2016/2017

GUA DE PRCTICAS DE VIROLOGA

NOMBRE: ______________________________________
CURSO: ________________________________________
FECHA: ________________________________________

1
NORMAS ESTABLECIDAS PARA LAS PRCTICAS EN EL LABORATORIO

ORGANIZACIN

Los alumnos vendrn organizados el primer da por parejas o tros (segn

apellido). Se les asignar un espacio en el laboratorio que deber
mantenerse hasta el final de las prcticas.

NORMAS GENERALES:
Puntualidad
Asistencia obligatoria: faltas con justificante
Mantener actitud responsable
No comer, beber, fumar ni usar dispositivos mviles
Si ocurre algn accidente, se avisar al/los responsables de las prcticas
VESTIMENTA:
Es necesario y obligatorio el uso de bata de manga larga, guantes y mascarillas
Calzado que cubra todo el pie
Heridas cubiertas aunque se utilicen guantes
HABITOS:
Buen uso de aparatos y material.
Recoger todos los das las pipetas, material propio y residuos
Dejar limpia la zona de trabajo y comunes
Cuidar que los reactivos estn a T adecuada
Marcar los tubos, muestras, geles, etc. con la letra y n de mesa asignados
DERRAMES:
Los pequeos derrames se limpiarn inmediatamente
En los derrames qumicos y/o biolgicos se avisar a los profesores
RESIDUOS
No desechar residuos por los desages
Los residuos irn en las bolsas y recipientes adecuados
No tirar papeles impregnados, tejidos o productos a las papeleras
Si por error se vierte algn producto por el desage, aadir abundante agua
SAPILCADURAS:
Las salpicaduras en piel y/o cara se lavar con abundante agua. En los ojos usar
los lavaojos.
Si las salpicaduras son abundantes en la ropa de trabajo, se retirar con cuidado
la bata, si fuera necesario se usaran las duchas de emergencia

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NDICE

PRCTICA 1. ANLISIS POR CITOMETRA DE FLUJO DE CAMBIOS EN LA EXPRESIN DE

RECEPTORES EN LA SUPERFICIE DE LINFOCITOS INFECTADOS POR DISTINTOS VIRUS 4
1.1. Introduccin 4
1.2. Materiales 5
1.3. Reactivos 5
1.4. Mtodos 5
RESULTADOS DE LA PRCTICA 1 7

PRCTICA 2. TRANSFECCIN POR ELECTROPORACIN DE UN VECTOR DE EXPRESIN DE

LUCIFERASA BAJO EN CONTROL DEL PROMOTOR LTR DEL VIH-1 8
2.1. Introduccin 9
2.2. Materiales 9
2.3. Reactivos 9
2.4. Mtodos: 11
RESULTADOS DE LA PRCTICA 2 13

PRCTICA 3. DETECCIN DEL ANTIGENO p24 EN CELULAS MT2 INFECTADAS POR VIH-1
MEDIANTE WESTERN-BLOT 14
3.1. Introduccin 14
3.2. Materiales 14
3.3. Reactivos 14
3.4. Mtodos 15
RESULTADOS DE LA PRCTICA 3 19

3
PRCTICA 1. ANLISIS POR CITOMETRA DE FLUJO DE CAMBIOS EN LA EXPRESIN DE
RECEPTORES EN LA SUPERFICIE DE LINFOCITOS INFECTADOS POR DISTINTOS VIRUS.

1.1. Introduccin

La Citometra de Flujo es una de las tcnicas de

desarrollo ms espectacular en los ltimos aos,
combina la qumica, la fsica, la informtica y la
biomedicina para estudiar las caractersticas de un grupo
de clulas en forma aislada. Para ello, se usan clulas en
suspensin las cuales pasan a travs de un haz de luz
lser. La interseccin de cada clula provoca la emisin
de una serie de seales luminosas que permite
diferenciar las poblaciones celulares dentro de la
muestra a estudiar, por su tamao relativo, por sus
granulaciones y por su reactividad con anticuerpos
monoclonales fluoresceinados.

La citometra de flujo es una metodologa que permite obtener informacin sobre las
caractersticas fsicas y qumicas de clulas o partculas en suspensin que atraviesan una
fuente de luz (lser). Posee un amplio espectro de aplicaciones, que abarcan desde el
diagnstico clnico (principalmente en el mbito de la Hematologa oncolgica y la
Inmunologa), hasta complejos proyectos de investigacin en el campo de la biomedicina y de
la biologa celular en general.

El desarrollo de los anticuerpos monoclonales, junto con el perfeccionamiento de los

citmetros de flujo, ha permitido el uso de la citometra de flujo en el diagnstico clnico.
Desde el estudio de subpoblaciones linfocitarias CD4+ para monitorizar el desarrollo del VIH,
pasando por el diagnstico de patologas hematolgicas y estudios de ciclo celular (ploidas),
sta es una tcnica de uso rutinario en laboratorios clnicos. La posibilidad de utilizar esta
tecnologa para separar clulas (cell sorting) es una opcin reservada generalmente al mbito
de la investigacin.

1.1.1. Proceso:

La suspensin celular es preparada previamente con anticuerpos monoclonales conjugados con

diferentes fluorocromos (FITC, PE, PerCP, PECy5, APC, etc.) o sondas fluorescentes (PI, DHR,
DiOC,...) y es introducida en el sistema hidrulico de manera que las clulas atraviesen
individualmente la cmara de flujo, donde el haz del lser intercepta las clulas. El contacto del
haz del lser con una clula produce dos tipos diferentes de dispersin: frontal y lateral (90).
La dispersin frontal (Forward Scatter) nos da informacin acerca del tamao celular, mientras
que la dispersin lateral (Side Scatter) nos informa de la complejidad celular. Los fluorocromos
de los anticuerpos monoclonales o sondas presentes en la membrana o el interior celular son a
la vez excitados por la luz del lser y generan fluorescencias que son recogidas por el sistema
ptico para su posterior procesamiento y digitalizacin.

1.1.2. Aplicaciones:

Deteccin de subpoblaciones celulares (inmunofenotipado)

Apoptosis
Ciclo celular
Viabilidad
Ensayos funcionales (metabolismo oxidativo, proliferacin, calcio intracelular, pH,...)

4
 Separacin celular
Ensayos multiplexados (Beads Arrays)

1.1.3. Procedimiento experimental:

Las suspensiones celulares se incuban con anticuerpos monoclonales marcados de forma

fluorescente dirigidos contra protenas celulares especficas permitiendo la unin de forma
especfica a los antgenos frente a los que estn dirigidos. Las clulas teidas entran en la
cmara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de lser, emiten una luz
fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados
filtros y espejos. Estas seales luminosas son recogidas por detectores y la informacin se
integra y analiza adecuadamente por un sistema informtico. El citmetro de flujo detecta las
seales de fluorescencia del complejo antgeno-anticuerpo marcado con el fluorocromo,
permitiendo detectar las poblaciones celulares que presentan el antgeno, adems la
intensidad de fluorescencia de las clulas marcadas es proporcional a la cantidad de sitios
antignicos presentes en la clula. Para evaluar la unin inespecfica del AcMo se prepara un
tubo de control negativo con el control isotpico adecuado.

1.2. Objetivo de la prctica

Los linfocitos y otros leucocitos, as como otros precursores hematopoyticos, presentan

patrones caractersticos de molculas de superficie, que pueden ser aprovechadas como
marcadores para distinguir y caracterizar distintas poblaciones celulares. Sin embargo, estos
marcadores de superficie se pueden ver modificados por la presencia de distintos virus.

Determinar el inmunofenotipo de distintos tipos celulares y observar las modificaciones en la

expresin de los receptores en la superficie de clulas del sistema inmunitario debidas a la
infeccin por distintos virus.

1.3. Materiales

Lneas celulares: Jurkat-Tat, Jurkat, MT2.

PBS 1X
Los anticuerpos monoclonales que vamos a utilizar se muestran en la tabla

ANTICUERPO CONTROL ISOTIPICO

CD3 PE IgG2a PE
CD4 PE IgG2a PE

1.4. Mtodos:

1. Recoger las clulas, 0,5-1X106 clulas aproximadamente por tubo.

2. Lavar con 1ml PBS 1x 1500 rpm 5 minutos
3. Resuspender las clulas con 300 l PBS1x
4. Repartir 100ul de clulas en cada tubo de citometro que ya tendrn 5l del AcMo
deseado (control isotpico)
5. Incubar durante 15 minutos a 4C en oscuridad.

5
 6. Lavar con PBS 1x 1500 rpm durante 5 minutos
7. Resuspender en 500 l de PBS 1x

LINEAS CELULARES

Jurkat E6-1: Linfocitos T CD4+. Todos los linfocitos T (tanto los CD4 como los CD8)
expresan, adems, CD3. Por tanto, esta lnea sera CD3+, CD4+.

Jurkat-Tat: Linfocitos T que deberan ser CD3+, CD4+ pero que debido a la expresin de
la protena Tat del VIH-1 presentan una baja expresin de CD3 y CD4 (CD3-, CD4-).

MT2: Morfologa linfoblastoide. Transformada con HTLV-I. Expresan CD4 pero no

expresan CD3 debido a la infeccin por el virus (CD3- CD4+).

6
RESULTADOS DE LA PRCTICA 1. ANLISIS POR CITOMETRA DE FLUJO DE CAMBIOS EN LA
EXPRESIN DE RECEPTORES EN LA SUPERFICIE DE LINFOCITOS: CARACTERIZACIN
FENOTPICA.

1. Describir el objetivo de la prctica.

2. Adjuntar y explicar los resultados obtenidos.
3. Identificar la lnea celular analizada, segn los resultados obtenidos en el citmetro, y
explicar el motivo de los cambios en la expresin de receptores en superficie, si los
hubiera.

7
PRCTICA 2. TRANSFECCIN POR ELECTROPORACIN DE UN VECTOR DE EXPRESIN DE
LUCIFERASA BAJO EN CONTROL DEL PROMOTOR LTR DEL VIH-1.

2.1. Introduction

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un virus envuelto que contiene una cpside
troncocnica y dos cadenas de ARN de polaridad positiva iguales, no complementarias. Su
genoma codifica por varias protenas, reguladoras y accesorias, y en ambos extremos del
genoma hay una secuencia llamada LTR (Long terminal repeat). En la regin del LTR se unen
factores activadores de la transcripcin del genoma del VIH.

Los factores de transcripcin implicados en la transcripcin de los mRNAs virales pueden tener
dos orgenes diferentes:
Factor viral: la protena regulatora Tat del VIH-1 es un potente transactivador y
elongador esencial para la replicacin viral. Si no hay Tat, la transcripcin viral no se
produce.
Factores celulares: NF-B, NF-AT y SP1 se unen al LTR y colaboran en la transcripcin
del genoma viral dependiente del LTR. No obstante, estos factores solamente son
completamente activos cuando el linfocito T ha sido activado por un estmulo como
PMA (forbol miristato acetato), un ster de forbol con actividad tumorognica.

Trabajaremos con clulas Jurkat, una lnea celular linfoblastoide con cierta activacin basal de
los factores transcripcionales celulares. Por tanto, estas clulas sern capaces de iniciar la
transcripcin viral incluso en ausencia de PMA. No obstante, si Tat se expresa en estas clulas o
son tratadas con PMA, la transcripcin viral aumenta de manera exponencial.

Para probar esta asercin, las clulas Jurkat sern transfectadas por electroporacin con un
vector de expresin del gen reporter Luciferasa bajo el control del promotor LTR del VIH-1. Esto
producir una transcripcin viral basal del gen Luciferasa debido a la activacin residual de los
factores transcripcionales celulares en las clulas Jurkat.
Si las clulas son adems tratadas con PMA, los factores transcripcionales celulares
sern activados completamente y la transcripcin viral aumentar considerablemente.
Si las clulas son adems co-transfectadas con un vector de expresin del factor viral
Tat, ste inducir asimismo un aumento de la transcripcin viral incluso en ausencia de
PMA.

8
La transfeccin es el mtodo utilizado para introducir material gentico (por ejemplo
plsmidos) en el interior de clulas eucariotas. En el caso de esta prctica, vamos a emplear
como mtodo de transfeccin la electroporacin en cubetas (que contienen dos electrodos
separados 4mm el uno del otro), con el objetivo de introducir en las clulas los plsmidos que
queremos transfectar.

2.2. Objetivo de la prctica:

Estudiar la activacin del promotor LTR del VIH-1 en condiciones basales, en condiciones de
activacin (mediante tratamiento con PMA) y en presencia del factor regulador Tat del VIH-1.

Usaremos los plsmidos siguientes:

1. LTR-LUC: plsmido que codifica el enzima Luciferasa bajo el control del promotor LTR del
VIH-1. La Luciferasa es una protena que produce quimioluminiscencia en presencia del
sustrato apropiado.
2. CMV-Tat: plsmido que codifica la protena Tat del VIH-1 bajo el control del promotor del
citomegalovirus (CMV).
3. pCDNA3: plsmido que no codifica por ninguna protena y que se va a usar de control de
carga de plsmidos.
4. pEYFP: plsmido que contiene el gen que codifica la protena fluorescente amarilla (EYFP:
enhanced yellow fluorescent protein) bajo el control del promotor del CMV. Se utiliza como
control de eficiencia de transfeccin.

2.3. Clulas, reactivos y materiales:

Clulas Jurkat
Medio de cultivo RPMI (con suero y sin suero)
Plsmidos
PBS 1X: Buffer utilizado para lavar las clulas (Phosphate buffered saline)
PMA
Buffer lisis de luciferasa 1X: utilizado para lisar las clulas
Sustrato de la luciferasa
Reactivo de Bradford: Da un color azul en presencia de protenas. Se utiliza para
cuantificar protena
Cubetas de electroporacin en 4mm
Electroporador
Luminmetro de tubos: Para cuantificar la seal de luz producida
Espectrofotmetro: Para cuantificar la protena total
Incubador a 37C, 5% de CO2
Tubos Falcon de 15 mL
Placas de 12 pocillos
Placas de 96 pocillos
Pipetas
Centrfuga

9
 SCHEME

Lavar el
pellet con
Sobrenadante PBS1X
1500 rpm, 5 min

Pellet
5.106 clulas Jurkat

Transfectar

5g
5g
plsmido
plsmido
LTR-LUC
LTR-LUC
5g control
plsmido 5g
pCDNA3 Jurkat plsmido Jurkat
CMV-Tat

Ambas cubetas contienen 0.25g pEYFP

Una vez transfectadas, las clulas se depositan en una p12, se
dividen y se aade PMA a uno de los pocillos.

- PMA + PMA
LTR-LUC + LTR-LUC +
1ml de pCDNA3 pcDNA3
RPMI

LTR-LUC +
LTR-LUC +
CMV-Tat
CMV-Tat

Placa de 12 pocillos
Incubar 24-48h
a 37C

10
Despus de la incubacin, las clulas se dividirn:

1. Parte de las clulas se analizarn mediante citometra de flujo para determinar la eficiencia
de la transfeccin.
2. El resto de las clulas se lisarn y la actividad Luciferasa se medir en un luminmetro
despus de aadir el sustrato apropiado.
3. La concentracin de protena se medir mediante espectrofotometra utilizando el mtodo
de Bradford.
4. Los datos de la actividad luciferasa se normalizarn segn la concentracin de protena y la
eficiencia de la transfeccin.

2.4. Mtodos:

1. Recoger las clulas Jurkat centrifugando a 1500 rpm, 5 min.

2. Lavar las clulas con PBS 1x para eliminar todos los restos de medio con suero (el suero
inhibe la transfeccin) y volver a centrifugar a 1500 rpm, 5 min.
3. Dejar el pellet seco.
4. Resuspender el pllet en 350 uL de medio RPMI sin suero.
5. Segn el nmero de clulas (5x10 6), calcular la cantidad de plsmido que hay que aadir
por cubeta (todos los plsmidos a 1g/1x106 clulas excepto pEYFP 0.25/g/1x106).

Clculos:

6. Poner los plsmidos en las cubetas, depositando la gota sobre la pared de la cubeta
7. Aadir las clulas resuspendidas en el medio sin suero en las cubetas de electroporar
8. Mezclar muy suavemente, con cuidado de no generar burbujas
9. Incubar 1 min.
10. Transfectar en el electroporador con las siguientes condiciones:
a. 280 V, 1500 uF, R
b. Dar un solo pulso
11. Incubar 1 min.
12. Resuspender las clulas de cada transfeccin en 2ml de RPMI y dividirlas en dos pocillos en
una placa de 12 pocillos (p12) con un volumen final de 1ml por pocillo.
13. Aadir 1L de PMA en uno de los dos pocillos de cada transfeccin.
14. Incubar las clulas 24-48h en el incubador a 37C.

11
Pasadas 24-48h, recoger las clulas y medir la actividad luciferasa:

1. Recoger las clulas en cultivo centrifugando a 1500 rpm, 5 min.

2. Resuspender el pellet con PBS 1x y dividir las clulas en dos eppendorfs:
a. Eppendorf 1: centrifugar las clulas 1500rpm, 5 min y resuspender en 300l
PBS1x/PFA1% para fijar las clulas. Analizar la expresin EYFP mediante citometra
para determinar el porcentaje de eficiencia de transfeccin.
b. Eppendorf 2: centrifugar las clulas a 1500 rpm, 5 min y resuspender en 50l de
buffer de lisis de Luciferasa. El buffer lisar las clulas y la luciferasa se liberar al
sobrenadante. La actividad Luciferasa se medir mediante quimioluminiscencia en
un luminmetro.
3. Incubar el pellet con el buffer de lisis a 4C durante 10 min en agitacin.
4. Centrifugar a 14.000 rpm, 5 min y tendremos un pellet con debris celular y un
sobrenadante que contiene las protenas celulares, entre ellas la luciferasa.
5. Medir la actividad luciferasa mezclando 20l del sobrenadante + 40l del sustrato de
luciferasa.
6. La actividad luciferasa se mide en unidades relativas de luz (RLUs).
7. Para normalizar la seal de luciferasa, la concentracin de protena en las muestras se
medir por colorimetra utilizando el mtodo de Bradford:
a. Mezclar 1l del sobrenadante con 99l del reactivo de Bradford en una placa de 96
pocillos e incubar en oscuridad durante 10 min.
b. Leer la densidad ptica de cada muestra en un espectrofotmetro.
c.
8. La normalizacin de la seal de luciferasa se realizar dividiendo la seal luminiscente
obtenida en el luminmetro por la concentracin de protena total obtenida mediante
Bradford.
9. El porcentaje de eficiencia de transfeccin debera ser muy similar entre las distintas
muestras.

12
 RESULTADOS DE LA PRCTICA 2: TRANSFECCIN POR ELECTROPORACIN DE UN VECTOR DE
EXPRESIN DE LUCIFERASA BAJO EN CONTROL DEL PROMOTOR LTR DEL VIH-1

1. Adjuntar los resultados del anlisis de las clulas transfectadas en la siguiente table:

Concentracin de
Luciferasa Luciferasa/conc %EYF
Muestras protena total LUC/prot/%EYFP
(RLUs) protena total P
(OD)

pcDNA3

pcDNA3 + PMA

CMVTat

CMVTat + PMA

2. Explicar los resultados observados.

3. Dar una conclusin del experimento.

13
Prctica 3. DETECCIN DEL ANTIGENO p24 EN CELULAS MT2 INFECTADAS POR VIH-1
MEDIANTE WESTERN-BLOT.

3.1. Introduccin

El Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus que causa el sndrome de

inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El VIH infecta principalmente clulas del sistema
inmunolgico humano: clulas T CD4 +, macrfagos y clulas dendrticas. El genoma del VIH-1
codifica protenas estructurales del virin. El gen gag codifica la poliprotena precursora
Pr55Gag. Durante su maduracin, Pr55Gag es escindida por la proteasa viral, originndose las
protenas matriz (p17), cpside (p24), nucleocpside (p7) y protena p6.

Genoma VIH

Lipoproteina Pr55Ga

Maduracin

3.2. Objetivo

El objetivo de la prctica es comparar los niveles de lipoprotena Pr55Gag (p17, p24, p7 y p6) y
-actina en clulas MT2 (linfocitos transformados con HTLV-I) no infectadas e infectadas
mediante western-blot.

3.2.1. Procedimiento

Un cultivo de clulas MT2 se dividi en dos experimentos:

1. Una parte permaneci en cultivo sin infectar (control negativo).

2. Otra parte se infect con VIH-1 durante 48 h.
3. El virus sobrante de la infeccin se inactiv a 65C durante 1 hora.

Transcurrido este tiempo se procedi a la extraccin de las protenas totales utilizando un

buffer de lisis comercial. Estos extractos de protena total se fraccionarn mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida, se transferirn a una membrana de Hybond-ECL y se
marcarn con diferentes anticuerpos.

3.4. Reactivos y materiales:

Extractos de protena total de clulas MT2 no infectados e infectados

Buffer de carga (3x)
Termobloque 95C

14
 Cubeta electroforesis
Gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) al 7,5%
Buffer de electroforesis (TGS-1x: Tris-base 25mM, Glicina 192mM, 0,1% SDS)
Marcador de peso molecular conocido
Papel de transferencia
Membrana transferencia de nitrocelulosa
Buffer transferencia (glicina 192mM, Tris-base 25 mM y metanol 20%)
Transferidor semihumedo
Buffer bloqueo (Leche semidesnatada 5%, tween-20 1%, PBS1x)
Tampn fosfato salino (PBS)
Tween-20
Anticuerpo primario anti-p24
Anticuerpo primario anti-actina
Anticuerpo secundario goat anti-mouse conjugado con HRP (Horseradish Peroxidase)
Reactivo revelado por quimioluminiscencia
Mquina de revelar

3.4. Mtodos:

3.4.1. Preparacin de los geles

Gel separador (7,5%): Ctodo (-)

1,8 mL Gelling Buffer

1,4 mL Acrilamida 40%
4,3 mL H2O Gel Concentrador
90 L APS 10%
4,5 L TEMED Gel Separador

Gel concentrador (3,75%):

900 L SGB
338 L Acrilamida 40%
2,4 mL H2O Anodo (+)
60 L APS 10%
3 L TEMED

3.4.2. Preparacin de las muestras

15
 Cada muestra (MT2 sin infectar, MT2 infectadas y virus inactivado) se utilizar para hacer
dos marcajes: p24 y actina. Por ello tenemos que preparar cada extracto por duplicado
incorporando a tubos eppendorf de 0,5l las siguientes cantidades en microlitros:

EXTRACTOS PROTEICOS H2O BUFFER CARGA 3X Vf

MT-2 25
MT-2 INFECTADAS 25
VIH 25

Desnaturalizacin protenas: 97C, 3min.

Cargar las muestras desnaturalizadas en cada pocillo correspondiente (20 l) y el marcador
de peso molecular (7l). Utilizar el siguiente orden:

Pocillo 2 Pocillo 3 Pocillo 4 Pocillo 5 Pocillo 6 Pocillo 7 Pocillo 8 Pocillo 9

MT-2 MT-2
MT-2 Virus Marcador Marcador MT-2 Virus
infectadas infectadas

20 20 20 5 5 20 20
20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3.4.3. Electroforesis

120V, 1 hora.
Usando buffer TGS1x.

3.4.4. Transferencia

16
 Empapar la membrana y los papeles de transferencia en buffer de transferencia dentro de
las carcasas azules.
Empapar el aparto de transferencia con buffer de transferencia y colocar una mscara de
plstico que cubra toda la superficie del transferidor excepto la zona donde ir nuestro gel.
Preparar el sndwich de transferencia en el siguiente orden: 2 papeles, 1 membrana,1
gel y 2 papeles:

Arriba

Abajo

Transferir
gel
(40mA/gel, O/N).

3.4.5. Bloquear membranas

Bloquear la membrana con las protenas transferidas en 25mL Buffer bloqueo (Leche
semidesnatada 5%, tween-20 1%, PBS1x), 30 min, en agitacin, temperatura ambiente.

3.4.5. Marcaje

Cortar la membrana entre los dos marcadores para marcar cada membrana de manera
independiente.
Incubar con el anticuerpo primario (anti-p24, anti--actina):
- Diluir los anticuerpos 1/500 en buffer bloqueo en la siguiente proporcin: 1ml de
Buffer bloqueo + 4ml de PBS-Tween.
- Incubar durante 1 hora aproximadamente, temperatura ambiente y agitacin.
Lavar con 10ml PBS1x-Tween, 5min, agitacin.
Lavar con 10 ml de PBS1x, 5 min, agitacin.
Incubar con el anticuerpo secundario:
- Diluir el anticuerpo anti-mouse 1/5000 en buffer bloqueo en la siguiente
proporcin: 1ml de Buffer bloqueo + 4ml de PBS-Tween.
- Incubar durante 30min, temperatura ambiente y agitacin.
Lavar con 10ml PBS1x-Tween, 5min, agitacin.
Lavar con 10 ml de PBS1x, 5 min, agitacin.

3.4.6. Revelado

Colocar las membranas en el soporte de la mquina de revelado.

17
 Preparar el reactivo de quimioluminiscencia: mezclar 0.5 mL de reactivo Super Signal West
Pico Stable Peroxide Solution (blanco) y 0.5 mL de reactivo Super Signal West Pico
Luminol/Enhancer Solution (marron).
Inmediatamente aadir a cada membrana 1 ml de la mezcla del reactivo.
Revelar la membrana en el sistema de revelado quimioluminiscente.

18
RESULTADOS DE PRCTICA 3: DETECCIN DEL ANTIGENO p24 EN LINFOCITOS INFECTADOS
POR VIH-1 MEDIANTE WESTERN-BLOT

1. Indica el objetivo de la prctica.

2. Adjunta y explica los resultados obtenidos en el anlisis por western blot.
3. Indica una conclusin del experimento.

19