GUIA DE MICROBIOLOGIA Y 2014

PARASITOLOGIA ALIMENTARIA

Practico N 05
Recuento de Coliformes Totales
1. Introduccin

La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a

estos microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios
o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y
gas, aunque algunos pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores,
como Citrobacter y Serratia, respectivamente.

La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto

digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en
las heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante
en la materia fecal, los coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la
microbiologa de alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas.

Como los coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue

entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta prctica se refiere a
coliformes totales.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la
fabricacin delos alimentos.
La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su
presencian no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los
coliformes son de origen no-fecal.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el
equipo.
La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las
diferentes reas del procesamiento de alimentos.

La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas
selectivas o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-
rojo violeta (ABRV).

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2. FUNDAMENTO

Violet Red Bilis Agar (VRBA) tambin conocido como Agar Rojo Neutro Cristal
Violeta (RNCV), se utiliza en la enumeracin de coliformes. Contiene peptona
como fuente de carbono y nitrgeno. Extracto de levadura como fuente de
complejo vitamnico B, el cual estimula el crecimiento bacteriano. Las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de Gram positivos. Lactosa
como fuente de carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH.

Los organismos fermentadores de lactosa, como los coliformes crecen

formando colonias rojas con sin zona de precipitacin, en cambio los no
fermentadores de lactosa se desarrollan formando colonias incoloras a
transparentes con sin zona de precipitacin.

Para la confirmacin de coliformes se debe traspasar colonias aisladas a Caldo

Bilis Verde Brillante.

2.1 Glosario
Coliforme
El grupo coliformes incluye bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando cido y gas
dentro de 48 horas a 35C. Este grupo incluye a los gneros: Escherichia,
Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter

3. Material y Mtodo

Incubadora a 35 1C
Propipeta
Asa calibrada
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.
Placas Petri de 100 mm de dimetro
Tubos de fermentacin de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm
Asa de 3 mm de dimetro
Propipeta

3.1 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)
Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)
Agua de dilucin Butterfiel.
Agua peptonada 0,1%
Reactivos Tincin de Gram

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4 DESARROLLO

4.1 TEST PRESUNTIVO

Preparar la muestra y diluciones, segn procedimiento procesamiento de

las muestras de alimentos y agua para anlisis microbiolgico, utilizando
agua de dilucin Butterfiel.
Sembrar 2 diluciones en duplicado de la muestra, en profundidad con
agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV). Inocular 4 placas Petri, dos con
1 ml. de la dilucin 10-1 y dos con 1 ml. de la dilucin 10 -2.
Verter en cada placa 10 ml. de agar RNCV temperado a 48 C.
Mover las placas con movimientos rotatorios, para mezclar la muestra y
el medio de cultivo.
Cuando el agar este solidificado agregar aproximadamente 5 ml. de agar
RNCV temperado, sobre la superficie del agar, formando una capa
superficial para prevenir el crecimiento invasivo.
Dejar solidificar el agar, e incubar las placas invertidas a 35 1C
durante 18 a 24 hrs. En alimentos lcteos incubar a 32 C.

Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli

como control positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se
debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incluir tubos
de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los
medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de
ambiente.
Al trmino del perodo de incubacin, seleccionar la dilucin cuyas placas
contengan entre 25 y 250 colonias, contar las colonias sospechosas tanto
tpicas como atpicas y registrar el resultado multiplicando el nmero de
colonias por la dilucin correspondiente en el Registro de resultados
anlisis de coliformes, E. coli y Salmonella en muestras de alimentos.

1. Colonias tpicas: lactosa positivo, de color rojo intenso, con zona de

precipitado de cidos biliares, dimetro de 0,5 mm o mayor.
2. Colonias atpicas: pueden ser de color rosado, amarillento o caf
claro, con o sin precipitado.

Anotar los resultados de los cultivos control, de la esterilidad de los

medios y los controles ambiente.

TEST CONFIRMATIVO PARA GRUPO COLIFORMES

Seleccionar por lo menos 10 colonias sospechosas e inocular en caldo

BVB conteniendo tubo de fermentacin.
Incubar los tubos de caldo BVB a 35 1C. Examinar los tubos por
produccin de gas a las 24 y 48 horas. Incluir como control positivo una
cepa de E coli y como control negativo una cepa de Staphylococcus
aureus. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la
esterilidad de los medios de cultivo.

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Al trmino del perodo de incubacin observar la formacin de gas en los

tubos de fermentacin. Registrar como positivo aquellos tubos que
presenten gas, la ausencia de gas es considerado un test negativo en el
Registro de resultados anlisis de coliformes, E. coli y Salmonella en
muestras de alimentos y los resultados de las cepas control y de la
esterilidad de los medios.

Se considera positivo cuando al menos un tubo presenta gas, y como negativo

cuando en ningn tubo se observa gas.

Nota: Si los tubos de caldo BVB muestran una pelcula realizar tincin Gram
para asegurar que la produccin de

5. CALCULO

Cuando todas las colonias sometidas a confirmacin dan un resultado positivo,

significa que el recuento presuntivo fue confirmado totalmente, si solo algunas
colonias resultan positivas, es necesario calcular el recuento de coliformes
totales, de la siguiente forma:

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