Desarrollo de un mtodo para la fermentacin directa de smola por bacterias de cido lctico

Tradicionalmente la harina usada para la fabricacin de pan es la harina blanda. Al sur de Italia se
usa trigo duro o smola y tiene una fabricacin tradicional de ms de 6 siglos de antigedad.

Las cepas usadas por lo general son Lactobacillus sanfranciscensis, Leuconostoc y Weissella

La variabilidad de las cepas dominantes se refleja en una reproducibilidad limitada de las

caractersticas finales de una tipologa de pan dada. Cuando se aade un cultivo de arranque a un
ecosistema de masa fermentada, es importante asegurar su estabilidad con el tiempo, para
garantizar una cierta reproducibilidad de las caractersticas del pan resultante. Por esta razn, en
este estudio se ha desarrollado un nuevo mtodo para la preparacin del cultivo inicial para la
produccin de masa fermentada. El mtodo innovador se basa en la adicin diaria de un inculo
lquido directo a la smola. La metodologa fue validada con varias semolinas de genotipos
antiguos y modernos de trigo duro cultivado en Sicilia.

1. Cepas de arranque

En este estudio, se utilizaron tres cepas obligatoriamente heterofermentativas LAB (Lactobacillus

sanfranciscensis PON100336, Leuconostoc citreum PON10079 y Weissella cibaria PON10030) como
un cultivo de iniciacin multi-especies para la produccin de masa fermentada. Las cepas fueron
previamente aisladas de semillas de trigo producidas a partir de trigos duros cultivados en Sicilia.
Las cepas Ln. Citreum PON10079 y W. cibaria PON10030 se propagaron durante la noche a 30C en
caldo modificado de Man-Rogosa-Sharpe (A menudo abreviado a MRS , este tipo de medio de
crecimiento bacteriano es as llamado por sus inventores: de Man , Rogosa y Sharpe . Desarrollado
en 1960, este medio fue diseado para favorecer el crecimiento exuberante de Lactobacilos para el
estudio de laboratorio), aadido con maltosa y extracto de levadura fresco a la concentracin final
de 1% y 10%, respectivamente, y se ajustaron a pH 5,6 con cido lctico 5M, mientras que Lb.
Sanfranciscensis PON100336 se propag durante la noche a 30 C en caldo de Bacterias de Pasta
Sourosa (SDB) preparado como se describe por Kline y Sugihara (1971).

2. Preparacin y propagacin del inculo lquido

Cada cultivo de caldo para la preparacin del iniciador de cepa multi-especies se cultiv durante la
noche en las condiciones ptimas, se centrifug a 5000 x g durante 5 minutos y se lav dos veces
en solucin de Ringer (solucin hecha a base de sales inorgnicas; NaCl, KCl, CaCl 2, Lactato de
sodio) antes de volver a suspender a la Valor 1,00 de densidad ptica a 600 nm utilizando el
espectrofotmetro 6400.

El iniciador multi-especies se prepar en forma de cultivo lquido. Con este propsito, el caldo de
extracto de semolina estril (SSE) se prepar en suspendieron de 200 g de smola comercial en 1 L
de H2O destilada, se esterilizaron en autoclave a 121C durante 20 minutos y, despus de la
precipitacin y eliminacin de los componentes slidos de la smola, se ajustaron a pH 5,6 con
cido lctico filtrado (0,5 M). Las clulas lavadas de las tres cepas se transfirieron conjuntamente
en 10 mL de SSE a la concentracin final de 106 UFC / mL para preparar el primer inculo. Despus
del desarrollo a 30 C durante 24 h, el cultivo de caldo mixto se us para preparar un segundo
inculo (1% v / v) en SSE que se dej fermentar durante 24 h. Siguiendo este procedimiento, la
propagacin del cultivo de caldo se produjo durante otros 13 d para un total de 15 inculos
consecutivos. En cada etapa de preparacin y propagacin, el inculo lquido se someti a la
medicin del pH, ya los recuentos de placas efectuados despus de las diluciones decimales en La
solucin de Ringer, sobre agar mMRS y SDB (1,5%, p / v) se incub a 30 C durante 48 h.

Los aislados de las diluciones ms altas de los caldos lquidos fermentados se recogieron al azar y
se sometieron a extraccin de ADN realizada con el kit InstaGene Matrix siguiendo las
instrucciones del fabricante. Los ADN se analizaron mediante la tcnica de ADN polimrfico
amplificado aleatoriamente (RAPD) -PCR con el cebador M13. Los productos de PCR se separaron
en geles de agarosa al 1,5% (p / v) teidos con la tincin de gel de ADN seguro SYBR (sondas
moleculares) y se adquirieron con trans-iluminacin UV. La comparacin de los patrones RAPD
resultantes del ADN de los aislados con los de las cepas iniciadoras se realiz con el software
GelCompar II versin 6.5. Con el fin de confirmar inequvocamente las especies de las cepas
dominantes los aislamientos fueron procesados por la especie especfica de PCR para cada Lb.

3. Produccin de Sourdough

Con el fin de evaluar la eficacia de la adicin de inculo lquido directo a diferentes semolinas para
producir panes de masa fermentada (Figura 1), se ensayaron individualmente varios genotipos.
El estudio incluy la semolina de cinco genotipos modernos y diez antiguos cultivados en campos
experimentales adyacentes (6 m 50 m) en la finca "Pietranera" (37 30 'N, 13 31' E, 178 m de
altitud ), Ubicado en Santo Stefano di Quisquina (AG, Italia). La semolina comercial usada para
evaluar la estabilidad del inculo lquido se us como control. La semolina se us para preparar las
SSE, las cuales fueron inoculadas con las tres cepas iniciadoras a 106 CFU / mL segn se inform
anteriormente. En la quinta etapa de propagacin en SSE, se utilizaron los 16 inoculos lquidos para
la adicin directa a semolina. Los inculos tambin se analizaron por conteo de placas y las
colonias se sometieron a comparacin de perfiles RAPD y PCRs especficas de especies como se
inform anteriormente.

Las pastas (300 g) se prepararon con un rendimiento de masa (peso de la masa / peso de la
semolina 100) de 160 en 1 L de vidrio estril bajo una campana laminar de flujo. Cada semolina
(187,5 g) se inocul con la suspensin microbiana (112,5 ml) de la correspondiente SSE fermentada
diluida en agua estril H2O hasta aproximadamente 106 UFC / g de inculo de cultivo de arranque
y se mezcl manualmente mediante una cuchara estril. Despus de mezclar, cada pasta se dividi
en dos alcuotas; 200 g se dejaron en becker y se cubrieron con parafilm y los restantes 100 g se
transfirieron a una bandeja de metal (vase el prrafo 2.6 para las caractersticas) cubierta con
papel de aluminio. Las masas se incubaron a 30 C durante 8 h. Los ensayos se realizaron por
duplicado y se repitieron despus de dos semanas.

4. Anlisis de las levaduras

La acidificacin de las levaduras (10 g) mantenidas en beckers fue seguida por la medicin del pH,
realizada con 10 g de muestra, recogida aspticamente, mediante inmersin directa de la sonda de
pH-medidor, y acidez total titulable (TTA), determinada por titulacin con NaOH 0,1 N. TTA se
evalu en los mismos 10 g de masa utilizada para la determinacin del pH, que se homogeneizaron
en H2O destilada (90 ml) durante 2 min a la velocidad ms alta. Las muestras se analizaron a T 0 ya
intervalos de 2 h hasta 8 h y los resultados de TTA se expresaron en trminos de mL de NaOH / 10
g de masa fermentada.

Las concentraciones de cido lctico y actico y, en consecuencia, el cociente de fermentacin (FQ,

relacin molar cido lctico / cido actico) de cada masa madre se determinaron a T 0 y al final de
la fermentacin. Las determinaciones qumicas se llevaron a cabo por cromatografa lquida de alto
rendimiento en muestras de masa fermentada (10 g) homogeneizadas con H2O destilada (90 ml.
Los datos se adquirieron y procesaron con el software PerkinElmer especfico del instrumento
HPLC .

Las 16 levaduras tambin fueron investigadas microbiolgicamente por el conteo de placas justo
despus de mezclar la semolina con el inculo bacteriano (T 0) y despus de 8 h de fermentacin.
Se suspendieron 10 gramos de cada muestra en 90 ml de solucin de Ringer, se homogeneizaron
mediante stomacher como se ha indicado anteriormente y se diluyeron en serie. Se inocularon
icroorganismos mesfilos totales (TMM) en agar de conteo de placa (PCA), incubados
aerbicamente a 30 C durante 72 h. LAB se sembraron en agar SBD y agar mMRS, se incubaron
aerbicamente y anaerobicamente, respectivamente, a 30 C durante 48 h. Las levaduras se
sembraron en agar de levadura de dextrosa de patata (YPD), se incubaron aerbicamente a 25 C
durante 72 h. Las muestras de smola (10 g) tambin se analizaron microbiolgicamente como se
inform para las levaduras. El LAB dominante tambin se identific a nivel de cepa y especie como
se inform anteriormente.

5. Fabricacin y anlisis de pan

Despus de la preparacin, se transfirieron 100 g de cada masa a las cacerolas rectangulares de

acero inoxidable de las dimensiones indicada por el mtodo 10-10B del American Association of
Cereal Chemists (AACC, 2000) y se ferment durante 8 h a 30 C. Las albminas resultantes se
hornearon en el horno industrial Air-osteam aplicando el siguiente programa de horneado en 3
etapas: 1 min a 190C;

8 min a 180 C con 70% de humedad relativa (HR); 10 min a 185 C con 20% de HR.

Los panes se enfriaron a temperatura ambiente antes del anlisis. Los panes fueron ponderados
primero para determinar la prdida de peso y luego cortar transversalmente en dos mitades largas
de aproximadamente 6 cm. La altura de los panes se midi en los cortes centrales. Se utiliz el
Chroma Meter CR-400 para la determinacin del color por los parmetros de la escala de Hunter
(L*, a* y b*) medidos en corteza (cuatro puntos) y miga de los trozos centrales (tres puntos).

Los dos cortes centrales de cada barra fueron sometidos al anlisis de imagen para calcular la
fraccin de vaco (la fraccin del rea total correspondiente a los poros del pan), la densidad
celular (nmero de clulas / cm2) y el rea media de las clulas (en mm2). Las imgenes fueron
escaneadas con 350 dpi de resolucin, guardadas en formato TIFF, analizadas con el software
ImageJ recortadas a un cuadrado de 207 207 pxeles (representando 15 15 mm de la rebanada)
y convertido a imagen de nivel de gris (8 bits). La tcnica de aislamiento de microextraccin en fase
slida (SPME) se aplic para determinar los compuestos orgnicos voltiles (COV) emitidos por los
panes. Cada muestra de pan (5 g) se calent a 60 C en un vial para generar un espacio de cabeza
que se recogi durante 40 min a travs de las fibras DBVCarboxen-PDMS. Todas las
determinaciones sobre panes se realizaron por triplicado.

6. Anlisis sensorial

Los panes finales fueron sometidos al anlisis sensorial realizado por un panel descriptivo
compuesto por 11 catadores, familiarizados con el anlisis sensorial de los alimentos, pero no
especficamente entrenados en la evaluacin de masa fermentada de panes. El panel fue
capacitado para el anlisis de color de la corteza, el grosor de la corteza, el color de la miga, la
porosidad, la alveolacin, la uniformidad de la alveolacin, la intensidad del olor, Olor
desagradable, aroma desagradable, aroma de pan, aroma de levadura, aroma de levadura, aroma
desagradable, salado, cido, amargo, persistencia de sabor, adhesividad en la boca, crocante y
evaluacin general.

7. Anlisis estadsticos y exploratorios multivariados

Los datos qumicos, fsicos y microbiolgicos se analizaron con el modelo lineal ANOVA segn un
diseo de medidas repetidas que inclua los efectos de la smola como medidas repetidas. La
comparacin entre las medias LS se realiz mediante la prueba de Tukey; Las diferencias se
consideraron significativas a P <0,05.

Con el fin de representar grficamente los valores de COVs, se realiz un anlisis agrupado de
mapa trmico, basado en un doble dendrograma jerrquico con diagrama de mapa de calor. Los
valores relativos de los COV se representaron por intensidad de color de amarillo (concentracin
ms baja) a rojo (concentracin ms alta). El anlisis del mapa de calor de los niveles voltiles se
realiz utilizando los datos de escala automtica. La construccin grfica se logr utilizando la
versin de software XLStat 2014.5.03.

Para investigar mejor la relacin entre los datos obtenidos de los panes producidos con la
semolina, se realiz un anlisis exploratorio multivariante. Se realiz un anlisis de agrupamiento
jerrquico (agrupamiento, agrupacin de rboles) para agrupar los ensayos segn su similitud,
medido por distancias euclidianas, mientras que la agregacin de racimos se bas en el mtodo de
enlace nico. Las diferentes producciones se agruparon por anlisis de componentes principales
(PCA). La matriz de entrada usada para HCA y PCA consisti en los valores de las mediciones (23
variables) realizadas sobre las levaduras y panes, excepto los datos de evaluacin sensorial. El
nmero de factores principales se seleccion de acuerdo con el criterio de Kaiser y slo los factores
con valores propios superiores a 1,00 se mantuvieron. Todos los datos se evaluaron
preliminarmente utilizando la prueba de esfericidad de Barlett para verificar la diferencia
estadsticamente significativa entre las muestras dentro de cada conjunto de datos. XLStat versin
de software 2014.5.03 para excel se utiliz para el procesamiento de datos y la construccin
grfica.

Referencia:

A, Alfonzo., V, Urso., O, Corona., N, Francesca., G, Amato., L, Settanni. & G, Di Miceli. (2016).

Development of a method for the direct fermentation of semolina by selected sourdough lactic
acid bacteria. International Journal of Food Microbiology. S0168-1605(16)30320-8.