Las promesas y las trampas de la

teraputica basada ARN-interferencia

Daniela Castanotto 1 y John J. Rossi 1
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Abstracto
El descubrimiento de que la expresin gnica puede ser controlada por el Watson-Crick de
apareamiento de bases de ARN pequeos con los ARN mensajeros que contienen secuencia
complementaria - un proceso conocido como interferencia de ARN - marcadamente ha
avanzado nuestra comprensin de la regulacin de genes eucariotas y funcin. La
capacidad de las secuencias cortas de ARN para modular la expresin de genes ha
proporcionado una poderosa herramienta con la que estudiar la funcin de genes y va a
revolucionar el tratamiento de la enfermedad. Sorprendentemente, a pesar de ser tan slo
una dcada desde su descubrimiento, el fenmeno ya est siendo utilizado teraputicamente
en ensayos clnicos en humanos, y las empresas de biotecnologa que se centran en
productos teraputicos basados en la interferencia del ARN ya se negocian pblicamente.

Antes de 1980, el RNA se considera generalmente que no ms de un portador de

informacin intermedia pasiva entre el ADN y la sntesis de protenas. El descubrimiento
de los RNAs catalticos en la dcada de 1980 mereci un premio Nobel compartido de Tom
Cech y Sidney Altman, y en 1986, se propuso el concepto de "mundo ARN", un lenguaje
creado por Walter Gilbert. Hoy en da, esta es una expresin comn, y el ARN se ha
cobrado un lugar central en la biologa celular.

Hace slo diez aos, el repertorio funcional del ARN se ampli con el descubrimiento en el
nematodo Caenorhabditis elegans 1 que naci ARN de doble cadena (dsRNA) pueden
desencadenar el silenciamiento de las secuencias de ARN mensajero complementarias, y el
trmino "interferencia de ARN" (ARNi). Poco despus, dsRNAs cortos - o ARN de
interferencia cortos (siRNAs) (revisado en ref. 1 ) - se generaron artificialmente y se usan
para demostrar que este proceso tambin se produce en clulas de mamfero, por lo general,
pero no siempre, sin desencadenar la innata tem sys inmune , que normalmente reconoce
ARN como parte de un mecanismo de defensa antiviral (vase la pgina 421). El
conocimiento de que los pequeos RNAs pueden afectar la expresin gnica ha tenido un
enorme impacto en la investigacin bsica y aplicada, y ARNi es actualmente uno de los
nuevos enfoques ms prometedores para la terapia de la enfermedad.

Que el ARNi puede ser activado in vivo en mamferos se mostr por primera vez en los
animales infectados con el virus de la hepatitis B 2 . Esto fue seguido por la primera
aplicacin teraputica de siRNAs: siRNAs estaban dirigidos a Fas mRNA en un modelo de
ratn de la hepatitis autoinmune, lo que resulta en la proteccin de los animales tratados
contra la fibrosis heptica 3 . En 2004, slo seis aos despus del descubrimiento de RNAi,
las primeras terapias humanas basadas en siRNA - desarrollados como tratamientos para la
degeneracin macular relacionada con la edad hmeda - entraron en la fase I de ensayos
clnicos. El ARNi es uno de los campos de ms rpido avance en la biologa, y el flujo de
los descubrimientos da verdadero sentido a la expresin "desde el banco a la cabecera '.

Aunque se sabe mucho sobre los mecanismos de RNAi, hay una serie de retos que las
aplicaciones de esta tecnologa silenciamiento de genes necesitan para vencer. Por un lado,
RNAi es un mecanismo regulador de fundamental importancia en la clula, y aprovechando
que en inters de beneficio teraputico podra resultar en efectos secundarios.
Exgenamente introducido secuencias de ARN de doble cadena pueden secuestrar
componentes que constituyen la maquinaria celular implicada en el silenciamiento de genes
(vase la pgina 396), reduciendo as la accesibilidad de la maquinaria a una clase de ARN
pequeos conocidos como microRNAs (miRNAs) que estn entrando en la va celular
natural 4 , 5 . Adems, algunos siRNAs sintticos contienen motivos de secuencia que
pueden inducir interfern de tipo I respuestas y estimular la produccin de citoquinas pro-
inflamatorias 6 - 8 .

Durante los ltimos aos, muchos cientficos han buscado soluciones para superar estas
limitaciones y para aumentar la seguridad de los potenciales teraputicos basados en RNAi.
Este artculo explora las recientes estrategias para minimizar los efectos secundarios
indeseables, describe nuevos enfoques para la entrega y discute las terapias RNAi que se
estn probando. Como se prev que esta tecnologa se puede aplicar a una variedad cada
vez mayor de las enfermedades, los problemas potenciales y soluciones que podra un da
transformar RNAi en un tratamiento convencional para enfermedades humanas merecen
una atencin especial.

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silenciamiento gnico endgeno

Las molculas de ARN efector de RNAi consisten en ~ 20-30 nucletidos 9 . Ellos se
complejan con los componentes proteicos del complejo de silenciamiento inducido por
ARN (RISC). Su ncleo cataltico en plantas y animales (con la excepcin de los
organismos unicelulares) es AGO2, un miembro de la familia de protenas altamente
conservadas Argonauta 10 . Estos pequeos ARN pueden silenciar la expresin gnica
mediante dos mecanismos: post-transcripcional silenciamiento gnico (PTGS) 11 , y
transcripcional silenciamiento gnico (TGS) 12 , 13 ( Fig. 1 ). PTGS puede, a su vez, se
divide en dos mecanismos principales: la escisin directa de secuencias especficas, y la
represin de traduccin y la degradacin del ARN. la escisin especfica de secuencia
directa se produce cuando el ARNm apuntado es perfectamente complementaria a la siRNA
y se degrada despus de la escisin especfica del sitio por el RISC. la represin de
traduccin y la degradacin del ARN ocurrir cuando la pequea secuencia gua de ARN
slo tiene complementariedad limitada a la diana en la regin de "semilla" (nucletidos 2 a
8 desde el extremo 5 'de la hebra gua), con el apareamiento de bases que ocurre
generalmente en el 3 'no traducida (UTR). Este ltimo mecanismo es utilizado por
miRNAs.

Figura 1
Los mecanismos de silenciamiento de genes celulares

TGS se ha demostrado en Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisin), las plantas y,

ms recientemente, las clulas de mamfero 14 de - 17 de . En S. pombe, el proceso est
mediado por la transcripcin de ARN complejo de silenciamiento inducido (RITS), que
contiene Ago1, la protena chromodomain chp1 y la glicina y triptfano (GW) -Repita que
contiene protena TAS3 (ref. 18 ) (vase la pgina 413) . Aunque en clulas de mamfero el
mecanismo por el cual se produce el silenciamiento de pequea dirigida por ARN es
todava muy debatida, tanto AGO1 y AGO2 han demostrado ser integral al proceso general
de 19 , 20 . Ms recientemente, un miARN (miR-320) se ha demostrado que regulan la
transcripcin de la subunidad POLR3D de la ARN polimerasa III (pol III) 21 en cultivo de
clulas humanas.

Pequeos RNAs endgenos se han encontrado en diversos organismos, incluyendo seres

humanos, ratones, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y C. elegans. Muchos de
stos se originan a partir de transposones, virus y secuencias repetitivas y se caracterizan
por sus interacciones con la subfamilia PIWI (o clado PIWI) de las protenas Argonaute 22 -
25
- Estos son los ARN-PIWI interactuar tanto con nombre (piRNAs). La identificacin de
piRNAs se ha restringido a las clulas de la lnea germinal. Recientemente, una nueva clase
de siRNAs endgenos (endo-siRNAs o esiRNAs) se ha identificado en las gnadas y
tejidos somticos de D. melanogaster 26 de - 29 de y en los ovocitos de ratn 30 , 31 . En
ratones, se han propuesto endo-siRNAs para regular el movimiento retrotransposon 30 , 31 .
Varias familias de pequeos ARNs, incluyendo siRNAs repeticin-asociado (ra-siRNAs),
pequeos ARN no codificantes (tncRNAs), siRNAs-actuando trans (ta-siRNAs) y escanear
ARN (scnRNAs) ( Tabla 1 ) se encuentran en los hongos, plantas y animales, pero hasta el
momento ninguno de ellos ha sido observado en los mamferos. La evidencia sugiere que
piRNAs actan a travs de diferentes vas celulares de siRNAs y miRNAs y as podran
ofrecer estrategias alternativos de focalizacin de objetivos teraputicos.

tabla 1
Pequeos RNAs celulares implicados en el silenciamiento de genes
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diseos superiores para molculas pequeas

genes celulares pueden ser dirigidos por la introduccin exgena de siRNAs, que luego se
aprovechan del mecanismo de PTGS endgeno. Los siRNAs pueden ser transfectados en
clulas, donde entran en el RISC directamente, o se generan dentro de las clulas a travs
de la expresin gnica mediante el uso de vectores que contienen Pol II o pol III
promotores. Estos factores desencadenantes de ARNi se pueden expresar en animales y
plantas, pero no en S. pombe, en forma de miRNAs o ARN de horquilla como cortos
(shRNAs), que se escinden en ARN pequeos (~ 21-25 nucletidos) por las enzimas
Drosha y / o Dicer. En ambos casos, si las dos hebras de la gatillo de ARN son
completamente complementarias, la hebra de pasajeros se escinde por AGO2 (refs 32 , 33 ),
dejando atrs una monocatenario secuencia gua, que acta como la plantilla para el
reconocimiento del gen diana secuencia por el RISC ( Fig. 1 ).

La mayor parte de las aplicaciones teraputicas inminentes basados en RNAi proponen el

uso de introduccin directa de siRNAs sintticos. La ventaja de usar una molcula
sintetizada qumicamente es que las modificaciones qumicas pueden introducirse para
aumentar la estabilidad, promover la eficacia, bloquear la unin a los objetivos no deseados
que contienen desajustes de secuencia (especficos efectos fuera de objetivo), y reducir o
anular los posibles efectos inmunoestimulantes (off- general efectos de destino). Sin
embargo, los efectos de estas molculas son transitorios, mientras que los shRNA o
miRNA-promotor expresado potencialmente pueden mediar en el silenciamiento a largo
plazo con una sola aplicacin.

siRNAs convencionales son ~ 22 nucletidos y tienen salientes 3 'de dinucletidos que

imitan productos de escisin Dicer. Debido a que no todos los siRNAs alcanzar niveles
equivalentes de destino de derribo, el cribado de siRNA a gran escala se realiza a menudo
para cualquier objetivo determinado para encontrar los inhibidores ms potentes. Estos han
producido algunas reglas de diseo de siRNA. Por ejemplo, para facilitar la incorporacin
en el RISC, el extremo 5 'de la hebra antisentido (gua) debe ser diseado para tener una
estabilidad termodinmica ms baja que el extremo 5' de la hebra codificante. La
proporcin de la guanosina nucletidos de citidina y debe estar alrededor de 50% o menos,
y la seleccin de los sitios de unin a protenas conocidas en las regiones reguladoras de
ARNm se debe evitar porque la unin de protenas reguladoras puede bloquear el
apareamiento de siRNA-objetivo. Por la misma razn, las estructuras intramoleculares en el
objetivo debe ser evitado. Los anlisis estadsticos tambin han encontrado una preferencia
para ciertos nucletidos en posiciones especficas dentro del siRNA 34 . Muchos programas
de ordenador estn disponibles para la identificacin de las secuencias diana ptimas para
un gen dado 34 , 35 . Una de ellas, una red neuronal artificial, se ha utilizado para desarrollar
una biblioteca de siRNA en todo el genoma de los seres humanos y para identificar siRNAs
eficaces para 34 objetivos 36 .

Las modificaciones qumicas se incluyen a menudo en el diseo de siRNAs sintticos.

Adems selectiva de enlaces fosforotioato o sustitucin de 2 'fluoropirimidinas o un metil
2'- O para la 2' ribosa en ciertas posiciones no compromete la actividad de siRNA y
concomitantemente aumenta la resistencia a ribonucleasas 37 , que es importante para
aplicaciones en vivo. Una sola 2'- O-metil grupo en la cadena de pasajeros de un dplex de
siRNA puede abrogar la activacin de los receptores Toll-like 38 y prevenir icities tox
debido a la activacin de interfern de tipo I la expresin de genes va. Recientemente se ha
demostrado que el cido -arabinonucleic d fluoro-- (FANA 39 o como 4'-S -FANA 40 ) o
cido arabinonucleic (ANA 41 ) modificaciones pueden aumentar tanto la estabilidad en
suero y la potencia de siRNAs. Algunas modificaciones qumicas tambin tienen la
importante ventaja de disminuir o bloquear la actividad de sentido hebra del siRNA (de
pasajeros), con lo que la reduccin de efectos especficos fuera de objetivo. Otras
modificaciones, tales como la adicin de cido lurico, cidos litoclico y derivados de
colesterol, se pueden hacer para aumentar la captacin celular 42 , que es actualmente uno
de los principales obstculos de la terapia RNAi.

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Allanamiento de morada
Las aplicaciones teraputicas de siRNAs requieren la entrega eficaz a las clulas diana y
tejidos. Las dos estrategias principales son la entrega de siRNAs (entrega no viral)
sintetizado qumicamente, o la entrega de shRNA-codificacin de los genes de los virus de
ingeniera que en ltima instancia generar siRNAs por transcripcin en las clulas diana.

de administracin no viral

Debido a su tamao y carga negativa, siRNAs no se prestan fcilmente atraviesan las

membranas celulares. Por lo tanto, la entrega ha sido uno de los principales retos para la
tecnologa del RNAi. Varios medios de suministro se han desarrollado y probado en
murinos y no humanos modelos de primates, que van desde la inyeccin de ARN desnudo
en un rgano diana como el pulmn o el ojo de la entrega sistmica del ARN en
nanopartculas, en complejo con policationes, unidos a grupos de colesterol o conjugados
con los receptores de la superficie celular. Algunos enfoques de entrega se detallan en la
figura. 2 .

Figura 2
En las estrategias de prestacin vivo para siRNAs teraputicos

Dos polmeros que han sido examinados por sus propiedades de suministro se
atelocolgeno y quitosano. Los quitosanos tienen propiedades mucoadhesivas y se han
utilizado para la entrega intranasal a las clulas epiteliales bronquiolares 43 . Administracin
intranasal ha demostrado ser un medio eficaz para la entrega de siRNA en ratones 44 y en
primates no humanos 45 para bloquear la infeccin por virus respiratorio sincitial del tracto
respiratorio superior. De hecho, la entrega de siRNAs a las membranas mucosas parece ser
un enfoque eficaz en general. Por ejemplo, la entrega de siRNAs intravaginal lpidos
encapsulado de orientacin virus del herpes simple 2 (HSV-2) proporcion proteccin
contra la infeccin viral letal en ms de dos tercios de los ratones tratados con siRNA 46 .

Orientacin de la anti-apolipoprotena B (APOB) y peroxisoma receptor- activado por el

proliferador (PPAR-) siRNAs para el hgado que se ha logrado por medio de un polmero
'membrana activa ", que puede enmascarar su actividad hasta que alcanza el endosoma , lo
que resulta en la entrega de siRNAs a los hepatocitos despus de un simple inyeccin
intravenosa 47 . Un enfoque diferente de entrega siRNA transferrina utilizado conjugado
con un polmero de ciclodextrina-policatin para entregar siRNAs dirigidos mRNA de
fusin EWS-Fli1 sarcoma de Ewing por medio del receptor de la transferrina en ratones 48 ,
resulta en la inhibicin de la progresin del tumor. Y la conjugacin de un ARNsi a un
grupo colesterol permitido su entrega al hgado y el yeyuno, donde downregulated su
objetivo, APOB, dando lugar a la consiguiente disminucin de los niveles de colesterol en
sangre en un sistema de modelo murino 49 .

Un avance importante para la entrega de siRNA fue la aplicacin con xito de partculas
lipdicas de cidos nucleicos estables decoradas con poli etilenglicol (PEG) cadenas
polimricas (denominados SNALPs) para la entrega de siRNAs dirigidos contra APOB
ARNm (APOB -targeted siRNAs) para los hgados de primates no humanos 50 . En este
caso, el efecto de ARNsi de una nica inyeccin intravenosa dur ms de 11 das y dio
como resultado objetivo mayor que 90% desmontables y no toxicidad 50 . Estos resultados
emocionantes han aumentado la confianza en el potencial de siRNAs teraputicos para el
tratamiento de enfermedades hepticas.

Hasta hace poco, la mayora de los enfoques para la administracin in vivo se han dirigido a
un rgano particular, principalmente los ojos, los pulmones o el hgado. Un avance
significativo en la seleccin de siRNAs a una clase especfica de leucocitos implicadas en
la inflamacin intestinal ahora se ha informado 51 . En este estudio, una ciclina D1 (Cyd1) -
targeted siRNA se carg en nanopartculas estabilizadas, las superficies de las cuales
incorporan un anticuerpo especfico para un receptor expresado por los leucocitos. Las
nanopartculas que contienen siRNA dirigidos regulados hacia abajo el objetivo de ciclina
D1, la proliferacin de leucocitos suprimida y revirti la colitis inducida experimentalmente
en ratones 51 .

La entrega de siRNAs en el sistema nervioso ha sido particularmente difcil. El cerebro es

notoriamente refractarios a la orientacin debido a las dificultades en cruzar la barrera
sangre-cerebro. Sin embargo, la entrega de siRNAs para el sistema nervioso perifrico por
infusin directa en el cerebro para el alivio de dolor crnico 52 - 54 o la ansiedad 55 se ha
demostrado en ratas. Los conjugados de liposomas y anticuerpos o neuropptidos tambin
se han utilizado para entregar siRNAs en el cerebro murino 56 . Sin embargo, estos mtodos
no se dirigen a las neuronas, y se requiere la inyeccin craneal para hacer este tipo de
terapias ms apetecible una alternativa menos invasiva para dirigir.

Un estudio reciente abri la posibilidad de entrega selectiva de siRNAs para el sistema

nervioso central mediante inyeccin intravenosa sistmica 57 . El siRNA involucrados -
diseado para atacar virus de la encefalitis japonesa - se conjug con un pptido corto
derivado de la glicoprotena de virus de la rabia, que se une al receptor de acetilcolina de
las clulas neuronales. Despus de la entrega transvascular, 80% de los ratones tratados con
el siRNA teraputico sobrevivi infeccin con el virus de la encefalitis japonesa, mientras
que 100% de los controles no tratados murieron a causa de complicaciones de la infeccin
57
.

Otro enfoque interesante que permite la entrega de siRNA sistmica y dirigida utiliza una
protena de fusin de protamina-anticuerpo 58 . El resto de protamina est ligada a la regin
de unin a antgeno de cadena pesada (Fab) de un anticuerpo para el virus de la
inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) protena de la envoltura gp160. La protamina cargada
positivamente se une los siRNAs con carga negativa - que estn dirigidos en contra de la
mordaza gen VIH - permitiendo la administracin selectiva a las clulas que expresan la
protena de envoltura gp160 en sus superficies 58 . Esto da como resultado la internalizacin
del complejo anticuerpo-siRNA, la liberacin de los siRNAs y regulacin a la baja de los
Gag-codificacin de las transcripciones de VIH en un modelo murino in vivo. En este
mismo estudio, la fusin a la protamina de un anticuerpo especfico para el receptor de la
hormona de ERBB2 permiti siRNA dirigidos de las clulas cancerosas que expresan ese
receptor 58 .

Una tecnologa similar para la administracin dirigida especfica se basa en aptmero-

RNAi quimeras 59 . Los aptmeros son in vitro -evolved, sintticamente cidos nucleicos
preparados que se unen selectivamente ligandos especficos. Un aptmero de ARN
diseado para unirse al antgeno de membrana especfico de la prstata (PSMA; tambin
conocido como FOLH1) se relacion con un Plk1 -targeted siRNA, y la unin del aptmero
al receptor PSMA dio lugar a la entrega selectiva en clulas de cncer de prstata de
siRNAs que se dirigen genes pro-supervivencia 59 , 60 . La inyeccin intratumoral de la
PSMA- Plk1 -targeted siRNA o PSMA- Bcl2 -targeted conjugados siRNA en un modelo de
ratn con xenoinjerto dado lugar a la activacin de la apoptosis, inhibicin del crecimiento
y la regresin del tumor 59 .

Una conjugacin diferente de un siRNA a los liposomas de vitamina-A-acoplado tuvo xito

en la entrega de siRNAs antifibrticos a las clulas estrelladas hepticas, que se producen
en respuesta a daos en el hgado 61 . En este estudio, los tratamientos mltiples siRNA
dirigidos a genes de chaperonas que codifica colgeno invierten la fibrosis heptica
mediante la prevencin de la deposicin de colgeno y aumento de la supervivencia en
ratas, proporcionando un enfoque teraputico potencial para el tratamiento de la cirrosis
heptica.

Tambin cabe destacar el reciente informe de las bibliotecas de molculas similares a

lpidos (lipidoids) que se pueden seleccionar para la entrega de siRNA para diferentes
tejidos 62 .

entrega Viral
Un medio alternativo de activacin de RNAi es a travs de secuencias de siRNA-promotor
expresado transformados a base de shRNAs o miARN imita. Los genes que codifican estas
estructuras de horquilla se insertan ms comnmente en las columnas vertebrales de
vectores virales bajo el control de la pol II o pol III promotores. Una ventaja potencial de
entrega de vectores es que una sola administracin desencadena la expresin a largo plazo
de la RNAi teraputico. Esto es particularmente apropiado para las enfermedades vricas
crnicas como el VIH y la hepatitis viral.

Los vectores lentivirales se han utilizado con xito para entregar construcciones shRNA en
varios sistemas de mamfero. Por ejemplo, se demostr que la regulacin a la baja de un
oncogn Ras activado por un shRNA entregado-lentiviral como resultado la supresin del
crecimiento tumoral en ratones 63 . Y la baja regulacin de la expresin de una forma
mutante de la superxido dismutasa 1 (SOD1) en modelos de ratn de la esclerosis lateral
amiotrfica retras la aparicin de la enfermedad 64 , 65 . Ms recientemente, un vector
lentiviral se utiliz para entregar un Smad3 -targeted shRNA para la regeneracin de las
clulas satlite y reparacin del tejido muscular de edad en edad y heridos 66 . La expresin
viral-vector de shRNAs tambin se ha explorado en modelos de ratn de enfermedades
neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer 67 .

Para administrar genes al sistema nervioso central, los vectores adenovirales han
demostrado ser muy tiles. Por ejemplo, la inyeccin directa del cerebro de un vector
adenoviral que expresa un shRNA dirigido contra el mRNA que codifica la SCA1 codifica
transcripcin polyQ-albergar de ataxia espinocerebelosa tipo 1 ha demostrado ser un
tratamiento eficaz en un modelo de ratn de este trastorno 68 .

A pesar de los xitos de la entrega viral, es importante tener en cuenta que, aunque algunos
virus no son patgenos, siguen siendo potencialmente inmunognica. Otra preocupacin
importante con esta tcnica es el riesgo de incurrir mutaciones en secuencias virales,
haciendo que la mutagnesis de insercin o activacin de la expresin gnica aberrante. Sin
embargo, los vectores virales pueden transducir clulas que se dividen ambos y que no se
dividen, producir una expresin prolongada del gen teraputico y no necesitan ser
entregados en grandes dosis. En ltima instancia, cualquier gen teraputico cuando se
expresa en grandes cantidades tiene el potencial de causar toxicidad e inmunogenicidad.
Los parmetros crticos tales como la tolerancia, la expresin a largo plazo, la eficacia y la
capacidad de regular la expresin y la orientacin deben tenerse en cuenta a la hora de
elegir un mtodo de entrega. No existe un sistema ideal de entrega para cada aplicacin;
ms bien, el mtodo de entrega tiene que adaptarse a la aplicacin.

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Los ensayos clnicos utilizando RNAi para el tratamiento

de enfermedades humanas
Para una nueva tecnologa, los siRNA se han trasladado a la clnica a un ritmo sin
precedentes. Algunos ejemplos de las enfermedades y las estrategias de siRNA de
segmentacin que estn actualmente bajo investigacin se describen a continuacin.
El primer protocolo siRNA concedi la condicin de nuevo frmaco en investigacin (IND)
y probado en un ensayo clnico en humanos es el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) -targeted siRNA Bevasiranib (Acuity Pharmaceuticals, Filadelfia, Pensilvania)
para el tratamiento de la degeneracin macular relacionada con la edad hmeda (ver Tabla
2 para un resumen de los ensayos clnicos en curso siRNA). Esto implica el crecimiento
excesivo de vasos sanguneos detrs de la retina, y provoca la prdida severa e irreversible
de la visin; que afecta a 1,6 millones de personas en los Estados Unidos solamente, y se
predice que 11 millones de personas en todo el mundo tendrn la enfermedad en 2013. Los
estudios preclnicos de Bevasiranib en ratones mostraron neovascularizacin resultante de
la regulacin a la baja de la expresin del VEGF ocular despus de la inyeccin directa del
siRNA redujo 69 . Este siRNA, el cual se encuentra ahora en un ensayo de fase III, est
tambin en un ensayo clnico de fase II para el tratamiento del edema macular diabtico.
Por la conclusin de estos estudios, varios cientos de pacientes habrn recibido los
tratamientos siRNA.

Tabla 2
Los actuales ensayos clnicos de terapias basadas en el ARNi

Otras dos empresas tambin se estn centrando en los tratamientos a base de siRNA contra
la degeneracin macular: de Merck Sirna Therapeutics (San Francisco, California) con un
siRNA (siRNA-027) que se dirige al receptor de VEGF VEGFR1, y Quark Pharmaceuticals
(Fremont, California), en colaboracin con Silence Therapeutics (Londres y Berln;
previamente SR Pharma), con una excepcin dirigida contra un gen inducible por hipoxia,
RTP801 (tambin conocido como DDIT4), que se sabe que estn implicados en la
progresin de la enfermedad. Este siRNA, RTP801i-14, ha sido licenciada a Pfizer, Reino
Unido, que ahora se est ejecutando un ensayo clnico / IIA fase. Quark farmacuticos
tambin ha recibido el estatus de IND para otro ensayo preclnico, en el que est
actualmente reclutando pacientes. Este ensayo es para un siRNA dirigidos a TP53 ARNm
(que codifica la protena p53), la inhibicin de lo que retrasa la induccin de las vas de
muerte celular y por lo tanto reduce la lesin renal aguda despus de la ciruga.

Calando Pharmaceuticals (Pasadena, California), por su parte, ha iniciado una fase I de

ensayos clnicos para tumores slidos utilizando un ARNsi que se dirige a una subunidad
de la ribonucletido reductasa (RRM2), una enzima necesaria para la sntesis de bloques de
construccin de ADN. Es importante destacar que este ensayo es el primero en utilizar la
entrega mediada por el receptor de siRNAs, que se encapsulan en partculas de
ciclodextrina decoradas con transferrina. Esto se traduce en la captacin por clulas que
expresan el receptor de la transferrina, que est altamente expresado en las superficies de
clulas de cncer.
Los ensayos clnicos realizados por Acuity Pharmaceuticals y Merck Sirna Teraputica
estabilizan con xito las condiciones de los pacientes contra la degeneracin y mejoraron su
visin sin efectos adversos. Estos resultados generaron un gran optimismo para la inyeccin
intravtrea de siRNAs, pero en un impresionante giro de los acontecimientos un informe de
Kleinman et al. demostr que la disminucin observada en la vascularizacin podra ser
una consecuencia no de un efecto-siRNA especfico de la angiognesis, sino ms bien una
activacin no especfica de Toll-like receptor 3 (TLR3) y la posterior activacin de
interfern- y la interleucina 12, el cual, a su vez , regular a la baja VEGF 70 . En otras
palabras, tanto el objetivo y los siRNAs mediada por el control de inhibicin no especfica
de la angiognesis a travs de una interaccin directa de los siRNAs con TLR3. La
captacin celular no es necesario para este efecto, y porque TLR3 est implicado en varias
otras vas celulares el hallazgo ha puesto de manifiesto otro nivel de preocupacin para el
uso clnico seguro de siRNAs.

Alnylam Pharmaceuticals (Cambridge, Massachusetts) es una empresa de siRNA-

teraputica bien establecida cuyo principal candidato siRNA, ALN-RSV01, se encuentra
actualmente en un ensayo clnico de fase II. Esto objetivos siRNA virus respiratorio
sincitial - que afecta a cerca de 300.000 personas cada ao slo en los Estados Unidos -
silenciando la nucleocpside del virus gen 'N', un gen esencial para la replicacin viral.
ALN-RSV01 fue el primer siRNA antiviral para entrar en ensayos clnicos y ensayos
pronto se expandi a los pacientes peditricos. Hasta ahora se ha demostrado que es eficaz
y bien tolerado. Recientemente, Alnylam farmacuticos formaron una alianza exclusiva con
Kyowa para desarrollar y comercializar ALN-RSV01 en Japn y otros pases asiticos.

Tambin en el desarrollo a Alnylam productos farmacuticos son siRNAs dirigidos contra

los genes implicados en la hipercolesterolemia, la enfermedad de Huntington (en una
empresa conjunta con Medtronic de Minneapolis, Minnesota), la hepatitis C (en una
empresa conjunta con Isis Pharmaceuticals en Carlsbad, California), leucoencefalopata
multifocal progresiva ( en una empresa conjunta con Biogen Idec de Cambridge,
Massachusetts) y la gripe pandmica (en una empresa conjunta con la compaa suiza
Novartis).

El Consorcio Internacional Paquioniquia congnita (IPCC), en colaboracin con

transdrmico (Santa Cruz, California), ha desarrollado un siRNA para permitir la correcta
produccin de queratina como un tratamiento para un trastorno de la piel rara llamada
paquioniquia congnita.

El City of Hope National Medical Center en Duarte, California, en colaboracin con

Benitec (Melbourne, Australia), se ha iniciado un estudio de fase I para el tratamiento de
linfoma SIDA. Este ensayo utiliza un promotor Pol III-expres shRNA orientacin del tat
del VIH y los exones de rev compartida. El shRNA se ha incorporado en un vector
lentiviral basado en el VIH, que a su vez se ha usado para insertar el gen shRNA (junto con
otros dos genes anti-VIH basados en ARN) en las clulas madre de la sangre 71 . Las clulas
madre genticamente modificadas han sido infundido en los pacientes VIH-positivos en un
ensayo que utiliza el trasplante autlogo de mdula sea para el tratamiento de los linfomas
relacionados con el SIDA. Cuatro pacientes han sido tratados en este ensayo.
Como se indic anteriormente, las asociaciones se han vuelto muy aceptado en el campo de
la biotecnologa siRNA. Estos consorcios estn aumentando considerablemente el capital
disponible para estos esfuerzos y se estn acortando el tiempo implicado en la
comercializacin de medicamentos a base de siRNA.

Algunas compaas, como Regulus Therapeutics (Carlsbad, California), han optado por
centrarse en los miRNAs como dianas teraputicas. Santaris Pharma en Hrsholm,
Dinamarca, ha comenzado recientemente el primer ensayo de fase I para dirigirse a un
miARN humana (miR-122). En este ensayo, el miR-122 est siendo objeto de regulacin a
la baja con un cido nucleico bloqueado (LNA) anti-miARN (SPC3649). LNA es una
modificacin del esqueleto que potencia la hibridacin del oligonucletido con su diana y
lo protege de la degradacin por nucleasas. El enfoque est destinado a tratar la infeccin
por el virus de la hepatitis C, porque el miR-122 facilita la replicacin de este virus en el
hgado 72 , 73 . Regulacin a la baja de miR-122 tambin es potencialmente til en el
tratamiento de la hipercolesterolemia. MiRNAs dirigidos expresan en el corazn, como
miR-208, que regula la hipertrofia cardiaca y fibrosis 74 , pueden tener una ventaja, ya que
en el campo de la medicina hay una considerable experiencia en la entrega de
medicamentos directamente en este rgano.

Ganancia o prdida de la funcin de los genes miARN se ha relacionado con la aparicin y

progresin de diversas enfermedades 75 - 77 . funcin de la protena puede ser regulada, ya
sea directa o indirectamente por miRNAs, y alteraciones en la expresin de los genes
miARN puede tener profundos efectos en la regulacin de genes. En los casos en los cuales
enfermedad resulta de la expresin de los genes miARN alterado, es concebible que los
niveles normales podran lograrse, ya sea por la orientacin del miRNA especfico si la
expresin es demasiado alta o mediante la entrega de un miARN imitar si la expresin es
demasiado baja. Sin embargo, tendran que ser mejorada para este objetivo se logra la
especificidad y la eficacia de los sistemas de suministro. Por otra parte, la correcta
modulacin de la expresin de los genes miARN objetivo no es una tarea fcil, y no es
claro si uno miARN puede ser dirigido especficamente sin afectar a otros miRNAs de una
misma familia.

Las complejidades de regulacin de miRNAs tambin deben tenerse en cuenta a la hora sea
la ablacin o la restauracin de la funcin de los genes miARN est siendo considerado en
un entorno teraputico. Una sola miARN puede regular los niveles de cientos de protenas
de 78 , 79 , levantando banderas de advertencia sobre las consecuencias de la regulacin
negativa o ectpica expresar incluso una sola especie miARN.

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El problema de seguridad
La aplicacin de siRNAs a la teraputica ha planteado una serie de preocupaciones acerca
de su seguridad. Despus de la excitacin inicial, un nmero de informes subray
inconvenientes potenciales para esta tecnologa prometedora. La primera advertencia fue
realizada por un estudio que registra la muerte de los ratones despus de la expresin
dirigida por el promotor Pol III de shRNAs en el hgado 4 . Los mecanismos exactos que
conducen a la mortalidad estn todava bajo investigacin, pero parecen ser debido al
menos en parte a la saturacin del factor de transporte, exportin 5, que los transbordadores
miRNAs desde el ncleo hasta el citoplasma. En la actualidad hay indicios de que otros
factores que intervienen en el proceso de ARNi tambin pueden ser saturados por la
expresin de alto nivel de siRNAs exgenas, que pueden secuestrar ellos de sus miRNAs
celulares afines. Debido a que cada miRNA celular potencialmente puede modular la
expresin de varios cientos de genes 78 , 79 , alteraciones menores en la va de miRNA
pueden tener importantes consecuencias.

Una de las estrategias para mitigar este problema es usar la menor concentracin posible de
siRNAs que proporciona eficacia teraputica mediante el diseo de los siRNAs exgenos a
ser sustratos Dicer (mediante el aumento de su longitud). Estos ARN entran en la va de
RNAi aguas arriba del RISC en la etapa de Dicer de escisin, lo que facilita pasar el siRNA
a AGO2 para la seleccin de la hebra gua, a menudo resulta en una mayor RNAi a
concentraciones ms bajas que se puede lograr con la entrega exgena de cognado 21
siRNAs -Base 80 - 83 . Aunque no se espera que las pequeas cantidades de siRNAs para
saturar la maquinaria RNAi, que pueden competir con los miRNAs para la incorporacin
selectiva en el RISC 5 . Las consecuencias a largo plazo de este tipo de competencia, son
poco conocidos.

Con el uso de microarrays, se ha vuelto cada vez ms evidente que la introduccin de

siRNAs extranjeros en la clula altera la expresin de genes no diana, as como genes diana
84 , 85
; tan slo seis o siete nucletidos complementarios a la regin de la semilla podra
resultar en un efecto especfico fuera del objetivo 86 a travs de un mecanismo de miRNA-
similares. Debido a que slo microarrays reflejan los niveles de ARNm, que no toman en
cuenta cualquier genes afectados a nivel de traduccin, por lo que en la actualidad no est
claro qu tan extensa el problema de los efectos fuera de la meta es en realidad. Teniendo
en cuenta que la aplicacin de los resultados de siRNAs sintticos en la inhibicin de la
expresin gnica transitoria, especfica fuera de la orientacin puede no ser una
preocupacin importante para muchas aplicaciones clnicas. Sin embargo, las pruebas de
toxicidad adecuado debe tener en cuenta la posibilidad de un siRNA particular, para
apuntar 3 'UTRs de los genes no objetivo.

Algunas estrategias se pueden utilizar en el diseo de siRNA para minimizar el problema

de fuera de la orientacin. Por ejemplo, se ha demostrado que 2'- O $ _ $ Me
Modificaciones 87 o ADN sustituciones 88 en dplex de siRNA puede reducir
significativamente los efectos fuera de objetivo. Tambin sera valioso para mejorar la
selectividad de hebra antisentido, tomando en cuenta la estabilidad termodinmica (ver
'diseos superiores para molculas pequeas') o mediante el bloqueo de la "fosforilacin 5
de la cadena con sentido 89 .

RNAi es un mecanismo ampliamente conservada que originalmente pueden haber

evolucionado para luchar contra las infecciones virales. Como tal, quizs no es
sorprendente que en algunos casos siRNAs pueden actuar como agonistas de los receptores
Toll-like 90 y que los motivos de secuencias especficas, como las regiones ricas y uridina
sine- guano y regiones ricas en uridina, pueden inducir respuestas inmunes celulares 6 , 7 .
La capacidad de un siRNA para estimular respuestas inmunes celulares se basa no slo en
las secuencias especficas, sino tambin en la estructura, el tipo de sistema de
administracin usado y el tipo de clula 7 , 91 . Aunque el potencial inmunoestimulante de
siRNAs podra ser ventajoso en ciertas circunstancias 92 , por lo general es un resultado no
deseado. El hallazgo anteriormente mencionado de la respuesta a la modulacin TLR3 no
secuencia-especfica de VEGF o el receptor de VEGF 70 , as como un informe separado
que muestra que un factor de migracin de macrfagos inhibitoria (MIF) -targeted siRNA
(en un modelo murino) y un no especficos de siRNA de control aument la proliferacin
de clulas de cncer de mama a travs de la activacin de la protena quinasa activada por
ARN de doble cadena (PKR) 93 , plantean serias preocupaciones en la interpretacin de los
resultados de las aplicaciones siRNA in vivo.

A pesar de que an no han alcanzado una solucin universal para evitar los efectos de todo
fuera de objetivo, es previsible que estos problemas se pueden superar mediante el uso de
modificaciones del esqueleto apropiadas, as como sistemas de liberacin que puede
enmascarar los ARN de los receptores de la inmunidad innata sistema 94 .

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mirando hacia adelante

A pesar de la juventud de la tcnica, la lista de enfermedades para las que el ARNi est
siendo probado como un agente teraputico es extensa, e incluye la enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Lou Gehrig, la infeccin por el VIH, la degeneracin macular
relacionada con la edad hmeda, la diabetes tipo 2, obesidad, hipercolesterolemia,
reumatoide artritis, enfermedades respiratorias y cncer. Ya es un negocio multimillonario,
proyecta llegar a $ 1 mil millones en 2010, y los derechos de propiedad intelectual se
convierta en una preocupacin cada vez ms importante en los prximos aos.

Sin embargo, aunque se ha avanzado mucho, todava quedan obstculos que dificultan la
carrera a la clnica. El objetivo ltimo de lograr terapias basadas en el ARNi para
enfermedades potencialmente mortales o debilitantes no puede alcanzarse sin una mejora
de la seguridad, la eficacia y la fiabilidad de los sistemas de suministro de ARNi-gatillo. El
uso de estrategias de administracin dirigida que permita la liberacin sistmica ser un
gran paso hacia el cumplimiento de esta tarea difcil. El desarrollo de nuevos mtodos, de
imagen no invasivas para supervisar la administracin in vivo de siRNAs, como el
etiquetado con tintes de infrarrojo cercano 95 , ayudar a los estudios de biodistribucin y la
captacin tisular.

Aunque an no ARNi es una modalidad teraputica aceptada, el enorme inters en este

fenmeno asegura que pronto testigo de avances rpidos y nuevas aplicaciones para las
terapias basadas en el ARNi. Dada la forma en que el ARNi ha transformado la
investigacin bsica y la velocidad sin precedentes con la que ha llegado a la clnica, los
prximos aos prometen ser emocionantes.