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ISSN: 1390-7573
RESUMEN ABSTRACT
Antecedentes y Objetivo.- La leishmanio- Leishmaniasis is a parasitic disease endemic
sis es una enfermedad parasitaria endmica de in tropical and subtropical countries and affects
pases ubicados en el rea tropical y subtropical; the skin, mucosa and certain viscera. The diag-
que afecta a la piel, mucosa y ciertas vsceras. nosis of cutaneous / mucosal Leishmaniasis tradi-
En el Ecuador, el diagnstico de Leishmaniosis tionally includes identification of amastigote of
cutnea/mucosas tradicionalmente incluye la Leishmania by direct microscopy and promasti-
identificacin de amastigotes de Leishmania por gote growth in culture, which are the two tech-
microscopia directa y el crecimiento de promas- niques performed routinely in Ecuador. The aim
tigotes en cultivos, mientras que la PCR es una of this study was to compare the sensitivity of
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Caicedo et al., 2016; Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente a otras tecnicas de Laboratorio utilizadas para el diagnstico de
Leishmaniosis Cutnea en Ecuador
tcnica que no se utiliza. El presente trabajo these three methods : microscopy, culture and
tuvo como objetivo comparar el nivel de sen- PCR to detect Leishmania in 23 samples of skin
sibilidad de deteccin de esta tcnica frente a ulcers . The microscopy detected 21 positive
la microscopia y cultivo en muestras sospechas samples, 10 by culture and 16 by PCR.
de leishmaniosis cutnea de pacientes ecuato-
rianos. Materiales y mtodos.- Se examinaron
23 muestras provenientes de lceras de piel
sospechosas de leishmaniosis por 3 tcnicas de
laboratorio: Microscopa, cultivo y PCR. Resulta-
dos.- La microscopa detect 21 muestras positi-
vas, el cultivo 10 y la PCR 16. Conclusiones.- Este
trabajo nos permite concluir que la PCR no es la
tcnica ms sensible para la deteccin del par-
sito Leishmania.
Palabras clave: Cultivo, leishmaniosis cutnea, microscopa, Keywords: Culture, cutaneous Leishmaniasis, microscopy,
PCR PCR
INTRODUCCIN
La Leishmania es un parsito que pertene- profundidad. Pueden adems aparecer lesiones
ce al orden Kineplastida, familia Trypanosoma- satlites que pueden unirse a la inicial, y dan lu-
tidae, es el agente causal de la leishmaniosis o gar a una gran ulceracin. La lcera caracters-
Leishmaniasis (Ryan y Ray, 2004), cuyas formas tica es generalmente redondeada, indolora, con
clnicas comprenden una forma visceral, cut- bordes bien definidos y cortados en forma de
nea y mucocutnea. La leishmaniosis es una sacabocado; este borde es hipermico, levanta-
enfermedad transmitida por la picadura de un do e indurado (Botero y Restrepo, 1992).
mosquito del gnero Lutzomyia, que mide de La leishmaniosis tegumentaria es prevalen-
1,5 2 mm de tamao y que en algunas zonas de te en 88 pases y se estima que 350 millones
pases sudamericanos se conoce con el nombre de personas estn en riesgo. La incidencia es
de manta blanca (Botero y Restrepo, 1992). de 1.5 millones de casos de leishmaniosis cut-
Despus de la picadura en la piel por el mosqui- nea por ao. El 90% de los casos son reportados
to infectado, existe un perodo de incubacin en frica, el Medio Oriente y en Amrica Lati-
que vara entre dos semanas a dos meses o ms na; primordialmente Brasil, Bolivia, Colombia,
(Salazar et al., 2001), presentndose en el rea Ecuador, Per y Venezuela (Desjeux et al. 2004;
afecta una pequea lesin inicial con aspecto Murray et al., 2005).
de ppula eritematosa de unos 3 mm, un ndu-
lo o una simple induracin que puede ser nica En el nuevo mundo, la leishmaniasis cu-
o mltiple. Despus de varios das esta lesin tnea, visceral y mucocutnea son endmicas
inicial se ulcera espontneamente y se recu- en varios pases del Centro y Sur de Amrica,
bre de un lquido amarillento y adherente, que constituyndose en un problema significativo
posteriormente da lugar a la costra. Debajo de de salud pblica. En Ecuador, el primer caso re-
esta costra la lesin se extiende en superficie y portado fue en el ao de 1920, en la provincia
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de Esmeraldas, mientras que la primera caracte- una alternativa ms sensible y especifica frente
rizacin a nivel de zimodemo y serodemo de los a los mtodos tradicionales actualmente en uso
parsitos de la leishmaniasis, aislados de huma- (de Vries et al., 2015)
nos, animales reservorios y del insecto vector La PCR, sera una buena opcin ya que los
se realiz en 1989 (Mimori et al., 1989). mtodos convencionales de diagnstico para-
El Ecuador se considera una regin en- sitolgicos no son suficientemente sensibles
dmica de Leishmaniosis ya que se encuentra (Bensoussan E, 2006). Ciertos autores han su-
en 22 de 24 provincias (Guinara, 2014). Se ha gerido la combinacin de tcnicas para obtener
confirmado la existencia de varias especies de un diagnstico ms certero, como por ejemplo
Leishmania como son L. (V) guyanensis, L. (V) el frotis de la lesin con el aislamiento de mate-
panamensis y L. (V) brasiliensis, L. (L.) mexica- rial gentico y la Reaccin en Cadena de la Poli-
na, L. (L.) amazonensis, L (V) equatoriensis y L merasa (PCR) (Bonifaz et al., 2011).
(L) major-like. (Calvopina et al., 2004, Weigel et El objetivo de este estudio es establecer la
al., 1994; Fernndez et al., 2012). Segn el Pro- sensibilidad de la tcnica de PCR como tcnica
grama Nacional de Leishmaniasis en Ecuador, alternativa frente al examen directo (tcnica de
durante el periodo 2010 al 2014, se reportaron referencia) y al cultivo, tcnicas actualmente en
6.608 casos de leishmaniasis al Ministerio de uso, con el fin de establecer las ventajas de esta
Salud Pblica del Ecuador tcnica en cuanto a sensibilidad para el diag-
El diagnstico definitivo de leishmaniosis nstico de leishmaniosis cutnea
requiere la demostracin de la presencia del
parsito Leishmania s en el frotis obtenido de MATERIALES Y MTODOS
las lesiones teido con Wright, en el estado de
amastigotes en los cultivos en el estado de pro- Muestras.- Se analizaron 23 muestras to-
mastigote (Arechavala, 2010), o bien la deteccion madas por tcnicos del Laboratorio de Parasito-
del DNA. La examinacin por microscopa es loga del Instituto Nacional de Investigacin en
econmica, rpida pero de limitada sensibilidad, Salud Pblica (INSPI), Provenientes pacientes de
mientras que los cultivos son sensibles a la con- zonas endmicas y de pacientes que visitaban el
taminacin microbiolgica (Arechavala, 2010). Laboratorio de Parasitologa. Las muestras de-
Como en toda enfermedad infecciosa es impor- ban ser tomadas del sitio de la lesin, la misma
tante identificar al agente etiolgico y as, admi- que deba estar limpia, libre de crema, polvo y/o
nistrar al paciente un tratamiento adecuado. ungento.
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Leishmaniosis Cutnea en Ecuador
cul la muestra en medio de cultivo Novy, Mc- molecular de 100pb (Invitrogen, Carlsbad, USA)
Neal, Nicolle (NNN) y a temperatura ambiente y fueron foto documentados usando el transilu-
del laboratorio +/-22C. Fueron observados por minador Molecular Imager Chemidoc XRS (Bio
lo menos vez por semana en busca de promas- Rad, Hercules, California, USA). El producto de
tigotes que es una forma alargada, flagelada de amplificacin esperado es una region conserva-
14 a 20 micras de largo, nucleada y con kineto- da del Kinetoplasto del parasito de 120pb.
plasto en forma de barra Anlisis de datos.- Se compar los resulta-
PCR.- Para realizar la PCR luego de realizar dos positivos obtenidos en cada tcnica utilizan-
un raspado de la ulcera para obtener el frotis, do anlisis porcentual simple. Los datos sern
se realiz una impronta de la lesin en papel fil- ingresados en una base de datos de Microsoft
tro FTA, se dej secar a temperatura ambiente y Excel y analizados mediante estadstica simple e
posteriormente el papel filtro fue almacenado a inferencial. Usando el programa Epi Info 7. Los re-
4C hasta realizar el paso de extraccin. sultados sern expresados en porcentajes
Extraccin de ADN.- Para la extraccin de
ADN se utiliz el kit comercial (Qiamp DNA
RESULTADOS
Blood Mini kit- QIAGEN, Venlo, Netherlands ) Se La sensibilidad de estos mtodos en el
utiliz el papel filtro FTA y se sigui las instruc- diagnstico de leishmaniosis cutnea se ve
ciones del fabricante. El ADN extrado fue con- afectada por varios factores como la cantidad
servado a -80C hasta su posterior uso. de nmero de muestras a analizar, el personal
PCR.- La reaccin de amplificacin fue rea- quien toma la muestra, el lugar de la lesin del
lizada en un termociclador S1000 Thermal Cy- cual se toma la muestra (centro o borde de la
cler with Dual 48/48 Fast Reaction Module (Bio lesin), la experticia del tcnico de laboratorio
Rad, Hercules, California, USA) . El volumen de que la analiza y la calidad de los reactivos utili-
reaccin fue de 50 ul conteniendo 5uL del Ta- zados (Arechavala, 2010).
pon 10X; 3uL de Cl2Mg (50mM); 5uL de dNTPs La observacin del parsito ya sea como
(2mM); 1uL de cada primer (100ng/uL) HM1(5'- amastigote en el frotis, como promastigote en
CCG CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC-3', HM2 el cultivo o la observacin del DNA parasitario
(5'- GGG GAG GGG GCG TTC TGC GAA -3'), HM3 visto como la presencia de una banda de 120pb
(5'- GGC CCA CTA TAT TAC ACC AAC CCC -3') pre- en el gel de agarosa. (figura 1), confirman la in-
viamente descritos (Leite et al. 2010); 0,2uL de feccin con el parsito Leishmania spp.
Taq-Polimerasa (5U/ul); 5ul de ADN previamente
extrado, y agua hasta completar el volumen.
Las muestras fueron sometidas a un ciclo de
desnaturalizacin de 15min a 94C; seguido por
30 ciclos: 30seg a 94C (Desnaturalizacin), 30seg
a 50C (hibridacin), 30seg a 72C (extensin) y un
periodo de elongacin final de 10min a 72C.
Electroforesis.- Los productos de amplifica-
cin fueron migrados en geles de agarosa al 2 % Amastigotes de
conteniendo SYBR safe (life technologies, Car- lesihmania en
el interior de un
lsbad, CA, USA) utilizando un marcador de peso macrofago
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Examen directo, frotis de lesion Promastigotes de Lesihmania Raspado de ulcera, obtencin de frotis
provenientes de cultivo para realizar la tincin
Obtencion de muestras para el cultivo Inoculacion de la muestra en tubos Impronta de lesion en papel filtro
con medio NNN
Tarjetas de papel
filtro con la
identificacion del
paciente
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do con Ros Yuil y Yuil de Ros (2010) consideran del parsito por el examen microscpico de fro-
que un microscopista entrenado debe evaluar, tis teido con Giemsa es el "estndar de oro"
por lo menos, dos frotis por 1 hora; a pesar de en el diagnstico de la leishmaniosis, ya que
esto, puede haber falsos negativos. Entre las es altamente especfico. Sin embargo, autores
ventajas del uso del frotis se pueden mencio- como Calvopina et al. 2004 consideran que en
nar: bajo costo, relativa facilidad para la realiza- los laboratorios de las reas endmicas de Ecua-
cin, rapidez en la obtencin del resultado y no dor hay muchos falsos positivos que podran ser
requerir un laboratorio con equipo sofisticado. debido a personal no capacitado.
La sensibilidad de esta prueba aumenta del En este estudio pudimos observar que la
40 al 80 % dependiendo s se toma una muestra sensibilidad del frotis de lesin sospechosa de
o cuatro muestras de la lesin para el examen Leishmania fue del 91% (21/23), este resultado
microscpico. es muy similar al referido en la revisin realiza-
Ros Yuil y Yuil de Ros (2010) manifestaron da por Ros Yuil y Yuil de Ros (2010) (90%) pero
que cuando se toma la muestra del borde de difiere al encontrado por Calvopina et al., 2004
la lcera para observacin microscpica se ob- (45%), a pesar de que este estudio fue realizado
tiene una sensibilidad del 78,3 %; sin embargo, en muestras de pacientes ecuatorianos. Dicha
cuando la muestra es tomada del fondo de la discrepancia podra deberse a factores mencio-
lcera, la sensibilidad aumenta a un 90,4 %. Es nados por Ros Yuil y Yuil de Ros (2010), Calvopi-
por esto que, entre las recomendaciones para na et al. (2004); Desjeux et al. (2004), entre otros.
la realizacin de un buen examen directo, se
incluyen la toma de muestras tanto del borde
como del fondo de la lcera. La identificacin
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Figura 3. Sensibilidad de deteccin del parsito Leishmania por medio del frotis, segn
diferentes investigadores: Calvopina 45%; Ros 90%; INSPI 91%
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Figura 4. Sensibilidad de deteccin del parsito Leishmania por mtodo de cultivo segn
diferentes investigadores: Calvopina 57%; Ros 67%; INSPI 43%
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Figura 6: Sensibilidad de deteccin por PCR del parsito Leishmania segn diferentes
investigadores: Calvopina 85%; Ros 89%; INSPI 70%
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Caicedo et al., 2016; Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente a otras tecnicas de Laboratorio utilizadas para el diagnstico de
Leishmaniosis Cutnea en Ecuador
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Dra Aracelly Alava Alprech
por permitir participar en el proyecto SENACYT
PIC-08-IZP-00001 Desarrollo de los diagnsticos
basados en Biologa Molecular de las Principales
Enfermedades Infecciosas de Importancia en Sa-
lud Pblica: al Dr. Luigi Martini, Dr. Luis Fernando
Solrzano y al personal del Laboratorio de Para-
sitologa por el apoyo brindado durante la ejecu-
cin de este proyecto; al personal de Concepto
Azul por contribuir a mi formacin profesional y
a mis padres por estar siempre conmigo.
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