNA. Perbedaan utama antara dPCR dan tradisional PCR terletak pada metode pengukuran
asam nukleat jumlah, dengan yang pertama menjadi metode yang lebih tepat daripada PCR. PCR melakukan
satu reaksi per sampel tunggal. The dPCR juga melakukan reaksi tunggal dalam sampel, namun sampel
dipisahkan menjadi sejumlah besar partisi dan reaksi dilakukan di setiap partisi secara individual. Pemisahan ini
memungkinkan koleksi lebih handal dan pengukuran sensitif dari jumlah asam nukleat. Inverse PCR adalah
varian dari reaksi berantai polimerase yang digunakan untuk memperkuat DNA dengan hanya satu urutan
dikenal 28.

Bersarang polymerase chain reaction merupakan modifikasi dari reaksi berantai polimerase
dimaksudkan untuk mengurangi kontaminasi dalam produk karena amplifikasi primer situs mengikat tak
terduga. Touchdown polymerase chain reaction adalah metode polymerase chain reaction dimana primer akan
menghindari memperkuat urutan spesifik. Langkah-langkah awal dari siklus reaksi berantai polimerase
touchdown memiliki suhu anil tinggi. Suhu pendinginan berkurang secara bertahap untuk setiap set berikutnya
dari siklus 29.

4. Aplikasi PCR: PCR membantu dalam penyelidikan dan diagnosis semakin banyak penyakit. Hal ini juga
lama menjadi metode standar di semua laboratorium yang melakukan penelitian atau dengan asam nukleat.
Bahkan bersaing teknik seperti chip DNA sering membutuhkan amplifikasi DNA dengan cara PCR sebagai
langkah awal yang penting. Polymerase chain reaction digunakan oleh spektrum yang luas dari para ilmuwan di
berbagai terus meningkat dari disiplin ilmu. Penggunaan terbalik transcriptase untuk mengevaluasi tingkat RNA
dan perluasan teknologi PCR untuk mengukur amplifikasi DNA secara real time telah membawa kemajuan
besar untuk aplikasi PCR 30.

Dengan membiarkan penentuan dan kuantifikasi perubahan dalam ekspresi gen, teknik ini telah
memberikan pemahaman yang lebih besar dari proses penyakit dan sekarang berfungsi sebagai dasar untuk
diagnostik dan penelitian ilmu dasar. Dalam mikrobiologi dan biologi molekuler, misalnya, PCR digunakan di
laboratorium penelitian dalam prosedur DNA kloning, Southern blotting, sekuensing DNA, teknologi DNA
rekombinan, untuk nama tapi beberapa. Di laboratorium mikrobiologi klinik PCR sangat berharga untuk
diagnosis infeksi mikroba dan studi epidemiologi. PCR juga digunakan dalam forensik laboratorium dan ini
sangat berguna karena hanya sejumlah kecil DNA asli diperlukan, misalnya, DNA yang cukup dapat diperoleh
dari tetesan darah atau sehelai rambut. Bahkan, sejumlah percobaan menggunakan PCR untuk mendeteksi
berbagai bakteri dalam spesimen CSF telah dilaporkan. Karena budaya C. pneumonia sulit di sebagian besar
laboratorium klinis, penentuan bakteri ini dalam spesimen klinis telah banyak dilakukan dengan menggunakan
teknik PCR meskipun tidak ada metode PCR standar untuk mendeteksi organisme ini. Bersarang PCR adalah
salah satu protokol ini untuk mendeteksi hanya beberapa bakteri dalam spesimen klinis 31.

Kualitatif PCR tentu saja dapat digunakan untuk mendeteksi tidak hanya gen manusia tetapi juga gen
dari bakteri dan virus. Oleh karena itu salah satu aplikasi medis yang paling penting dari metode PCR klasik
adalah deteksi patogen. Banyak virus mengandung RNA bukan DNA. Dalam kasus tersebut genom virus harus
ditranskripsikan sebelum PCR dilakukan, dan karena itu RTPCR digunakan. Kadang-kadang juga diperlukan
untuk mendeteksi patogen luar tubuh. Untungnya, metode PCR dapat mendeteksi DNA dari mikroorganisme
dalam sampel, apakah cairan tubuh, bahan makanan atau air minum. PCR kuantitatif memberikan informasi
tambahan di luar deteksi belaka DNA. Hal ini menunjukkan tidak hanya apakah segmen DNA tertentu hadir
dalam sampel, tetapi juga berapa banyak dari itu ada. Informasi ini diperlukan dalam sejumlah aplikasi mulai
dari tes diagnostik medis melalui pencarian target untuk penelitian dasar 32. Aplikasi lain yang penting dari
PCR kuantitatif dalam diagnosis molekuler, yaitu diagnosis penyakit berdasarkan temuan molekuler bukan pada
gejala fisiologis. Dalam hubungan ini diagnosis penyakit virus merupakan daerah yang mendapatkan pentingnya
peningkatan. PCR adalah tes yang paling sensitif untuk virus herpes simplex, virus varicella-zoster, dan infeksi
virus papiloma manusia. Kegunaan diagnostik lainnya, termasuk tes untuk penyakit genetik, kanker, dan
penyakit menular lainnya, yang berkembang. Aplikasi lain yang penting di mana kuantitatif PCR digunakan
dalam bidang penyakit menular adalah AIDS. Hal ini dapat mendeteksi virus AIDS lebih cepat selama beberapa
minggu pertama setelah infeksi daripada uji ELISA standar. Faktor genetik selalu terlibat dalam perkembangan
kanker. Kontribusi mereka sangat bervariasi tergantung pada jenis kanker. Gen tidak hanya membantu untuk
menentukan perkembangan penyakit tetapi juga dapat memiliki pengaruh besar pada efektivitas perawatan yang
tersedia. Mengidentifikasi gen yang berperan dalam perkembangan kanker karena merupakan langkah penting
dalam meningkatkan perawatan. Kualitatif dan kuantitatif PCR memainkan peran penting dalam melawan
kanker. PCR dapat mengidentifikasi gen yang telah terlibat dalam perkembangan kanker. Ada banyak aplikasi
untuk real-time PCR di laboratorium. Hal ini umumnya digunakan untuk kedua penelitian dasar dan digunakan
sebagai alat untuk mendeteksi penyakit yang baru muncul, seperti flu, dalam tes diagnostik 33.

PCR digital memiliki banyak aplikasi potensial, termasuk deteksi dan kuantifikasi patogen level
rendah, urutan genetik langka, jumlah copy variasi, dan ekspresi gen relatif dalam sel tunggal. Amplifikasi
klonal diaktifkan oleh satu langkah digital PCR merupakan faktor kunci dalam mengurangi waktu dan biaya
banyak metode generasi sekuensing berikutnya dan karenanya memungkinkan genomik pribadi. Inverse PCR
sangat berguna untuk penentuan lokasi insert. Misalnya, berbagai retrovirus dan transposon secara acak
mengintegrasikan ke dalam DNA genom. Untuk mengidentifikasi situs di mana mereka telah masuk, diketahui,
internal yang virus atau transposon urutan dapat digunakan untuk merancang primer yang akan memperkuat
sebagian kecil dari mengapit, DNA genom eksternal. Bersarang polymerase chain reaction adalah bagian
penting dari banyak laboratorium genetika penelitian, bersama dengan kegunaan dalam sidik jari DNA untuk
forensik dan kasus genetik manusia lainnya 34.

Konvensional PCR membutuhkan komplementari primer termini dari DNA target. Masalah yang sering
terjadi adalah daerah yang salah dari DNA, memberikan produk yang tak terduga. RT-PCR umumnya digunakan
dalam mempelajari genom virus yang genom terdiri dari RNA, seperti virus A Influenza dan retrovirus seperti
HIV. PCR dapat digunakan untuk diagnosis leishmaniasis visceral India dengan akurasi besar. PCR juga dapat
digunakan dengan presisi yang signifikan untuk memprediksi menyembuhkan penyakit. Kloning molekuler
telah mendapatkan manfaat dari munculnya PCR sebagai teknik. Kloning langsung pertama kali dilakukan
menggunakan fragmen DNA diamplifikasi dengan PCR dan oligo-nukleotida primer yang berisi pembatasan
situs pengakuan endo-nuklease ditambahkan ke 5 mereka 'berakhir 35.

5. Kesimpulan:

Kemajuan ilmu pengetahuan telah mengubah kehidupan kita dengan cara yang tak terduga hanya setengah abad
yang lalu. Metode molekuler telah menunjukkan aspek yang menjanjikan. Penggunaan PCR memegang
ilmiah dan medis yang menjanjikan. PCR telah menjadi alat penting untuk meningkatkan kesehatan dan
kehidupan manusia. PCR telah benar-benar berevolusi untuk deteksi virus RNA dan DNA dan juga sebagai tes
konfirmasi. PCR adalah teknik yang cepat dengan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. PCR juga telah
mampu mendeteksi infeksi campuran dengan mudah dalam banyak penelitian. Teknik PCR yang lebih canggih,
memerlukan dukungan infrastruktur, namun mahal, seseorang tidak dapat keuntungan utilitarian yang banyak
dibandingkan dengan metode diagnostik konvensional yang ada.