TEMA 6.

I: MUTACIN SELECCIN
DESARROLLO DE CEPAS

Los MOTIVOS del desarrollo de cepas:

1. Incrementar la produccion. Alterando la regulacion; alterando la permeabilidad o creando sistemas

que expulsen el producto; incrementar la resistencia a su propio AB o a un metabolito
intermediario (ya que a veces no resisten laa presion del AB).

2. Propiedades fermentativas mejoradas. Sin pigmentos, que tengan pocas necesidades de

oxigeno,que no produzcan espuma, que sea capaz de crecer en sustratos baratos.

3. Productos finales unicos. En metabolitos secundarios.

4. Biosintesis de nuevos productos. Usar la ingenieria genetica para obtener AB y metabolitos que
nunca habian sintetizado esos MO (como puede ser la insulina humana sintetizada por e.coli

- MTODOS
Mutacin-seleccin
Recombinacin
Ingeniera genetica: Tecnologa del ADN recombinante "in vitro"

1.- Bases moleculares de la mutacin

Mutacin: es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nuclecos contenidos en el

genoma de un organismo.

Mutaciones espontneas:
Radiaciones naturales
Errores durante la Replicacin (10-7-10-11)
Mutaciones inducidas por mutgenos:
Metabolitos Secundarios (10-5-10-3)
Mutantes Auxotrofos (10-2-10-1)

Recombinacin Gentica: es el proceso por el cual los elementos genticos contenidos en dos
genomas separados se juntan en uno slo (genes, conjunto de genes, cromosomas).

Frecuencia de Mutacin: proporcin de mutantes en la poblacin.

1. 2.- Mecanismos mutacionales

1.-Cambios premutacionales
Emparejamiento incorrecto
Dmeros de pirimidina
Alteracin qumica de bases
Alquilacin, desaminacin
Entrecruzamiento entre cadenas complementarias
Intercalamiento de mutgenos
Ruptura de una cadena
Ruptura de las dos cadenas
Insercin (transposones)
 2.-Procesos de reparacin
Fotorreactivacin
Reparacin por escisin: dao ultravioleta,
Daos alquilantes y deaminados
Reparacin postreplicativa por recombinacin
Reparacin SOS: El mecanismos SOS es un mecanismo de emergencia, es inducido a diferencia
de los otros, cuando se encuentran con daos genticos, repara para que la clula sea viable aunque
comete muchos errores ya que a veces repara sobre vacio, y entonces los errores pasan como
material gentico estable a la siguiente generacin, como mutacin

3.-Mutacin
Fracaso parcial del mecanismo de reparacin Mutantes

2.- Mutgenos

I. Mutgenos qumicos
a. Anlogos de bases (5-bromouracilo que se empareja de forma incorrecta)
b. Agentes que reaccionan con el DNA (producen alquilaciones, hidroxilaciones, aminaciones... y
alteran las bases y producen errores.)
c. Agentes Intercalantes (el mas conocido es el bromuro de etidio, colorante que se intercala
entre ambas cadenas de DNA estabilizandola, cuando este se tiene que copiar, en la zona
donde esta se crea un hueco)

II. Mutgenos fsicos

a. Luz Ultravioleta
b. Radiacin Ionizante con mas energia q la luz uv, ya q ionizan los componentes y les hace
reactivos (entrecruzamiento de cadenas, ruptura fisica...) ej: rayos X.

III. Mutgenos biolgicos

a. Elementos transponibles, un transposon (trozo de DNA que se copia y salta a otra zona del
genoma,ademas son faciles de marcar)
b. Mutagnesis dirigida

Rango (saber que produccion obtenemos), en la natural no perdemos nunca la prouccion de

clortetraciclina; con el resto si; los radiacion UV y los NTG son los que mas producen

Clase mas frecuente (nos interesa que la moda sean mutantes superproductores). Los mas de
radiaciones utravioleta

Frecuencia de cepas con mayor productiivdad, en la natural es bajo, con la uv es muy alta y la mejor.

NTG: agente alquilante mas potente (junto con UV da los mejores resultados)
Mostazas nitrogenadas

MUTACION SELECCION: los pasos de mejor donde sale que tipo de mutageno se uso para Penicillum
notatum. En la ultima etapa se uso sistematicamente la mostaza. se paso de 3 a 7000 mg
3.- Tcnicas desarrollo de cepas por mutacin-seleccin

1.-Tcnica de seleccin frente a anlogos o antimetabolitos

2.-Tcnica de seleccin de revertientes
3.-Tcnica de seleccin de auxotrofos
4.-Tcnica de seleccin por mutagnesis secuencial
5.-Tcnica de seleccin por comutacin
6.-Mutasntesis (biosntesis mutacional)
7.- Cosntesis
___________

1.- Tcnica de seleccin frente a anlogos.

Un anlogo estructural es una sustancia qumica con una estructura similar que mimtica perfectamente
a un producto intermediario pero no es esa estructura.
Un anlogo estructura en una ruta de produccin de aminocidos es un D-aminocido, funcionan como
reguladores, pero no sirven estructuralmente porque no se puede incorporar a la protena, por lo que slo
cumple su funcin reguladora.

2.- Tcnica de seleccin de revertientes.

Tcnica muy utilizada para la produccin de antibiticos.
Partiendo de la cepa parental (C1) que produe antibiotico la
muto, elegimos el que no produce AB, a este le vuelvo a mutar
y seleccionamos los que si producen AB, con una frecuencia
muy alta estos suelen ser mucho mas productores que el
primero.
Un revertiente verdadero es aquel en la que se produce una
mutacin en el mismo punto pero de sentido contrario, es decir,
que revierte a la original.
Con el segundo agente mutageno se va a provocar una
mutacin puntual que revierta la primera mutacin, pero esto
es muy improbable. Lo habitual es que se tenga una segunda
mutacin en otro gen que da lugar a una nueva conformacin
de la protena que altera su funcin compensando la primera
mutacin. Es decir, se recupera la funcin de la protena y se
compensa la mutacin que alteraba el proceso.
Esto afecta al centro alostrico de la protena, esto es lo que
hace que estos dobles mutantes hagan que se gane en cuanto
a la produccin de antibitico.
3.- Auxtrofos
Objetivo: lisina -
Pasos a seguir: coger un medio de cultivo lquido y
crecer MO para ponerlos en contacto con el agente
mutgeno y se esperan dos generaciones para que se
generen los mutantes.
Se coge una alcuota de esta poblacin y la pongo en un
medio de cultivo que rena una serie de caractersticas
especiales (medio mnimo (MM) al que le pongo todos
los factores de crecimiento que necesita una clula para
crecer menos lisina).
Para enriquecer este cultivo en este tipo de mutantes
tengo que poner un antibitico que acte slo sobre los
MO que estn creciendo, por ejemplo, la penicilina que
acta sobre la pared celular y as acabo con todos los
que estn creciendo, excepto con los auxtrofos de
lisina, que no estn creciendo porque no hay lisina.
Posteriormente recupero los MO que quedaron y elimino
los que no me interesan y pongo en un medio que slo
contenga lisina.

4.- Tcnicas dirigidas.

Dirigir nuestras mutaciones a los genes que nos
interesan.
Se busca obtener un cultivo en el que todas las clulas
estn en el mismo momento del ciclo -> cultivo
sincrnico. Auxotrofos

NTG: Muy eficiente. Es un agente alquilante. Tiene una predileccin y se une mucho ms fuerte. Muta
ADN de cadena sencilla para dar de cadena doble.
Con estas dos premisas, se disean las tcnicas dirigidas.
Que consisten en el mapeo de genes, se conocen los tiempo de replicacin de la bacteria y que genes se
van replicando en cada tiempo y se van aadiendo los agentes mutgenos necesarios para cada gen.
Necesito saber muy bien, la posicin de los genes en el cromosoma y la ruta de biosntesis.

5.- Tcnica de seleccin por comutacin.

La replicacin es bidireccional simtrica, por lo que si no consigo detectar los genes que me interesan,
detecto ms fcilmente los simtricos de la horquilla de replicacin, as es ms sencillo encontrar los que
necesito en cuanto al tiempo de replicacin.

6.- Mutasntesis
La penicilina esta diseada para eliminar de la clula tres aminocidos que pueden ser txicos cuando se
acumulan. La penicilina se forma por condensacin, un tripptido.
Productos del metabolismo primario se acumulan y hay que eliminarlos para que no intoxiquen. Y para
ello se utilizan las rutas del metabolismo secundario que tiene como funcin unirlos y algunos de ellos
tienen funcin de antibitico.
Si yo bloqueo un metabolito primario, la clula no produce el antibitico, la clula ha mutado porque le
falta un elemento. Esto se comprueba mediante el medio de cultivo, si aades este nutriente se vuelve a
conseguir el producto final. Pero en el medio de cultivo no se va a poner el mismo metabolito, sino un
anlogo estructural que va a hacer que el antibitico obtenido tenga caractersticas mejores.
7.- Cosntesis
Cuando no se puede desregular una ruta metablica,
tenemos que aplicar esta tcnica.
Se obtienen dos mutantes cada uno con la ruta truncada
y la suma de ambos nos da una ruta completa. En el
primer mutante se bloquea la enzima quedndose sin
producto final y as se acumula el producto intermediario
C. El segundo mutante se bloquea justo en el paso
anterior
(B --> C), por ello su ruta se inicia en el producto
almacenado por el mutante 1.
Si cultivo ambos el segundo utiliza el metabolito que est
en el medio producido por el primero para acabar
produciendo el ltimo que se acumula, sin alterar el sistema de regulacin de la ruta en ambos mutantes.
Tema 6. II
Mejora de cepas por recombinacin

1. Objetivos
2. Recombinacin gentica en bacterias
I. Transformacin
II. Transduccin
III. Conjugacin
3. Recombinacion gentica en hongos
4. Fusin de protoplastos.
I. Recombinacin sexual
II. Recombinacin parasexual

_____________

1. Objetivos
Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos mtodos.
Eliminar mutaciones indeseables que tienen efectos pleiotrpicos negativos para el rendimiento (vitalidad
disminuida)
Eliminar en las cepas de alta produccin cambios fisiolgicos indeseados: produccin de espuma.
Necesidades nutricionales.

2. Recombinacin gentica:
Es el proceso por el cual los elementos genticos contenidos en dos genomas separados se juntan en
uno solo.
Es una forma efectiva de aumentar la variabilidad gentica.

Mtodos naturales y artificiales.

- Objetivo:
Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos mtodos
Eliminar mutaciones indeseables que tienen efectos pleiotrpicos negativos para el rendimiento (vitalidad
disminuida)
Eliminar en las cepas de alta produccin cambios fisiolgicos indeseados: Produccin de espuma
Necesidades nutricionales

METODOS NATURALES

Recombinacin gentica en hongos

- Recombinacin sexual:
 - Recombinacin parasexual: tenemos dos individuos en crecimiento que son haploides. Si se ponen
juntos en una placa las hifas de los hongos se entrecruzan y se unen produciendose anastomosis, se
unen los citoplasmas de las dos lneas parentales haploides y se generan unas clulas curiosas en las
que coexisten los ncleos de los dos hongos.
Clula con varios ncleos de diferente procedencia y ambos haploides: heterocarionte. De una clula
de este tipo van a salir esporas de un parental y otras del otro parental y ambas haploides. Pero con
cierta frecuencia se produce cariogamia, es decir, dos ncleos haploides se unen para dar lugar a un
ncleo diploide estable, y como consecuencia se produce un entre cruzamiento de los cromosomas y
dar lugar luego a hifas diploides que podrn generar mediante reduccin meitica hifas haploides que
estn recombinadas.

Recombinacin gentica en bacterias.

Tenemos tres sistemas en la que una parte del genoma de una clula donadora puede pasar dentro de
una clula receptora y una vez dentro recombina. Hay diferencias en cuanto a la transferencia del ADN.
La recombinacin siempre es homloga.
Nunca en procariotas se puede transferir el material gentico completo de una clula a otra. En
eucariotas puedo coger el genoma completo de una clula y unirlo al de otra.

Inconvenientes recombinacin natural:

1-Frecuencia baja
2-No son corrientes en microorganismos industriales.

MTODOS ARTIFICIALES: Fusin de protoplastos

Mtodo
Eliminacin de paredes celulares.
Fusin: PEG, electrofusin
Regeneracin de la pared. Disear medio y condiciones.

Mediante un detergente o un agente tensioactivo se elimina la pared, membrana o quitina. Tengo dos
clulas desnudas y mediante PEG las uno, y pueden ocurrir dos cosas, que se generen dos clulas con
dos ncleos distintos, o que en el caso de los eucariotas se produzca cariogamia o en los procariotas
recombinacin.
 Ventajas:
La frecuencia de recombinacin se incrementa de una forma espectacular.
Aplicable a eucariotas y procariotas
Recombinacin intraespecfica, interespecfica
En procariotas: contacto entre genomas completos

Recombinacin natural vs fusin de protoplastos

- Frecuencia de recombinacin baja
- No son corrientes en MO industriales.