UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Carrera de Mdico Cirujano

Microbiologa
Mdulo V. Aparato Digestivo

COPROCULTIVO E
IDENTIFICACIN DE
ENTEROBACTERIAS A PARTIR
DEL COPROCULTIVO
Equipo 4:
Andario Mrquez Nancy Carolina

Bernab Aguilar Patricia

Hernndez Lozada Mara Montserrat

Lpez Pineda Karen Stephana

Martnez Daz Alitzel Guadalupe

Montao Luna Jess

Ortiz Lpez Elvia Georgina

Pineda Corts Roberto

Zavala Baca Diana Ildegar

09-JUNIO-2014
 COPROCULTIVO E IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS A
PARTIR DEL COPROCULTIVO
OBJETIVOS

Efectuar la tcnica de coprocultivo y conocer su importancia mdica

Distinguir las caractersticas bioqumicas esenciales para la identificacin de las

enterobacterias cultivadas a partir del coprocultivo.

INTRODUCCIN

El coprocultivo, al igual que el urocultivo, no est indicado de forma rutinaria. La

mayora de las gastroenteritis agudas aparecen como procesos autolimitados y de
curso benigno, en las que la nica actitud recomendada es la de tratamiento
sintomtico y observacin. Ser en las enteritis graves en las que est indicado un
estudio microbiolgico, tanto para tratar con antimicrobianos especficos contra el
agente causal como para evitar o bloquear la difusin del microorganismo.

En cuanto a las indicaciones del estudio microbiolgico podemos considerar

razones tanto clnicas como epidemiolgicas. Las primeras vienen dadas por la
gravedad del proceso (deshidratacin, fiebre elevada, pus o moco en las heces) o
por la susceptibilidad del paciente (granulopenia, sida, hospitalizacin, edades
extremas de la vida, sndrome hemoltico-urmico). En las segundas, las
indicaciones las tendramos en brotes epidmicos (banquetes, guarderas,
hospitales), diarrea del viajero y en sospecha de posibles agentes con potencial
epidmico como el clera.

Para un correcto examen, la muestra deber ser de cantidad suficiente (tamao de

una nuez), recogerse en un envase estril (torunda excepcionalmente para
neonatos) y mandarlo coprocultivoal laboratorio en menos de dos horas a
temperatura ambiente en el caso de un estudio bacteriolgico o de parsitos,
mientras que si el examen es para rotavirus el envo ser inmediato y a una
temperatura de entre 2 y 8 grados centgrados.

En el estudio bsico de una enteritis en nuestro medio deberemos incluir

necesariamente el estudio de Campylobacter y Salmonella, ya que estos son los
patgenos ms frecuentes en el paciente grave adulto, a parte del rotavirus en el
lactante. En el paciente susceptible deberamos indicar, adems del estudio
bsico, otros estudios dirigidos a priorizar los microorganismos responsables, as
por ejemplo en el paciente hospitalizado durante ms de tres das investigaremos
Clostridium difficile.
Valoracin del resultado

El coprocultivo se realiza en los tres primeros das de la diarrea, ya que muchos

organismos entricos mueren si no se cultivan con rapidez, y porque es en este
perodo en el que se encuentran en nmero significativo en las heces. Los medios
a utilizar en un estudio bsico de heces varan de unos laboratorios a otros, pero
es necesaria la utilizacin de medios selectivos, como Hectoen (dirigido a Shigella,
Yersinia o Salmonella) o Agar Yersinia, y otros menos selectivos como
MacConkey (E. coli, Shigella, Aeromonas, Yersinia), XLD (Shigella) o Agar
Salmonella (Salmonella, Shigella). Cualquier crecimiento de estos
enteropatgenos se valorar como positivo y se informar de la especie as como
de su antibiograma, la nica excepcin la tendramos en el crecimiento puro y
abundante de Candida spp. y de Pseudomonas spp. de difcil valoracin como
patgenos, incluso en pacientes inmunodeprimidos con diarrea.

IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS

La familia de las enterobacterias son bacilos gramnegativos y se denominan as

por que habitan en el tracto intestinal. Casi todas las enterobacterias son
fermentadoras de la glucosa y de otros hidratos de carbono. Dada su importancia
clnica hay muchas tcnicas para aislarlas e identificarlas.

La utilizacin de pruebas bioqumicas sencillas realizadas con medios y mtodos

convencionales preparados en el laboratorio y de calidad, ayudan a la
identificacin de las bacterias aisladas con mayor frecuencia del tracto digestivo.

Algunas de las caractersticas metablicas fundamentales que se pueden observar

son la movilidad, la fermentacin de azcares, la produccin de cido sulfihdrico,
la presencia de ureasa, la descarboxilacin y la desaminacin de la lisina, ornitina
y arginina, la produccin de indol y la utilizacin del citrato. Estas se harn
evidentes con los medios TSI, LIA, citrato de Simmons, caldo rea, SIM y caldo
manitol rojo de fenol.

El principal objetivo es identificar el agente causal de la infeccin en el tracto

digestivo, descartando aquellas bacterias propias de la flora normal. Esto se
llevar a cabo mediante la siembra en medios de identificacin convencionales.
La existencia en el mercado de paneles miniaturizados para los estudios de las
pruebas metablicas ha significado un adelanto para la identificacin bacteriana.

Estas pruebas son procesadas por instrumentos que efectan la inoculacin, la

incubacin y la lectura de modo automatizado, evaluando los resultados que nos
permiten identificar la especie del agente patgeno.
MARCO TEORICO

La gastroenteritis es una inflamacin de la membrana interna del intestino

causada por un virus, una bacteria o parsitos. Se disemina a travs de alimentos
o agua que estn contaminados y el contacto con una persona infectada. La mejor
prevencin es lavarse las manos frecuentemente.

Los sntomas de gastroenteritis incluyen diarrea, dolor abdominal, vmitos, dolor

de cabeza, fiebre y escalofros. La mayora de las personas se recupera sin
tratamiento.

El problema ms comn con la gastroenteritis es la deshidratacin. Ocurre si no

ingiere suficientes lquidos para sustituir los que se pierden con los vmitos y la
diarrea. La deshidratacin es ms comn en bebs, nios pequeos, ancianos y
personas con un sistema inmunolgico dbil.

El coprocultivo es un examen de laboratorio que consiste en cultivar una muestra

de materia fecal para identificar grmenes causantes de enfermedades
gastrointestinales, como parsitos, bacterias, larvas, helmintos y tenia (gusanos),
amebas y protozoos (microorganismos conformados por una clula).

Se solicita el estudio en los siguientes casos:

Diagnosticar ciertas afecciones del sistema digestivo.

Conocer la causa de la diarrea severa, persistente (que no desaparece) o
recurrente (que se presenta peridicamente).
Aislar bacterias invasivas como Shigella, Salmonella y Campylobacter, de
aquellas que producen toxinas o invaden tejidos, entre ellas Vibrio cholerae
y Yersinia enterocolitica.

El examen bacteriolgico de las heces sirve para identificar grmenes patgenos

normalmente ausentes en el tubo digestivo y que pueden provocar diarreas e
infecciones digestivas en el individuo:

Salmonelas.
Shigella.
Campylobacter.
Ciertos Escherichia coli.
Vibrio cholerae.

Los sntomas de estas afecciones son los siguientes:

Dolores de estmago.
Diarreas.
Vmitos.
Fiebre.
Diarreas agudas, crnicas, febriles o no. El enfermo afectado por diarreas
emite heces lquidas, viscosas o hemorrgicas.
El coprocultivo es prescrito cuando se sospecha la presencia de un germen
peligroso para la salud de un individuo.
El objetivo principal consiste en buscar el microorganismo patgeno responsable
de la diarrea.
El coprocultivo es necesario cuando el paciente presenta una diarrea crnica en
un contexto epidmico, en respuesta a un viaje a un pas tropical por ejemplo.

Selenito Caldo

Medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de

materiales clnicos, especialmente heces.

Fundamento
Este caldo selectivo favorece el crecimiento de Salmonella spp.
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el
selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayora de la flora entrica
excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubacin.

Siembra
-Materia fecal: a un tubo con 10-15 ml de caldo selenito, agregar 1-2 ml de una
suspensin de materia fecal.
-Tejido infectado: macerar 1-2 g de tejido en 10-15 ml de caldo selenito, usando
una varilla estril.
-Orina: a un tubo con unos 5 ml de caldo selenito doble concentracin, agregar
igual volumen de orina.

Incubacin
A 35-37 C, durante 16-24 horas, en aerobiosis.

Luego, subcultivar en medios selectivos: Salmonella Shigella Agar (B02-138-

05/06), Hektoen Entrico Agar (B02-110-05/06), Verde Brillante Agar (B02-124-
05/06), Mac Conkey Agar (B02-114-05/06).

Resultados
Microorganismos Crecimiento
Salmonella enteritidis Bueno
Salmonella typhimurium Bueno
Escherichia coli Regular-Escaso
Proteus mirabilis Regular-Escaso

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro, traslcido.
Tetrationato Caldo

Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a

partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos
txicos.
La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato
(generado en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales
biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima
tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la
flora acompaante.

Siembra
Puede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en
forma directa conservando la proporcin 1:10.

Incubacin
Durante 12-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis

Resultados
Microorganismos Crecimiento
Salmonella typhi Escaso
Salmonella typhimurium Bueno-excelente
Salmonella enteritidis Bueno-excelente
Escherichia coli Escaso

Caractersticas del medio

Medio preparado: suspensin blanco lechosa.

E.M.B. Agar.

Eosina Azul de Metileno (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el

aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas
exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos
capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de
hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un
efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico brillo metlico. Las
cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento
de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad
permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en
este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que
Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul
lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a
partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a
sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de
especies de Salmonella y Shigella.

Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener
colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.

Incubacin
De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Escherichia coli Verdosas con brillo metlico y centro negro
azulado
Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa prpura, confluentes
Proteus mirabilis Incoloras
Enterococcus faecalis Incoloras, pequeas, puntiformes
Shigella flexneri Incoloras
Salmonella typhimurium Incoloras

Caractersticas del medio:

Placas preparadas: color prpura.

Salmonella Shigella Agar.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas

especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.
La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido
sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,
acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias
rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen
bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro
debido a la formacin de sulfuro de hierro.

Siembra
Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo.
Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar
E.M.B. o de agar Mac Conkey.

Incubacin
Durante24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados
Microorganismos Colonias
Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro
Shigella flexneri Incoloras
Shigella sonnei Incoloras
Proteus mirabilis Transparentes, centro negro
Escherichia coli Rosadas a rojas
Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas
Enterococcus faecalis Incoloras, de muy escaso crecimiento

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo naranja.

Agar sulfito bismuto

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella typhi y otros

bacilos entricos.

Colonias tpicas
Las colonias tpicas de la Salmonella typhi son marrones o negras, algunas veces
con brillo metlico alrededor de las colonias. Algunas cepas producen colonias
verdes con poco o ningn oscurecimiento.

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogneo de

bacterias gramnegativas. Reciben su nombre por la localizacin habitual como
saprofitos en el tubo digestivo, aunque se trata de grmenes ubicuos,
encontrndose de forma universal en el suelo, el agua y la vegetacin, as como
formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales adems del
hombre.
Escherichia coli, el microorganismo ms prevalente de esta familia, es una de las
bacterias prototpicas sometidas a estudio.

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son microorganismos con forma de

bastn, por lo general de 1-3 m de largo y 0,5 m de dimetro.
Como en otras bacterias gramnegativas, su envoltura celular se caracteriza por
una estructura multilaminar. La membrana interna (o citoplasmtica) consiste en
una doble capa de fosfolpidos que regula el paso de nutrientes, metabolitos y
macromolculas. La capa siguiente, o capa externa, consiste en un
peptidoglucano delgado junto con un espacio periplsmico que contiene una
elevada concentracin de protenas. La membrana externa compleja consiste en
otra doble capa de fosfolpidos que incluyen lipopolisacridos (LPS) (en la parte
ms externa, son un importante factor de virulencia de estas bacterias),
lipoprotenas (que estn fijadas al peptidoglucano), protenas porinas multimricas
(que facilitan el paso de diversas sustancias, incluidos los antibiticos
betalactmicos) y otras protenas de la membrana exexterna.
Entre estas protenas hay algunas organelas complejas que irradian hacia el
exterior: los flagelos, estructuras que se utilizan para la locomocin y que
provienen de una estructura basal localizada en la membrana interna, las fimbrias
(o pili comunes), con importante funcin como adhesinas y los pili sexuales,
estructuras presentes en las bacterias que contienen plsmidos conjugativos y que
las bacterias utilizan para mediar la transferencia conjugativa de ADN del
plsmido.
El LPS tiene tres dominios principales: el esqueleto de lpido A, el oligosacrido
fosforilado central (core) y las cadenas laterales de oligosacrido de repeticin. El
lpido A, tambin conocido como endotoxina, es la parte biolgicamente activa de
la molcula que el husped reconoce. El oligosacrido de repeticin unido al LPS
se conoce como antgeno O. Este antgeno es la base para la clasificacin de los
serogrupos. Junto con otros factores, la presencia del antgeno O media la
resistencia bacteriana al efecto bactericida del suero normal, siendo capaces por
tanto de sobrevivir ms tiempo en sangre y causando infecciones hematgenas,
diseminadas y ms graves

Agar Triple Azucar Hierro (TSI)

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en
base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido
sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa
son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato
necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es
la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y
el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre
la superficie del medio.

Incubacin
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.

Resultados
Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente
fermenta la glucosa.
Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no
fermentador de azcares.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido
sulfhdrico.
Microorganismo Pico/Fondo Produccin de Produccin de
gas cido sulfhdrico
E. coli A/A + -
K. pneumoniae A/A + -
P. mirabilis K/A + +
S. typhimurium K/A - +
S. enteritidis K/A + +
S. flexneri K/A - -
P. aeruginosa K/K - -

A: cido
K: alcalino

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

Agar Lisina Hierro (LIA)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes
para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio,
son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de
bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor
a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el

medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de
la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea
previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son

fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del
medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.

Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,

desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal
de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del
medio.

Siembra
Por puncin profunda con aguja de inoculacin.

Incubacin
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.

Resultados

1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia
y alguna cepas de Morganella spp.

3-Produccin de cido sulfhdrico:

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y
fondo)
 Microorganismos Color en el pico Color en la Ennegrecimiento
de flauta base del tubo del medio
Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo
Salmonella Prpura Prpura Positivo
typhimurium
Salmonella enteritidis Prpura Prpura Positivo
Providencia Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Prpura Amarillo Positivo
Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo
Edwarsiella spp. Prpura Prpura Positivo
Klebsiella pneumoniae Prpura Prpura Negativo
Escherichia coli Prpura Prpura Negativo
*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.

Caractersticas del medio

Medio preparado: color violeta.

Agar Simmons Citrato

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad
de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el
citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema
buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan
sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin
de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato
da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio
alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de
carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero,
usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubacin
A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis.

Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin.

Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo
bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae Positivo Azul
S. typhimurium Positivo Azul
E. coli Negativo Verde
S. flexneri Negativo Verde

Limitaciones
-Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color
del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la
visualizacin azul de un resultado positivo.
-Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo,
se debe esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o
sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar
resultados falsos positivos.

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde.

Medio SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de
sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para
formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas
triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovacs
o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden
apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de
siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por
la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato
siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin
profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe
inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del
medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en
lnea recta.

Incubacin
Durante 24 horas, a 35-37 C, en aerobiosis.
Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.

Resultados
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende ms all de la lnea
de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo
el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de
Kovacs o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Microorganismo Movilidad Indol Produccin de

cido sulfhdrico
E. coli + + -
K. pneumoniae - - -
P. mirabilis + - +
S. typhimurium + - +
S. enteritidis + - +
S. flexneri - - -

Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad
puede ser difcil de observar.
-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un
color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin
de cido sulfhdrico.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar.

Caldo urea
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica.
Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp.,
otras enterobacterias y estafilococos.

Fundamento
En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el
desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico,
y el rojo de fenol es el indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando
amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo
virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la
glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en
aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de
Enterobacter o Klebsiella.

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta.
Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin.
Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.

Incubacin
En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C.

Resultados

Microorganismo Actividad uresica Color del medio

Proteus mirabilis Positiva Rojo-Rosado
K. pneumoniae Positiva dbil Rojo-Rosado
Escherichia coli Negativa Amarillo
S. flexneri Negativa Amarillo
S. typhimurium Negativa Amarillo

Limitaciones
-Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y
Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios
das de incubacin.
-No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone
facilmente.

Caractersticas del medio

Medio preparado: amarillo

MATERIAL

- Muestra de heces en un frasco - 1 caja de medio Sulfito y Bismuto

estril
- Asa bacteriolgica
- 1 tubo de caldo de Tetrationato
- Mechero
- 1 tubo de caldo Selenito
- 2 hisopos estriles
- 1 caja de medio EMB

- 1 caja de medio SS (Salmonella-

Shigella)
-2 tubos de agar TSI

- 2 tubos de agar LIA

- 2 tubos de agar Citrato de Simmons

- 2 tubos de medio de SIM

- 2 tubos de caldo Urea

- 2 tubos de caldo Manitol rojo de

fenol
PROCEDIMIENTO

1. De una colonia aislada de Salmonella, tomar una muestra y sembrar por

agitacin en los medios: caldo Urea y caldo Manitol rojo de fenol.

2. Tomar otra muestra de Salmonella y por picadura, sembrar en el medio de SIM.

3. Tomar otra muestra de Salmonella y sembrar, por estra simple y picadura, en

los medios: agar TSI, agar LIA y agar Citrato de Simmons.

4. Seguir el mismo procedimiento para sembrar las pruebas bioqumicas de los

medios de cultivo de Proteus, Shigella y Escherichia coli.

5. Incubar durante 24 a 48 horas a 37C.

6. Leer movilidad, produccin de cido sulfihdrico y produccin de indol (adicionar

el reactivo de Kovac o Erlich) en el medio de SIM.

7. Tomar una muestra de heces con el hisopo estril y colocarlo en el medio de

Tetrationato.

8. Tomar otra muestra y colocarla en el medio de Selenito.

9. Incubar durante 24 horas a 37C, previo a la prctica.

10. Dividir las cajas de medio de cultivo en dos.

11. Descargar la muestra de heces con el hisopo, en un extremo de la caja del

medio de cultivo, a partir del medio Tetrationato.

12. Descargar la muestra de heces con el hisopo, en el otro extremo de la caja del
medio de cultivo, a partir del medio Selenito.

13. Quemar los hisopos.

14. Sembrar con el asa bacteriolgica, por estra de aislamiento simple, en ambas
secciones del medio de cultivo.

15. Seguir el mismo procedimiento para cada uno de los medios de cultivo.

16. Incubar durante 24 a 48 horas a 37C.

17. Leer morfologa colonial.

RESULTADOS COPROCULTIVO

Medio S-S EMB Sulfito-bismuto

Morfologa
Forma Circular Circular Circular

Elevacin Elevada Plana Elevada

Borde Entero Entero Entero

Color Incolora/rojas Verde metlico Halo transparente

centro negro
Luz Transparente Brillante Opaco

Tamao 2 mm 4-5 mm 1 mm

Consistencia Mucosa Blanda Dura

Superficie Lisa Lisa Lisa

1.- Agar Sulfito Bismuto

2- Agar Salmonella-Shigella

3. Agar EMB
 RESULTADOS: PRUEBAS BIOQUMICAS

Escherichia coli Salmonella

Agente
Prueba
Citrato de Positivo Positivo
Simons

LIA Positivo Positivo

Urea Negativo Negativo

Manitol Positivo Positiva

TSI Gas (+), Fermentacin (+), SH (-) Gas (-), Fermentacin (+), SH (+)

SIM Indol (+), Movilidad (+), SH (-) Indol (+), Movilidad (+), SH (-)
DISCUSIN

El coprocultivo un estudio de laboratorio que nos permite identificar las

posible especies patgenas de microorganismos presentes en las heces, esto
mediante el cultivo en determinados medios y despus por las reacciones
bioqumicas. El tubo digestivo se encuentra colonizado por microorganismo desde
el nacimiento y durante toda la vida alberga una variada poblacin de
microorganismo, por lo que para aislar bacterias patgenas de las heces se debe
inhibir el crecimiento de las no patgenas, es por ello que se utiliza el caldo
tetrationato y el caldo selenito. El primero es un caldo selectivo para Salmonella y
Shigella, esto debido a las sales biliares y al tiosulfato que contiene, los cuales
inhiben las bacterias grampositivas y enterobacterias. El caldo selenito es de
enriquecimiento para el aislamiento de especies de Salmonella, inhibiendo a las
grampositivas y la mayora de la flora entrica por el selenito de sodio (Forbes,
2009). A partir de las muestras de estos tubos se sembraron en medios selectivos
y diferenciales.

En la imagen 1 observamos el agar Sulfito bismuto el cual es un medio selectivo

para Salmonella typhi, el crecimiento fue mnimo y se registr a partir de la
muestra tomada del caldo selenito, demostrando as que es para aislar a especies
de Salmonella. Las colonias fueron con centro negro y bordes claros con halo
grisceo, que son las caractersticas de Salmonella typhi; esto fue debido a la
produccin de sulfuro de hidrgeno y la reduccin de los iones bismuto por la
presencia del mismo. La imagen 2 nos muestra el agar Salmonella-Shigella, este
medio contiene sales biliares, citrato de sodio y verde brillante que inhiben el
desarrollo de bacterias grampositivas, la mayora de coliformes y el desarrollo de
Proteus, nos permite diferencia a bacterias por la fermentacin de lactosa, los
microorganismo no fermentadores son incoloros, en tanto que los fermentadores
aparecen como colonias rojas, esto explica los dos tipos de colonias que se
observan ya que fueron colonias circulares rojas y colonias incoloras, esto tanto en
las muestras de tetratioato y selenito por lo que nos lleva a suponer que las
colonias incoloras pertenecen a alguna especie de Salmonella, en las
fermentadoras podra tratarse de E. coli. El agar EMB que se ve en la imagen 3,
es un medio selectivo y diferencial entre organismos capaces de utilizar la lactosa
y las que no lo hacen, los indicadores eosina y azul de metileno ejercen un efecto
inhibitorio en grampositivos. Los resultados fueron colonias tpicas de E. coli, es
decir verdosas con brillo metlico, sin embargo hubo poco desarrollo.
Para la realizacin de pruebas bioqumicas las muestras se obtuvieron del agar
EMB en donde hubo crecimiento de Escherichia coli y de las colonias incoloras
que aparecieron en el agar Salmonella-Shigella. La prueba de citrato fue positiva
para ambos casos, lo cual nos indican que las bacterias son capaces de usar el
citrato como fuente de carbono, sin embargo tericamente esta prueba solo es
positiva para Salmonella, (Prats, 2006) por lo que estos no llevara a pensar en
que a pesar del crecimiento de colonias tpicas de E. coli haba presencia de otras
bacterias ya que los caldos inhiban el crecimiento de esta enterobacteria, o hubo
una contaminacin al inocular la muestra.

En la prueba de LIA se demuestra la capacidad de la bacteria para descarboxilar y

desaminar a partir del aminocido lisina, as como la produccin de sulfuro de
hidrgeno y la produccin de gas, de acuerdo a los resultados obtenidos
encontramos que E. coli y Salmonella solo fueron positivos para la
descarboxilacin. En la prueba de urea encontramos que ambos tubos fueron
negativos. Los resultados obtenidos a partir LIA y urea coinciden con la literatura
consultada, lo cual no ocurre con la prueba de manitol puesto que aparecen las
pruebas positivas, si embargo el microorganismo que fermentan manitol es
grampositivo, lo cual muy improbable de encontrar puesto que desde el cultivo de
la muestra en el caldo selenito y tetrationato se inhibi el crecimiento de estas
bacterias, por lo que este resultado se puede deber al tiempo que transcurri entre
la inoculacin y la lectura de resultados.

La prueba SIM nos mostr resultados iguales, hubo la formacin de indol,

presentan movilidad pero no produccin de sulfuro de hidrgeno, en el caso E.
coli los resultados coinciden con las caractersticas de la bacterias puesto que
fermenta carbohidratos, y la formacin de indol solo se da en microorganismo que
los fermentan por lo que la aparicin de indol en el tubo de Salmonella; que no
fermenta ningn carbohidrato; nos hace pensar en un mal procedimiento al
inocular, sin embargo si tomamos en cuenta que fermento manitol, eso explica la
produccin de indiol.

Lo que nos demuestra con mayor claridad que se trata de E. coli y Salmonella
typhi es la prueba de TSI ya que en el tubo de E. coli se muestra la fermentacin
de glucosa, lactosa y sacarosa, con la produccin de gas visible por la burbuja de
aire presente, pero no hay produccin de sulfuro de hidrgeno. El resultado de la
otra muestra fue la fermentacin de glucosa que se demuestra solo en el fondo, en
el pico de flauta tambin aparece un color amarillo, sin embargo no se aprecia
bien debido a la dbil formacin de cido sulfhdrico, a pesar de la fermentacin no
hubo produccin de gas, esto nos indica que es Salmonella entrica, pero debido
a que no hay produccin de gas podramos pensar en S. typhi (Prats, 2006).
BIBLIOGRAFA

Forbes Betty; Diagnstico microbiolgico; 12 Edicin; Argentina; Editorial Medica

Panamericana.2009

MacFaddin. Pruebas bioqumicas para las identificaciones de bacterias de

importancia clnica. 3a Ed. Espaa; Editorial Mdica Panamericana: 2003.

Prats Guillem. Microbiologa clnica. Madrid, Espaa: Mdica panamericana: 2006