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INTRODUCCIN
Las enzimas se encuentran en todos los seres vivos y son piezas esenciales en su
funcionamiento. Desde el punto de vista bioqumico son protenas que actan como
aceleradores de las reacciones qumicas, de sntesis y degradacin de compuestos. Una de las
caractersticas ms sobresalientes de las enzimas es su elevada especificidad. Esto quiere decir
que cada tipo de enzima se une a un nico tipo de sustancia, el sustrato, sobre el que acta.
La produccin de enzimas implica la fuente de obtencin de las mismas, as, existen tres
orgenes principales que son: animal, vegetal y microbiano. Tanto la animal como la vegetal son
limitadas por las inclemencias externas como el clima, la fuente de alimentacin, variedad de
los suelos, entre otras; lo cual la produccin microbiana brinda ventajas de ndole
biotecnolgico como: la obtencin rpida y controlada en reactores enzimticos.
Las enzimas en cuanto a su extraccin las podemos clasificar en dos grandes grupos:
intracelulares y extracelulares. En las primeras es obligatorio el rompimiento celular, para lo
cual existen diversos mtodos qumicos, fsicos y enzimticos, para las enzimas extracelulares
tan solo se requiere la separacin de la biomasa con el sobrenadante de la fermentacin.
S2
S1
+S.A.
V= 2.7 ml
V= 3.5 ml
PP1
Valcuota= V= 0.4 ml
200L
V= 0.245 ml
Dilucin 1/3
Vi Vf
ECH 200 L 600 L
S1 100 L 300 L
PP1 245 L 735 L
S2 200 L 600 L
PP2 400 L 2000 L
Tabla de absorbancias
I. Determinacin de protenas
A partir de la curva de calibracin realizada en la prctica anterior se van a determinar
la cantidad de protenas en cada muestra.
0.1
f(x) = 0x + 0
0.08 R = 1
0.06
Abosrbancia
0.04
0.02
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
mg% protena
ECH
32.5 mg. Protena---------------- 100 ml
S1
38.33 mg. Protena---------------- 100 ml
PP1
60 mg. Protena---------------- 100 ml
S2
20 mg. Protena---------------- 100 ml
PP2
90.83 mg. Protena---------------- 100 ml
Absorbancia
Blanco 0.163
o Clculo de las ECH 0.280 mol/L de p-
Nitrofenolato) Se tomaran
producido en 2las
S1 0.269
absorbancias
minutos PP1 0.357 netas
S2 0.083
PP2 (1/5) 0.481
A=.l.c
Donde:
= 18400 L.mol-1.cm-1
l = 1 cm
c=A/ .
Muestras Concentracin
(mol/L)
ECH 15.2
S1 14.62
PP1 19.4
S2 4.51
PP2 26.14
Entonces:
ECH
S1
PP1
19.4 moles ----------------- 1000 ml
X = 0.037 moles ----------------- 1.9 ml (Vol. del tubo)
S2
PP2
Resumen de Purificacin
3. DISCUSIONES
La purificacin de las protenas como las enzimas tienen un protocolo basado en la
experiencia y tomando mucho en cuenta el criterio en el procedimiento. Ya que los
resultados dependen mucho de las decisiones que tomamos en cada uno de los pasos
en la purificacin, como las respectivas diluciones y la aplicacin de determinadas
concentraciones de reactivo. Los resultados para la determinacin de protenas es una
determinacin menos especfica que la determinacin para la actividad y la
determinacin de las unidades enzimticas. Para la determinacin de las protenas se
uso la tcnica usando el reactivo de biuret (Quezada. 2007), para la cual se determin
que inicialmente haba 108.225mg en la muestra inicial de extracto (ECH), a partir de la
cual no se perdi mucho, ni vari drsticamente en los resultados de purificacin.
Para la determinacin de la actividad enzimtica se utilizo la reaccin con p-
nitrofenilfosfato en cada una de los pasos de purificacin siguiendo en cada paso la
distribucin de las unidades enzimticas, cabe indicar que en esta prctica no se
pretende obtener una purificacin eficiente, sino entender los pasos de purificacin y
como analizarlos y decidir que fraccin utilizar para los siguientes pasos. La purificacin
se realiz mediante la tcnica de 'salting-out, en la cual se utilizan sales neutras
(Weatherley. 1994), la protena no es desnaturalizada y la actividad enzimtica se
recupera. La causa de la precipitacin se debe a que cuando la sal es agregada las
regiones hidrofobicas son expuestas a la superficie de la protena, entonces estas
regiones interactan con otras regiones similares en otras protenas resultando en una
aglomeracin, de esta forma, formando agregados, precipitaran ms fcilmente (Harris
et al. 1995). Con el primer paso de la purificacin en la cual se le agrego sal hasta una
saturacin del 30%, luego de la centrifuga se observo mayor actividad en el
sobrenadante, en al cual se perdi aproximadamente 0.6 UE, luego de saturar el
segundo remanente al 80% se observ que casi todas las enzimas precipitaron, pero las
unidades enzimticas que se perdieron fueron casi de 1 UE, el que haya precipitado
quiere decir que para una fuerza inica mayor a la que sufre con un 80% de saturacin,
esta precipita; pero an se pueden observar protenas en el sobrenadante, que pueden
soportar esta saturacin.
4. CONCLUSIONES
- La enzima precipita a una saturacin con sulfato de amonio al 80%.
- Con estos pasos de purificacin se perdieron muchas unidades enzimticas,
logrndose rescatar menos del 50%.
- El factor de purificacin disminuyo a menos de la unidad para cada paso
implicando poca actividad especfica.
- La purificacin fue muy pobre ya que es probable que hayan muchas protenas
diferentes a la enzima en el precipitado final.
5. BIBLIOGRAFIA