Sie sind auf Seite 1von 14

Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias
Qumicas

BIOLOGIA MOLECULAR

TEMA:

MULTIPLEX PCR

INTEGRANTES

ESTEFANIA ELIZABETH MORENO PLUAS


KATTY XIMENA MUOZ VALVERDE
ANGELA VICTORIA NARVAEZ ALCIVAR
JOSELYN KATHERINE NAULA ORRALA

DOCENTE:

Ms.C GUSTAVO SAL ESCOBAR. BLGO.

4tO SEMESTRE GRUPO C

MAYO - OCTUBRE 2016

1
NDICE

Introduccin ........................................................................................................ 3

Multiplex PCR..................................................................................................... 4

Fundamento .................................................................................................... 5

Parmetros de diseo de cebadores para PCR multiplex............................... 6

Ventajas de Multiplex PCR ............................................................................. 6

Aplicaciones .................................................................................................... 7

Glosario ............................................................................................................ 10

Resumen .......................................................................................................... 11

Preguntas ......................................................................................................... 13

2
Introduccin
La Multiplex PCR es una tcnica de biologa molecular generalizada para la
amplificacin de mltiples objetivos en un nico experimento de PCR (Shipley,
s.f.).

De acuerdo con Shipley (s.f.) indica que:

En un ensayo de multiplexacin, ms de una secuencia diana puede ser


amplificado mediante el uso de mltiples pares de cebadores en una mezcla de
reaccin. Como una extensin para el uso prctico de PCR, esta tcnica tiene el
potencial de producir un ahorro considerable en tiempo y esfuerzo en el
laboratorio sin comprometer la utilidad del experimento.

La Multiplex PCR tiene aplicacin en todas las reas donde se haga uso de la
biologa molecular.

En 2004, lvarez, Roth mencionan la importancia que tiene la tcnica de


Multiplex PCR en la microbiologia:

La introduccin de mtodos de biologa molecular en los laboratorios de


microbiologa clnica supone un gran apoyo a la hora de obtener diagnsticos
sensibles y especficos en el menor espacio de tiempo posible. Estos mtodos
no sustituyen, sino que complementan los ya usados mtodos microbiolgicos
tradicionales. El anlisis integrado de todos ellos est llevando a resultados ms
fiables y eficaces. De entre todas las tcnicas moleculares utilizadas, la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) ha adquirido un gran valor diagnstico,
permitiendo la deteccin de agentes etiolgicos, y de sus genotipos de virulencia
y resistencia, con gran sensibilidad y rapidez. Desde hace algunos aos, ha
tomado gran inters el desarrollo de las denominadas PCR mltiplex (p.72).

3
Multiplex PCR
Objetivos
Objetivo general

Conocer el fundamento en que se basa la tcnica Multiplex PCR.

Objetivos especficos

Conocer los parmetros de diseo de cebador para Multiplex PCR.


Enumerar las ventajas de la tcnica Multiplex PCR.
Indicar las aplicaciones de la tcnica de Multiplex PCR.

Desarrollo
Tcnica de PCR permite la deteccin
simultnea de ms de una secuencia de
genomas diferentes en una sola reaccin
mediante el empleo de dos o ms parejas
de cebadores. Todos los cebadores
debern reaccionar a una Temperatura de
fusin (Tm) similar, dentro de un rango de
+/-5C. Los tamaos de los productos
amplificados de la PCR debern ser
tambin semejantes pero distinguibles,
entre unos valores de 200 a 500 pares de
bases (pb). Imagen 1 Mltiplex PCR.
En la PCR mltiple, lo que se persigue es amplificar simultneamente en un
nico tubo distintas secuencias especficas o secuencias blanco o dianas, lo cual
necesariamente implica que los reactivos mezclados y el programa utilizado
sean suficientes y adecuados para permitir la deteccin de cada diana y no inhibir
la de las dems. Con este fin, algunos parmetros, como la concentracin de
magnesio y de primers, y el tipo y la cantidad de ADN polimerasa, pueden
ajustarse experimentalmente. Para otros, en cambio, debe realizarse un diseo
exhaustivo previo (Annimo, 2013).

4
En el caso de los cebadores y el programa de temperaturas utilizado, es
necesario tener en cuenta varias premisas:

a) Escoger o disear oligonucletidos que no interaccionen entre s, es decir,


que no formen dmeros;
b) Que tengan temperaturas de alineamiento similares;
c) Que cada pareja amplifique una nica secuencia diana, y
d) Que generen amplicones (producto obtenido de la reaccin de PCR) de
tamao suficientemente diferente para separarlos y diferenciarlos tras la
amplificacin.

Fundamento
Segn Markoulatos, Siafakas, Moncany (2001) indican que:

La PCR Mltiplex consta de varios conjuntos de cebadores dentro de una


nica mezcla de PCR para producir amplicones de tamaos que son especficos
para varias secuencias de ADN diferentes. Aunque no est claro si hay un lmite
terico para el nmero de secuencias que pueden amplificarse simultneamente,
las limitaciones en el establecimiento de condiciones para reacciones
especficas e interpretables generalmente limitan el nmero de secuencias diana
tiles (p.48).

En ao 2000, Elnifro, Ashshi, Cooper, Klapper sealan que el desarrollo de la


PCR Mltiple debera seguir un enfoque racional para sus condiciones, tales
como la compatibilidad entre los cebadores dentro de la mezcla de reaccin de
tal manera que no haya interferencias entre ellos, lo cual es de gran importancia
tcnica (p.561). Por lo tanto, el diseo de los conjuntos de cebadores de
acuerdo con unos parmetros claramente identificados es esencial para una
amplificacin especfica con alto rendimiento (Shipley, s.f.).

Las temperaturas de hibridacin para cada uno de los conjuntos de cebadores


deben ser optimizadas para que puedan funcionar correctamente dentro de una
sola reaccin, utilizando los pares de cebadores que resulten en productos de
PCR que pueden ser separados y visualizados claramente mediante
electroforesis en gel o hibridacin de sondas con mxima especificidad (Elnifro,

5
Ashshi, Cooper, Klapper, 2000, p.561). Alternativamente, si los tamaos de los
amplicones se superponen, los diferentes amplicones pueden diferenciarse y
visualizarse usando cebadores que se han teido con diferentes colores de
marcas fluorescentes (Hayden, Nguyen, Waterman, Chalmers, 2008,p. 9).

Parmetros de diseo de cebadores para PCR multiplex


Shipley (s.f.) indica que el diseo de conjuntos de cebadores especficos es
esencial para una reaccin multiplex. Las importantes consideraciones de diseo
de cebadores descritos a continuacin son una clave para la amplificacin
especfica con alto rendimiento.

1. Longitud del cebador


Ensayos Multiplex PCR implican el diseo de un gran nmero de
cebadores, por lo tanto, se requiere que el cebador diseado debe ser de
longitud apropiada. Por lo general, se utilizan cebadores de corta longitud,
en el intervalo de 18-22 pares de bases.
2. Temperatura de fusin (Tm)
Cebadores con Tm similares, preferiblemente entre 55C - 60C se
utilizan. Para las secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan
cebadores con una Tm ms alta (preferiblemente 75C - 80C). Una
variacin Tm de entre 3C - 5 C es aceptable para los cebadores usados
en una piscina.
3. Especificidad
Es importante tener en cuenta la especificidad de los cebadores
diseados para las secuencias diana, mientras se prepara un ensayo
mltiple, sobre todo porque existe competencia cuando mltiples
secuencias diana estn en un solo recipiente de reaccin.
4. Evitar la formacin de dmero de cebadores
Los cebadores diseados deben ser revisados para la formacin de
dmeros de cebadores, con todos los cebadores presentes en la mezcla
de reaccin. La dimerizacin conduce a la amplificacin inespecfica.

Ventajas de Multiplex PCR


Shipley (s.f.) indica algunas ventajas de la tecnica:

1. Controles internos

6
Los problemas potenciales en un simple PCR incluyen falsos negativos
debido a la falta de reaccin o falsos positivos debido a alguna
contaminacin. Los falsos negativos a menudo se revelan en ensayos
multiplex, porque cada amplificacin proporciona un control interno para
los otros fragmentos amplificados.
2. Eficiencia
El gasto de los reactivos y el tiempo de preparacin es menor en una PCR
multiplex que en los sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR. Una
reaccin mltiple es ideal para la conservacin de la polimerasa que es
costosa y de plantillas con escasa cantidad.
3. Calidad del Template
La calidad del template se puede determinar de manera ms eficaz en
una PCR multiplex que en una reaccin simple de PCR.
4. Cantidad del Template
La amplificacin exponencial y los estndares internos de PCR multiplex
se puede utilizar para evaluar la cantidad de una plantilla determinada en
una muestra. Para cuantificar las plantillas con precisin por PCR
multiplex, la cantidad de plantilla de referencia, el nmero de ciclos de
reaccin, y la inhibicin mnima de la duplicacin terica de producto para
cada ciclo deben tenerse en cuenta.

Cultek (2006) menciona que la tcnica PCR Multiple tiene las siguientes
ventajas:

Se pueden testar grandes regiones de la secuencia del DNA en busca de


alteraciones o modificaciones.
Se pueden testar segmentos no relacionados del genoma diana.
Se pueden incluir controles internos de amplificacin de la muestra.
Se puede testar una misma muestra contra diferentes patgenos.

Aplicaciones de Multiplex PCR


Sistemas de PCR mltiple se utilizan cada vez ms en los estudios biolgicos y
mdicos, ya que permiten la amplificacin simultnea de varios fragmentos de
ADN dentro de una reaccin. Esta capacidad para reducir el nmero de
reacciones necesarias para poner a prueba una muestra para diferentes

7
objetivos ayuda a ahorrar tiempo y dinero y hace que los sistemas mltiple sean
tiles especialmente cuando un gran nmero de muestras tienen que ser filtrada.
Por lo tanto, la PCR mltiple se utiliza regularmente para examinar la gentica
de poblaciones y la determinacin de origen, para investigar las interacciones
trficas, para la identificacin de especies moleculares y evaluacin de la
comunidad, as como en los estudios forenses y de seguridad alimentaria. El
gran potencial de este mtodo tambin se refleja en los nmeros rpido aumento
de las publicaciones que han adoptado este enfoque. El procedimiento
multifactico de la PCR Mltiple tiene que ser planificado y optimizado
completamente para lograr resultados slidos y significativos (Sint, Raso,
Traugott, 2012).

Conclusin
Se logr conocer el fundamento de la tcnica de Multiplex PCR y la capacidad
que posee para reducir el nmero de reacciones necesarias para poner a prueba
una muestra para diferentes objetivos, esta tcnica ayuda a ahorrar tiempo y
dinero.

Bibliografa

lvarez, S. M., & Roth, E. P. (2004). La PCR mltiple en microbiologa clnica.


Enferm Infecc Microbiol Clin, 22(3), 71-80. Recuperado el 16 de 06 de
2016, de
http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/temas/m2t10.pdf

Annimo. (04 de Noviembre de 2013). depa.fquim.unam.mx. Obtenido de


http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Sem2014-
1PCRmultiplexparaListeria_25688.pdf

Cultek. (03 de 2006). Obtenido de


http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/PCR/Aplicaciones-PCR-
Amplificacion%20de%20acidos%20nucleicos%20in%20vitro.pdf

Elnifro, E. M., Ashshi, A. M., Cooper, R. J., & Klapper, P. E. (Octubre de 2000).
Multiplex PCR: Optimization and Application. CLINICAL MICROBIOLOGY
REVIEWS, 13(4), 559570Elfath M. Elnifro,1 Ahmed M. Ashshi,1 Robert

8
J. Cooper,. Recuperado el 17 de 06 de 2016, de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC88949/pdf/cm000559.pdf

Hayden, M. J., Nguyen, T. M., Waterman, A., & Chalmers, K. J. (28 de Febrero
de 2008). Multiplex-Ready PCR: A new method for multiplexed SSR and
SNP. BMC Genomics, 9(80), 1-12. doi:10.1186/1471-2164-9-80

Markoulatos, P., Siafakas, N., & Moncany, M. (16 de Octubre de 2001). Multiplex
Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach. Journal of Clinical
Laboratory Analysis, 16, 47 - 51. doi:10.1002/jcla.2058

Shipley, G. (s.f.). PremierBiosoft. Obtenido de


http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html

Sint, D., Raso, L., & Traugott, M. (28 de Junio de 2012). Los avances en la PCR
mltiple: Equilibrio de las eficiencias de imprimacin y la mejora de la
deteccin xito. Methods in Ecology and Evolution, 3(5), 898-905.
doi:10.1111 / j.2041-210X.2012.00215.x

9
Glosario
Primers (Cebador): iniciadores de la PCR tambin denominados cebadores son
oligonucletidos sintticos que hibridan con la regin, complementaria al ADN
molde, que se desea amplificar y propician el inicio de la reaccin de elongacin
por la Taq ADN polimerasa.

Diana: es la secuencia de ADN reconocida por una enzima con actividad


hidrolasa especfica, llamada enzima de restriccin.

Amplicones: Un amplicones es un pedazo de DNA o RNA es la fuente o el


producto de eventos naturales o artificiales de amplificacin o replicacin.

Multiplexacin: es la combinacin de dos o ms canales de informacin en un


solo medio de transmisin usando un dispositivo llamado multiplexor.

Genotipos: conjunto de genes caractersticos de cada especie, vegetal o


animal, es decir, el genotipo son los genes en formato de ADN que un animal,
un vegetal o un ser humano recibe de herencia de parte de sus dos progenitores,
madre y padre,

Dmeros: es un complejo macromolecular formado por dos macromolculas,


como protenas y cidos nucleicos, usualmente mediante enlaces no covalentes.
Especificidad: es la cualidad y condicin de lo que es propio o caracterstico de
una especie o tipo

Template: cadena plantilla, cadena molde.

10
Resumen
Multiplex PCR se basa en amplificar en un nico tubo distintas secuencias
especficas o secuencias blanco o dianas, lo cual necesariamente implica que
los reactivos mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados
para permitir la deteccin de cada diana y no inhibir la de las dems.

Parmetros de diseo de cebadores para PCR multiplex

Los diseos de cebadores descritos a continuacin son una clave para la


amplificacin especfica con alto rendimiento.

Longitud del cebador: se requiere que el cebador diseado debe ser de


longitud apropiada. Por lo general, se utilizan cebadores de corta longitud, en el
intervalo de 18-22 pares bases.

Temperatura de fusin (Tm): Cebadores con Tm similares, preferiblemente


entre 55C - 60C se utilizan. Para las secuencias con alto contenido de GC, se
recomiendan cebadores con una Tm ms alta (preferiblemente 75C - 80C).

Especificidad: se debe tener en cuenta la especificidad de los cebadores


diseados para las secuencias diana, mientras se prepara un ensayo mltiple,
sobre todo porque existe competencia cuando mltiples secuencias diana estn
en un solo recipiente de reaccin.

Evitar la formacin de dmero de cebadores: Los cebadores diseados deben


ser revisados para la formacin de dmeros de cebadores.La dimerizacin
conduce a la amplificacin inespecfica.

Ventajas de Multiplex PCR

Controles internos: Los falsos negativos a menudo se revelan en ensayos


multiplex, porque cada amplificacin proporciona un control interno para los otros
fragmentos amplificados.

Eficiencia: El gasto de los reactivos y el tiempo de preparacin es menor en una


PCR multiplex que en los sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR
Calidad del Template: La calidad del templete se puede determinar de manera
ms eficaz en una PCR multiplex que en una reaccin simple de PCR.

11
Cantidad del Template La amplificacin exponencial y los estndares internos
de PCR multiplex se puede utilizar para evaluar la cantidad de una plantilla
determinada en una muestra.

La tcnica PCR Multiple tambeien tiene las siguientes ventajas:

Se pueden testar grandes regiones de la secuencia del DNA en busca de


alteraciones o modificaciones.
Se pueden testar segmentos no relacionados del genoma diana.
Se pueden incluir controles internos de amplificacin de la muestra.
Se puede testar una misma muestra contra diferentes patgenos.

Aplicaciones de Multiplex PCR

Sistemas de PCR mltiple se utilizan cada vez ms en los estudios biolgicos y


mdicos, ya que permiten la amplificacin simultnea de varios fragmentos de
ADN dentro de una reaccin. La PCR mltiple se utiliza regularmente para
examinar la gentica de poblaciones y la determinacin de origen, para investigar
las interacciones trficas, para la identificacin de especies moleculares y
evaluacin de la comunidad, as como en los estudios forenses y de seguridad
alimentaria.

12
Preguntas
1. Cul es la utilidad de la PCR Multiplex?

Amplificar simultneamente en un nico tubo distintas secuencias especficas o


secuencias blanco o dianas, lo cual necesariamente implica que los reactivos
mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la
deteccin de cada diana y no inhibir la de las dems.

2. Qu premisas se deben tener en cuenta al usar la PCR Multiplex?


Escoger o disear oligonucletidos que no interaccionen entre s, es decir,
que no formen dmeros.
Que tengan temperaturas de alineamiento similares.
Que cada pareja amplifique una nica secuencia diana.
Que generen amplicones (producto obtenido de la reaccin de PCR) de
tamao suficientemente diferente para separarlos y diferenciarlos tras la
amplificacin.
3. Cul es el fundamento de la PCR Multiplex?

Consta de varios conjuntos de cebadores dentro de una nica mezcla de PCR


para producir amplicones de tamaos que son especficos para varias
secuencias de ADN diferentes.

4. Cules son Parmetros de diseo de cebadores para PCR Multiplex?


Longitud del cebador
Temperatura de fusin
Especificidad
Evitar la formacin de dmero de cebadores
5. Qu longitud deben tener los cebadores?

Por lo general, se utilizan cebadores de corta longitud, en el intervalo de 18-22


bases.

6. Qu temperatura de fusin deben tener los cebadores?

Cebadores con Tm similares, preferiblemente entre 55C - 60C se utilizan. Para


las secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan cebadores con una

13
Tm ms alta (preferiblemente 75C - 80C). Una variacin Tm de entre 3C-5 C
es aceptable para los cebadores usados en una piscina.

7. Porque se debe evitar la formacin de dmeros en los cebadores?

La dimerizacin conduce a la amplificacin inespecfica.

8. Cules son las ventajas de la PCR Multiplex?


Controles internos
Eficiencia
Calidad del Template
Cantidad del Template
9. Cules son las aplicaciones de la PCR Multiplex?

En los estudios biolgicos y mdicos, ya que permiten la amplificacin


simultnea de varios fragmentos de ADN dentro de una reaccin.

10. Cul es la relacin de la PCR Multiplex con la gentica?

La PCR mltiple se utiliza regularmente para examinar la gentica de


poblaciones y la determinacin de origen, para investigar las interacciones
trficas, para la identificacin de especies moleculares y evaluacin de la
comunidad, as como en los estudios forenses y de seguridad alimentaria.

14