2015

INHIBICINDE LA CARGA MICROBIANA: E.COLI

Y SALMONELLA SP CON CIDO CTRICO EN LA
SPINACIA OLERACEA

INTEGRANTES:

MONTOYA ALVARADO, ANDREA

ORE TORIBIO, TANIA
ORTEGA SILVA, EDWIN
VALERA CALLE, JOANA
VILELA CHAVEZ, DIEGO

GRUPO HORARIO: 91G // GRUPO 1

DOCENTE:
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
ING. HERRERA SANCHEZ, SONIA 30/06/2015
 I. INTRODUCCIN

El consumo de hortalizas refrigeradas mnimamente procesadas (RMP) se ha

incrementado dramticamente en las ltimas dcadas (Olaimat y Holley, 2012; Sao
Jos y Vanetti, 2012; Sagong y col., 2011) debido al inters de los consumidores en
incorporar vegetales a su dieta y la conveniencia que estos productos ofrecen
debido a su rpida y sencilla preparacin. Acompaando estos cambios, se ha
registrado un notable aumento de enfermedades transmitidas por alimentos
asociados al consumo de productos frescos y mnimamente procesados (Olaimat y
Holley, 2012; Taban y Halkman, 2011; Warrier y col., 2009).

La produccin de hortalizas RMP incluye diversas etapas: lavado y desinfeccin,

pelado y reduccin de tamao, empaque (con o sin atmsfera modificadas o
controladas) y almacenamiento refrigerado. El lavado y desinfeccin tiene una
importancia relevante debido a que son las nicas etapas donde la carga
microbiana inicial puede ser reducida.

En la tecnologa de alimentos se usa muchos cidos orgnicos de bajo peso

molecular como el cido actico, ctrico y benzoico debido a su propiedad de
conservante. Esto ha impulsado la investigacin y desarrollo de nuevas estrategias
de desinfeccin. Las tendencias actuales buscan reemplazar los aditivos qumicos
por otros ms naturales que logren un efecto sanitario similar.

II. OBJETIVOS

Inhibir la carga microbiana de E. Coli y la Salmonella en la Spinacia oleracea

(espinaca), usando diferentes concentraciones de cido ctrico.
Determinar la concentracin adecuada de cido ctrico para la inhibicin de E. Coli
y Salmonella sp en la Spinacia oleracea (espinaca).

III. HIPTESIS

El cido ctrico tiene propiedades antioxidantes y conservantes capaces de

reducir la carga microbiana de E. Coli y Salmonella en la Spinacia oleracea
(espinaca).
 IV. MARCO TERICO

DEFINICIONES

Generalidades
La inocuidad es uno de los cuatro grupos bsicos de caractersticas que, junto con
las nutricionales, las organolpticas y las comerciales, componen la calidad de los
alimentos.

Hay numerosos peligros de naturaleza fsica, qumica o microbiolgica que pueden

provocar la prdida de la inocuidad. Dada la fuerte relacin que existe entre este
aspecto y la salud de los consumidores, su cuidado adquiere importancia
fundamental.

La inocuidad de los alimentos es un elemento fundamental de la salud pblica y un

factor determinante del comercio de alimentos. Involucra a varias personas
interesadas, entre ellos los productores primarios, los manipuladores de
alimentos, los elaboradores y los comerciantes, a lo largo de toda la cadena
alimenticia, los servicios oficiales de control de alimentos y los consumidores.

Calidad de los alimentos

La calidad es definida por la Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO)
como la totalidad de atributos y caractersticas de un producto o servicio basadas
en su capacidad para satisfacer necesidades declaradas o implicadas.

Esta organizacin indica que la calidad no debe ser confundida con el grado de
excelencia, la cual es un resultado de los esfuerzos para mejorar las caractersticas
del producto o servicio (ISO, 1994).

Llevando esta definicin a la prctica en la produccin de alimentos, un alimento

de buena calidad debe cumplir con caractersticas nutricionales, de estabilidad y
de inocuidad que sean tpicas del producto que se est obteniendo o procesando.
Un alimento de buena calidad debe ser:

a) Nutritivo: el aporte de nutrientes vara segn el producto

b) Idneo: su naturaleza y composicin deben corresponder a aquellas que le son

propias
c) Fresco: carente de deterioro

d) Sensorialmente aceptable

e) Inocuo:

Un problema que con frecuencia se presenta en la industria de alimentos al aplicar

conceptos es el de la calidad y la inocuidad. A pesar de que la calidad incluira la
inocuidad, en la prctica los procedimientos que se siguen para el manejo de la
inocuidad difieren considerablemente de aquellos que se siguen para el manejo de
los otros componentes de la calidad, como es la estabilidad (vida de anaquel) y la
aceptabilidad. En el manejo de la calidad se siguen esencialmente procedimientos
para:

Establecer la identidad del producto, la cual puede ser establecida

arbitrariamente o segn un acuerdo con el comprador
Ajustar un proceso para que dicha identidad o calidad se mantenga
Verificar que se mantiene dicha calidad.
El proceso de manejo de la calidad involucra el uso de indicadores para
asegurar que cada lote de produccin se ajusta a las caractersticas
requeridas. En la industria de alimentos esto se cumple principalmente
mediante auditorias y mediante programas de muestreo y anlisis del
producto.

Por lo anteriormente descrito es importante enfatizar que el manejo de la

inocuidad de los alimentos es un proceso igualmente importante que el
manejo de la calidad de los mismos. Usualmente, se realiza a base de la
aplicacin de programas donde se integra:

La higiene, mediante la aplicacin de buenas prcticas agrcolas y/o

buenas prcticas de manufactura
La estandarizacin de procedimientos mediante la escritura de
procedimientos operativos estndar de saneamiento
El control de los peligros. El control puede consistir, dependiendo de la
medida de control que se use, en reducir, prevenir o eliminar los peligros.
 Cuando en la cadena alimentaria se ha identificado un peligro que necesita
ser controlado y se tiene una medida de control para dicho peligro, es
posible la aplicacin de sistemas de aseguramiento de la calidad muy
conocidos como:

Buenas prcticas agrcolas (BPA) (Ver Anexo I), Buenas Prcticas de

Manufactura (BPM), Anlisis de Peligros y Puntos Crticos de Control
(HACCP).

Actualmente la aplicacin de sistemas de aseguramiento de la inocuidad

en un elemento de competitividad y reconocimiento por parte de los
compradores internacionales, los cuales cada vez son exigentes en cuanto
al cumplimiento de requisitos y estndares de calidad e inocuidad.

HORTALIZAS

DEFINICIN

Son todas aquellas plantas producidas en la huerta, de las cuales una o ms partes
son utilizadas como alimento en su forma natural, cocidas o tratadas por otros
procedimientos.

Utilizada en la alimentacin humana sin sufrir transformacin importante, con

bajos niveles de caloras, pero con altos contenidos de vitaminas y minerales, de
agua por lo cual son muy perecederas.

Clasificacin Botnica

Verdura: Cuando son utilizadas las partes verdes: yemas, tallos y hojas.
Legumbres: Cuando se utiliza el fruto o la semilla.
Races Tubrculos y rizomas: Cuando se utilizan las partes subterrnea.

SPINACIA OLERACEA

La espinaca (Spinacia oleracea) es una planta anual, de la familia de

las amarantceas, subfamilia quenopodioideas, cultivada como verdura por
sus hojas comestibles, grandes y de color verde muy oscuro. Su cultivo se realiza
durante todo el ao y se puede consumir fresca, cocida o frita. En la actualidad es
una de las verduras que ms habitualmente se encuentra congelada.

El aporte calrico de las espinacas es llamativamente muy reducido, debido a

que un 90% de ellas es agua y a que su contenido en azcares es muy bajo. Estas
dos razones apoyan que la teora de que puedan ser incluidas en la alimentacin
para personas que padecen sobrepeso, obesidad o diabetes.

Propiedades

Es rica en vitaminas A y E, yodo y varios antioxidantes. Tambin contiene

bastante cido oxlico, por lo que se ha de consumir con moderacin. Con todo, es
muy apreciada por su elevado valor nutritivo en general y su riqueza vitamnica en
particular.
Riesgo microbiolgico

Segn la R.M. 591 2008 MINSA NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS
CRITERIOS MICROBIOLGICOS DE CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA
LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO

Indica los criterios microbiolgicos de los alimentos que deben cumplir

ntegramente con la totalidad de los criterios microbiolgicos correspondientes a
su grupo o subgrupo para ser considerados aptos para el ser humano.

En el captulo:

XIV. FRUTAS Y HORTALIZAS, FRUTOS Y OTROS VEGETALES.

XIV. 1 Frutas y hortalizas frescas (sin ningn tratamiento)

Fuente: RM 591-2008 MINSA

Indica que la muestra de espinaca presenta riesgo de contaminacin bacteria de E.

coli y Salmonella sp. Bacterias que son muy
perjudiciales para el ser humano y que se
describirn a continuacin.

a- Escherichia coli

Escherichia coli es un bacilo gram negativo,

anaerobio facultativo de la familia
Enterobacteriaceae, tribu Escherichia, cuyas
principales caractersticas bioqumicas se
indican en el cuadro I.
Escherichia coli es una bacteria habitual en el
intestino del ser humano y de otros animales
de sangre caliente. Aunque la mayora de las cepas son inofensivas, algunas pueden
causar una grave enfermedad de transmisin alimentaria. La infeccin por E. coli
se transmite generalmente por consumo de agua o alimentos contaminados, como
productos crnicos poco cocidos y leche cruda.

La Escherichia coli es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema. En

individuos sanos, es decir, si la bacteria no adquiere elementos genticos que
codifican factores virulentos, la bacteria acta como un comensal formando parte
de la flora intestinal y ayudando as a la absorcin de nutrientes. En humanos,
la Escherichia coli coloniza el tracto gastrointestinal de un neonato adhirindose a
las mucosidades del intestino grueso en el plazo de 48 horas despus de la primera
comida. Tiene un ancho variable.

Cmo se contaminan los alimentos?

Vas de contaminacin fecal
La epidemiologa de la E. coli patgena transmitida por los alimentos vara
alrededor del mundo.
En comunidades con una mala sanidad e higiene, son frecuentes la E. coli
enterotoxignica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC) y enteropatgena (EPEC). Se
adquieren a travs del consumo de alimentos y agua contaminada y por la
contaminacin cruzada a travs del contacto humano directo. La E. coli patgena
transmitida por los alimentos paradjicamente ha aparecido en comunidades con
un mejor desarrollo sanitario e higinico. Sin embargo, las variedades son
diferentes (p.ej., STEC, EHEC y E. colienteroagregativa [EAEC]) y las vas de
transmisin con frecuencia incluyen productos animales u hortcolas crudos o
elaborados de manera inadecuada, contacto con estircol de animales, agua
contaminada y contaminacin cruzada con alimentos crudos.

Las E. colipatgenas son excretadas en las heces de huspedes enfermos o sanos.

Los rumiantes y animales silvestres parecen ser los principales reservorios de
STEC y EHEC, mientras que el husped humano podra ser ms importante en el
caso de otras variedades.

Debido a la amplia diseminacin de material fecal humano y animal en el

medioambiente, las bacterias pueden estar presentes en reas que se utilizan para
la produccin de alimentos. Por ejemplo, La E. Coli se puede encontrar en estircol
animal y aguas residuales (hasta que se transforman completamente en compost),
entornos agrcolas y periurbanos contaminados por humanos, ganado, pjaros y
animales silvestres, suelos abonados con estircol y fuentes de agua contaminadas.

Qu alimentos podran contaminarse?

Una amplia gama de alimentos pueden ser un vehculo para la E. colipatgena en

conjunto con sus respectivas ecologas. Los alimentos pueden contaminarse de
manera directa o por contaminacin cruzada durante el crecimiento y cultivo
(hortalizas), recoleccin (leche) o faenado (carne). Se puede producir una
contaminacin adicional durante la manipulacin pos cosecha, transporte,
elaboracin y manipulacin no higinica de alimentos durante su preparacin.
Entre los ejemplos de alimentos contaminados se encuentran: carne cruda/mal
elaborada (carne fermentada, carne molida mal cocida, etc.), productos lcteos no
pasteurizados (queso, leche, etc.), jugos de frutas no pasteurizados y hortalizas
crudas (semillas germinadas, lechuga, espinaca, melones, hongos, etc)

b- Salmonella

Es un gnero de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado

por bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que
no desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi) ni esporas. Son bacterias
mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una
enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo
fermentativo.

Es un agente productor de zoonosis de distribucin universal. Se transmite por

contacto directo o contaminacin cruzada durante la manipulacin, en el
procesado de alimentos o en el hogar; tambin por va sexual.

Algunas salmonellas son comunes en la piel de tortugas y de muchos reptiles, lo

cual puede ser de cuidado cuando se manipulan este tipo de mascotas a la vez con
alimentos.

El hbitat natural de esta especie normalmente es en los intestinos de cualquier

tipo de animal homeotermo (incluidos seres
humanos).

Patogenia

Produce salmonelosis con un periodo de

incubacin de entre 5 horas y 5 das, diarrea
y dolor abdominal. A travs de las heces
(excremento) del enfermo se elimina gran
cantidad de bacteria, y se presenta fiebre
entrica con un periodo de incubacin de 7 a 28 das, causante de dolor de cabeza,
fiebre, dolor abdominal y diarrea, erupcin mculo-papulosa en pecho y espalda.
Los enfermos presentan un perodo de convalecencia entre 1 y 8 semanas y las
personas curadas eliminan Salmonella. Tambin puede ocasionar fiebres entricas
o infeccin intestinal por intoxicacin con algunos alimentos.

El cido ctrico
El cido ctrico es un cido orgnico natural, dbil que se encuentra en muchas
frutas y verduras, especialmente en ctricos. Puesto que el cido ctrico es tambin
un subproducto del ciclo del cido ctrico, tambin se produce por muchos
organismos vivos, incluyendo el moho.
El cido ctrico es muy apreciado por su sabor amargo, la calidad de conservacin y
la capacidad de actuar como un amortiguador del pH. Por estas razones, el cido
ctrico se encuentra en la lista de ingredientes de muchos productos alimenticios
de hoy en da.

Usos

El cido ctrico se aade a las comidas y

tambin a vitaminas y minerales. Se utiliza en
fotografa, como producto de limpieza y en
productos de belleza.

Propiedades

El cido ctrico es un polvo blanco, aunque con

agua puede ser lquido. Tiene propiedades
antioxidantes, conservantes y saborizantes y
elimina contaminantes.

Beneficios

El cido ctrico tiene diversas propiedades

beneficiosas para la salud, como antioxidante,
cuidado de la piel o la garganta.

Uso como conservante

Como se ha podido verificar los cidos ejercen

sobre los microorganismos dos tipos distintos
de efectos, aunque estrechamente relacionados. En primer lugar, presentan efecto
antimicrobiano debido a la acidez en s, esto es, a la disminucin del pH
extracelular. El segundo tipo, ms importante en la prctica, es el efecto
antimicrobiano especfico debido a la forma no disociada.

La eficacia de un cido orgnico en la conservacin de un alimento se halla

afectada de forma especial por la actividad de agua, el pH, el potencial redox, la
disponobilidad de sustrato y el contenido graso.
Por lo tanto, la eleccin de un determinado cido orgnico depende, no solo de las
caractersticas inherentes al mismo (por ejemplo, actividad antimicrobiana
adecuada, solubilidad, estabilidad y compatibilidad con las propiedades
organolpticas) sino tambin de las condiciones microambientales y de
almacenamiento del alimento.

MTODOS DE DESINFECCIN PARA HORTALIZAS.

Se le denomina desinfeccin a la destruccin de microorganismos, mediante

procedimientos o agentes fsicos o qumicos satisfactorios, aplicados en
superficies limpias de forma que se reduzca el nmero de microorganismos que
pueden causar infeccin u ocasionar otros efectos indeseables. (FDA, 1998).
Tomando como base la definicin antes planteada se puede decir que desinfectar
significa tratar los productos limpios mediante un proceso eficaz para destruir o
reducir substancialmente las cantidades de microorganismos que implican un
riesgo para la salud pblica, as como otros microorganismos no deseados, sin
afectar negativamente a la calidad del producto o su seguridad para el consumidor.
(FDA,1998)

Actualmente en la industria alimenticia se utiliza el trmino sanitizacin

usualmente cuando se tratan los productos, las reas de produccin y los equipos
empleados en la elaboracin de productos, con agentes qumicos o fsicos, con el
propsito de reducir el contenido microbiano hasta niveles insignificantes.

DESINFECTANTE

Se conocen con el nombre de desinfectantes a aquellos agentes qumicos capaces

de reducir, a niveles insignificantes, la tasa de patgenos y dems
microorganismos. (FDA, 1998)

Los desinfectantes son ms tiles en aquellas industrias alimentarias en las que la

aplicacin de calor o fro no es el procedimiento ms adecuado para luchar contra
la contaminacin microbiana.

Los agentes desinfectantes y sustancias qumicas no son eficaces si los patgenos

se han introducido en el producto.
El empleo de agentes desinfectantes no debe sustituir la aplicacin de las Buenas
Prcticas Agrcolas (BPA), sino utilizarse como una medida adicional para
minimizar la probabilidad de riesgos microbiolgicos en los productos frescos.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE DESINFECCIN PARA HORTALIZAS

1. MTODOS QUMICOS DE DESINFECCIN

Los desinfectantes ms utilizados en la actualidad para tratar hortalizas, segn el

grupo qumico al que pertenecen incluyen:

Halgenos: cloro, dixido de cloro, yodo, bromo

Compuestos inicos: Fosfato Trisdico (FTS), Compuestos de amonio
cuaternario (Quats), cidos Orgnicos.
Oxgeno activo: perxido de hidrgeno, cido peractico, ozono
Detergentes

2. EVALUACIN DE LOS MTODOS DE DESINFECCIN:

Las caractersticas que debe presentar un desinfectante para considerar ideal

son:

a) Actividad antimicrobiana: debe ser capaz de matar a los microorganismos. A

baja concentracin debe tener un amplio espectro de actividad antimicrobiana.

b) Solubilidad: ser soluble en agua u otros solventes, en la proporcin necesaria,

para su uso efectivo.

c) Estabilidad: durante el almacenamiento los cambios en sus propiedades deben

ser mnimos y no deben causar una prdida significativa de su accin germicida.

d) No debe ser txico para el hombre ni los animales.

e) Homogeneidad: la preparacin debe ser uniforme en composicin, de manera

que los ingredientes activos estn presentes en cada aplicacin.

f) No se debe combinar con materiales orgnicos extraos.

g) Debe ser txico para los microorganismos a la temperatura ambiente

h) Capacidad para penetrar: esto no es necesario si se requiere slo una accin

superficial.

i) No debe ser corrosivo, ni teir el material que se trate.

j) Capacidad desodorante: desodorizar mientras desinfecta es una propiedad

deseable. Idealmente el desinfectante debe ser inodoro o tener un olor agradable.

k) Capacidad detergente: ya que un desinfectante que sea a la vez detergente

cumple 2 objetivos: limpieza y desinfeccin.

l) Disponibilidad: debe estar disponible en grandes cantidades a un precio

razonable.

m) Actuar en un tiempo relativamente corto.

ANTECEDENTES

1. EFECTO DEL USO DE CIDO ACTICO, CTRICO E HIPOCLORITO DE

CALCIO PARA CONTROL DE ESCHERICHIA COLI (ATCC 25922) EN
LECHUGA (LACTUCA SATIVA L.) Y CHILE DULCE (CAPSICUM ANNUUM L.)

En el departamento de agroindustria alimentaria de la Escuela Agrcola

Panamericana (Zamorano, Honduras), Mario Mendoza Velsquez y Flix Roberto
Cantor Barreiro (Noviembre, 2012) realizaron un proyecto de investigacin.

El objetivo de este estudio fue determinar los efectos del cido actico (AA), ctrico
(AC), e hipoclorito de calcio (CL), en factores microbiolgicos y fsicos en lechuga y
chile dulce. Se emple un diseo experimental completamente al azar evaluando
dos concentraciones de cloro (50 y 100 mg/L) y cidos orgnicos (1000 mg/L) de
forma individual y mezclados, en chile dulce y lechuga inoculados con E. coli (ATCC
25922).

Se determin que al utilizar cido actico (1000 mg L-1 ), ctrico (1000 mg L-1 ) y
mezclas con hipoclorito de calcio (50 mg L-1 ) se observan reducciones de hasta
2.190.49 Log UFC cm-2 de E. coli (ATCC 25922) en superficies de lechuga, y la
solucin desinfectante basada en cido actico (1000 mg L-1 ) es la de menor costo
variable. Se determin que utilizar cloro (hipoclorito de calcio) en concentraciones
de 50 a 100 mg L-1 no present diferencias significativas en la reduccin de E. coli
(ATCC 25922) con respecto a un lavado slo con agua potable de Zamorano.

2. LAVADO Y DESINFECCIN DE ESPINACA (Spinacia oleracea L.):

EVALUACIN DE DESINFECTANTES ALTERNATIVOS AL HIPOCLORITO DE
SODIO

En la Revista Iberoamericana de Tecnologa Post cosecha, se realiz una

publicacin de un proyecto acadmico de la realizado por Rubinstein, Alejandra J;
Jagus, Rosa J. y Agero, M Victoria (2013).

El objetivo del trabajo fue evaluar la eficiencia del lavado y desinfeccin

reemplazando el hipoclorito de sodio por productos ms naturales y seguros. Los
tratamientos propuestos fueron: lavado con agua de red en una etapa(A) y lavados
en dos etapas realizando un primer lavado en agua de red y un segundo lavado en:
agua de red (A+A), hipoclorito de sodio (200ppm, A+H), cido ctrico (2%, A+C),
natamicina (0,2%, A+N), t verde (0,25%, A+T). Los lavados se realizaron por
inmersin de 5min, con agitacin manual, y escurrido de 30seg en centrfuga
manual. Se evalu la carga microbiana de bacterias mesfilas aerbias (MA), los
recuentos de hongos y levaduras y la calidad organolptica (textura con un
texturmetro y calidad visual general) antes y despus de aplicado el tratamiento.
El primer lavado produjo redujo 1,16 ciclos log en los recuentos iniciales de MA
(5,75 log UFC/ml), pero no redujo los recuentos iniciales de H y L (4,14 log
UFC/ml). El segundo lavado provoc mayores reducciones de la carga microbiana
respecto al recuento inicial, con la mayor eficiencia en el caso de A+C para MA, y
A+N para H y L (3,19 y 1,39 ciclos log, respectivamente).El primer lavado con agua
mejora el brillo de las hojas (por la eliminacin de tierra); sin embargo, afecta la
textura: aparecen roturas en el tejido debido al dao mecnico que produce la
agitacin. El segundo lavado incrementa el dao mecnico. Estos resultados
correlacionaron con los valores medidos en el texturmetro, sin diferencias entre
las soluciones ensayadas. Estos resultados sugieren que es posible reemplazar el
hipoclorito de sodio en la desinfeccin de espinaca, logrando reducciones
mayores de carga microbiana inicial, con igual calidad organolptica final.
 3. EVALUACIN DE MTODOS DE DESINFECCIN PARA HORTALIZAS QUE SE
CONSUMEN EN CRUDO

En la Universidad de El Salvador, Facultad de Ingeniera y Arquitectura ,Escuela de

Ingeniera Qumica ,se realiz un Trabajo de Graduacin, presentado por Mara
Antonieta Campos Durn y Wendy Aymeth Manzano Polo(San Salvador,2007).

La investigacin tuvo como finalidad evaluar mtodos de desinfeccin para

hortalizas se consumen en crudo, por lo que el estudio se enfoc primeramente en
evaluar por medio de anlisis microbiolgico la efectividad de los mtodos de
desinfeccin para hortalizas comercializados actualmente en el mercado nacional y
partiendo de los resultados obtenidos se evaluaron mtodos de desinfeccin
qumicos, qumicos no convencionales y no qumicos a diferentes concentraciones
y tiempos de accin. Para el desarrollo de la fase experimental de la investigacin
se tom como punto de muestreo el mercado de mayoreo la Tiendona y para
evaluar la efectividad de los mtodos de desinfeccin se realizaron anlisis
microbilogos para determinar la reduccin o inhibicin de microorganismos tales
como: Coliformes totales, Coliformes fecales, Escherichia coli (E. coli) y Salmonella.
Tomando los resultados de los anlisis microbiolgicos as como los lmites
permisibles para el uso de mtodos qumicos de desinfeccin, segn las fuentes
bibliogrficas consultadas, se procedi a determinar los mtodos adecuados para
desinfectar las hortalizas objeto de anlisis en la investigacin. Finalmente se
estableci que el mtodo de desinfeccin que presenta mayor efectividad ante la
reduccin de la carga bacteriana, tanto de coliformes totales, fecales as como E.
coli, a un tiempo de accin de 15 minutos es el tratamiento aplicando un lavado
previo a las hortalizas con una solucin detergente al 5 % p/v y posteriormente
una solucin de Hipoclorito de Sodio de 169 ppm, realizando esta dilucin de
acuerdo a las recomendaciones presentadas en la vieta del producto, as mismo el
mtodo no qumico de desinfeccin que presenta esta misma efectividad es una
solucin de organo a concentracin de 10 %p/v a un tiempo de accin de 15
minutos y en relacin a la inhibicin en el crecimiento de clulas viables de
Salmonella el mtodo qumico no convencional que inhibe el crecimiento de
clulas viables de Salmonella es el cido actico (vinagre) al 4% v/v.
 4. EFICACIA DE DIVERSOS AGENTES DESINFECTANTES EN LA SATINIZACION
DE HORTALIZAS FRESCAS

En la Universidad de las Amricas Puebla, Departamento de Ingeniera Qumica y

Alimentos, M.O Ramrez Sucre; A. Lpez Malo y E. Palou Garca (Mxico, 2009)
realizaron un trabajo de Investigacin cuyo objetivo fue disminuir la carga
microbiana de hortalizas frescas, con diversos agentes desinfectantes.

Se desarroll una mezcla eficaz para la satanizacin de hortalizas frescas, se

determin el nmero de microorganismos mesfilos aerobios y coliformes totales
de muestras de espinaca y meln sometidos a diversos satinizantes (cido ctrico,
actico, lctico, cloro y perxido de hidrogeno). En espinacas las mayores
reducciones fueron de 4.4 y 5.5 ciclos logartmicos (mesfilos aerobios y
coliformes totales respectivamente). El anlisis experimental mediante superficie
de respuesta muestra la mezcla de 4% de cido lctico y 0.6 % de cido actico
como la ms eficiente en la reduccin microbiana de espinacas. Estas mezclas
pueden prolongar el periodo de almacenamiento, la calidad y la seguridad
alimentaria de las hortalizas, permitiendo elevar su precio de venta, sin embargo el
uso de satinizantes se encuentra en funcin del tipo de alimento y de los
microorganismos de inters.
 V. MATERIALES Y MTODOS

a. MATERIALES

Placas Petri descartables (20 unidades). Estos recipientes permiten a los

cientficos realizar cultivos bacterianos en condiciones controladas para llevar a
cabo experimentos. Suele estar hecha de vidrio o de plstico.

Pipetas de 5ml y 10 ml. Las pipetas permiten la transferencia de un volumen

generalmente no mayor a 20 ml de un recipiente a otro de forma exacta. este
permite medir alcuotas de lquido con bastante precisin. Suelen ser de vidrio

Propipeta. Utensilio de goma, creada especialmente para asegurar la transferencia

de lquidos de todo tipo, especialmente los que poseen propiedades especficas
(infecciosos, corrosivos, txicos, radiactivos o estriles).

Probeta de 15ml y 100ml. Tubo de cristal alargado y graduado, cerrado por un

extremo, usado como recipiente de lquidos, el cual tiene como finalidad medir el
volumen de los mismos.

Vasos precipitados 250 ml y 500ml. Tienen forma cilndrica y poseen un fondo

plano. Se encuentran en varias capacidades. Se encuentran graduados, pero no
calibrados, esto provoca que la graduacin sea inexacta.

Mechero de Bunsen. Un mechero o quemador Bunsen es un instrumento utilizado

en laboratorios cientficos para calentar o esterilizar muestras o reactivos
qumicos. Una de las fuentes de calor ms sencillas del laboratorio y es utilizado
para obtener temperaturas no muy elevadas

Trpode. La finalidad que cumple el trpode de laboratorio es solo una. Este es

utilizado principalmente como una herramienta que sostiene la rejilla de asbesto.
Con este material es posible la preparacin de montajes para calentar, utilizando
como complementos el mechero (dependiendo del tipo).

Incubadora. Las incubadoras son equipos modernos de laboratorio que se utilizan

para mantener el desarrollo microbiolgico progresivo de cultivos, regulando
factores de crecimiento viables como por ejemplo la temperatura, la humedad y la
ventilacin.

Bolsas Ziploc (30 unidades). Son bolsas fabricadas en polietileno de baja

densidad transparente con una banda hermtica abre/cierra que tiene la
capacidad de conservar los productos en excelentes condiciones de aislamiento e
higiene.

Bagueta. Es un fino cilindro de vidrio macizo, que se utiliza principalmente para

mezclar o disolver sustancias con el fin de homogenizar.
Esptula. Es una lmina plana angosta que se encuentra adherida a un mango
hecho de madera, plstico o metal. Es utilizada principalmente para tomar
pequeas cantidades de compuestos o sustancias slidas, especialmente las
granulares.

Termmetro. Es un instrumento utilizado para medir la temperatura con un alto

nivel de exactitud. Puede ser parcial o totalmente inmerso en la sustancia que se
est midiendo.

Luna de reloj. Su utilidad ms frecuente es pesar muestras slidas; aunque

tambin es utilizado para pesar muestras hmedas despus de hacer la filtracin,
es decir, despus de haber filtrado el lquido y quedar solo la muestra slida.

Piceta.

b. REACTIVOS

cido ctrico (30gr). El cido ctrico es un cido orgnico natural, dbil que se
encuentra en muchas frutas y verduras, especialmente en ctricos.

Medios de cultivo. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos

es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. El
medio utilizado para enumeracin de E. Coli fue el Mac Conkey y para la
identificacin de Salmonella fue el agar Salmonella Shiguella.

Solucin salina. Se prepara 1L de esta solucin al 0.8%. Se pesa 8 gr de sal y se

vierte en 1L de agua destilada.

Muestra. La muestra de espinaca, obtenido en el local N del Mercado Santa

Rosa ubicado entre las avenidas Juan Pablo II y Colonial, Bellavista, Callao.

c. ACCESORIOS PERSONALES

Guantes de ltex.

Cofias.

Mascarillas.

Guardapolvos.
 MECHERO DE BUNSEN ACIDO CITRICO

TERMOMETRO PLACA PETRI

MUESTRA INCUBADORA

AGAR Salmonella shigella y Mac Conkey) VASO DE PRECIPITADO

PROBETA PIPETA
 d. MTODO:

La primera semana analizamos una muestra de espinaca, esta fue nuestra muestra
patrn para todo el proceso de investigacin. Los resultados de esta muestra
fueron tomadas como referencia en el conteo y de esta manera poder observar si
hay inhibicin en la carga microbiana, especficamente de E. Coli y Salmonella.

Tambin se prepararon otras muestras de espinaca las cuales tuvieron un

tratamiento que se bas en trabajar con diferentes concentraciones de cido
ctrico. Se empez con una concentracin de 1%. Cada semana aumentamos las
concentraciones, de esta manera se obtuvo la concentracin adecuada para la
inhibicin de E. Coli y Salmonella.

Semana % Acido Muestra de Dilucin para Muestra de Dilucin para

ctrico E. Coli E. Coli Salmonella Salmonella
1 1 10g 10-2 25g 10-1
2 2 10g 10-2 25g 10-1
3 4 10g 10-2 25g 10-1
6 10g 10-2 25g 10-1
Proceso semanal.

Semana 1:

Muestra Patrn

- Se compra 1Kg de espinaca y se rotula la muestra.

- Se prepara una solucin salina al 0.8%, se pesa en una luna de reloj 4 g de
sal y se agrega a un vaso precipitado de 500ml, con ayuda de una bagueta
se diluye la solucin.

Sembrado de E. Coli

- Se pesa 10gr de muestra, sta se coloca en una bolsa ziploc y se le adiciona

90ml de solucin salina. El sembrado se har por duplicado.
- Con ayuda de una pipeta de 5ml, se extrae 1 ml de muestra de la bolsa
ziploc y se agrega a un tubo de ensayo, a este tubo le agregamos 9 ml de
solucin salina y agitamos la solucin con ayuda de una bagueta
- Se extrae 1ml de la solucin del tubo de ensayo y se agrega a una placa
Petri, previamente esterilizada.
 - Se agrega 15ml de agar Mac Conkey fundido (temperado ente 40 y 60)
sobre la placa Petri.
- Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas.
- Inmediatamente despus se tapa la placa hasta que se solidifique.
- Incubar a 22 - 25C durante 2 das

Sembrado de Salmonella

- Se pesa 25 gr de muestra, sta se coloca en una bolsa ziploc y se le adiciona

75ml de solucin salina. El sembrado se har por duplicado.
- Con ayuda de una pipeta de 5ml, se extrae 1 ml de muestra de la bolsa
ziploc y se agrega a una placa Petri, previamente esterilizada.
- Se agrega 15 ml de agar Salmonella Shiguella fundido (temperado ente 40
y 60), sobre la placa Petri.
- Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas.
- Inmediatamente despus se tapa la placa hasta que se solidifique.
- Incubar a 35C-45C durante 2 das.

Muestra con tratamiento (1% de cido ctrico)

Sembrado de E. Coli

- En una luna de reloj se pesa 1 gr de cido ctrico y se agrega en un vaso de

precipitado, se diluyen en 100 ml de H2O con ayuda de una bagueta.
- Se pesa 10gr de muestra, sta se coloca en una bolsa ziploc y se le adiciona
los 100ml de solucin con cido ctrico. Se realiz una inmersin durante
10 minutos con agitacin manual.
- Se descarta la solucin, y la muestra tratada se agrega a otra bolsa ziploc, y
se agrega 90 ml de solucin salina, medidos previamente en una probeta.
- Se extrae 1 ml de muestra de la bolsa ziploc y se agrega a un tubo de
ensayo, a este tubo le agregamos 9 ml de solucin salina y agitamos la
solucin con ayuda de una bagueta.
- Se extrae 1 ml de muestra de la bolsa ziploc y se agrega a una placa Petri,
previamente esterilizada.
- Se agrega 15ml de agar Mac Conkey fundido (temperado ente 40 y 60)
sobre la placa Petri.
 - Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas.
- Inmediatamente despus se tapa la placa hasta que se solidifique.
- Incubar a 35C-45C durante 2 das.

Sembrado de Salmonella

- En una luna de reloj se pesa 2 gr de cido ctrico y se agrega en un vaso de

precipitado, se diluyen en 200 ml de H2O con ayuda de una bagueta(es
importante que la solucin cubra toda la muestra).
- Se pesa 25gr de muestra, sta se coloca en una bolsa ziploc y se le adiciona
los 200ml de solucin con cido ctrico. Se realiz una inmersin durante
10 minutos con agitacin manual.
- Se descarta la solucin, y la muestra tratada se agrega a otra bolsa ziploc, y
se agrega 75 ml de solucin salina, medidos previamente en una probeta.
- Se extrae 1 ml de muestra de la bolsa ziploc y se agrega a una placa Petri,
previamente esterilizada.
- Se agrega 15 ml de agar Salmonella Shiguella fundido (temperado ente 40
y 60), sobre la placa Petri.
- Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas.
- Inmediatamente despus se tapa la placa hasta que se solidifique.
- Incubar a 35C-45C durante 2 das.

Semana 2:

Se realiza el mismo procedimiento que la semana 1, pero se trabaja a

concentraciones del 2% y 3%.

Semana 3:

Se realiza el mismo procedimiento que la semana 1, pero se trabaja a

concentraciones del 4%, 6% y 8%.
 VI. RESULTADOS

A. PRIMERA SEMANA

Anlisis: Lugar: Laboratorio de microbiologa de la Facultad de Ingeniera Qumica en la

Universidad Nacional del Callao.
Fecha de muestreo: 03-06-2015
Fecha de anlisis: 05-06-2015
Medio de cultivo: Agar MacConKey
Microorganismo analizado: Escherichia Coli.
Dilucin utilizada: 10-2 g/ml

MUESTRA: ESPINACA SIN TRATAMIENTO

Agente microbiano CONTEO 1 CONTEO 2 RESULTADO L.M.P

Escherichia
Coli
3*102 ufc/g 7*102 ufc/g 5*102 ufc/g 102 ufc/g
 Anlisis: Lugar: Laboratorio de microbiologa de la Facultad de Ingeniera Qumica en la
Universidad Nacional del Callao.
Fecha de muestreo: 03-06-2015
Fecha de anlisis: 05-06-2015
Medio de cultivo: Salmonella Shiguella
Microorganismo analizado: Salmonella sp
Dilucin utilizada: 10-1 g/ml

MUESTRA: ESPINACA SIN TRATAMIENTO

Agente microbiano CONTEO 1 CONTEO 2 RESULTADO L.M.P

Salmonella Presencia/25g Presencia/25g Presencia/25g Ausencia/25g

 MUESTRA: ESPINACA CON TRATAMIENTO (1%)

Agente microbiano CONTEO 1 CONTEO 2 RESULTADO L.M.P

Escherichia
Coli
4*102 ufc/g 7*102 ufc/g 550 ufc/g 102 ufc/g

Salmonella Presencia/25g Ausencia/25g Presencia/25g Ausencia/25g

TRATAMIENTO DE E. COLI AL 1%
 B. SEGUNDA SEMANA

MUESTRA: ESPINACA CON TRATAMIENTO (2%)

Agente microbiano CONTEO 1 CONTEO 2 RESULTADO L.M.P

Escherichia
Coli
7*102 ufc/g 1*102 ufc/g 400 ufc/g 102 ufc/g

Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia /25g Ausencia/25g

TRATAMIENTO DE E. COLI AL 2%

TRATAMIENTO DE SALMONELLA AL 2%
 C. TERCERA SEMANA

MUESTRA: ESPINACA CON TRATAMIENTO (4%)

Agente microbiano CONTEO 1 CONTEO 2 RESULTADO L.M.P

Escherichia
Coli
0 ufc/g 5*102 ufc/g 250 ufc/g 102 ufc/g

Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia /25g Ausencia/25g

TRATAMIENTO DE E. COLI AL 4%

TRATAMIENTO DE SALMONELLA AL 4%
 MUESTRA: ESPINACA CON TRATAMIENTO (6%)

Agente microbiano CONTEO 1 CONTEO 2 RESULTADO L.M.P

Escherichia
Coli
0 ufc/g 1*102 ufc/g 50 ufc/g 102 ufc/g

Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia /25g Ausencia/25g

TRATAMIENTO DE E. COLI AL 6%

TRATAMIENTO DE SALMONELLA AL 6%
DISCUCIN DE RESULTADOS

Realizamos una grfica que determina el comportamiento de los microorganismos

respecto a las concentraciones usadas de cido ctrico.

SEMANA %A. CITRICO E. COLI (ufc/g) SALMONELLA

1 0 5*102 57*10/25g
1 5.5*102 Presencia/25g
2 2 4*102 Ausencia/25g
3 4 2*102 Ausencia/25g
6 1*102 Ausencia/25g

GRFICA 1

GRFICA 2
 GRFICA 3

De las grficas concluimos:

Los microorganismos de E.coli fueron disminuyendo paulatinamente

semana tras semana, aumentando la concentracin de cido ctrico,
como agente desinfectante.

Los microorganismos de Salmonella sp, se redujeron de manera ms

eficaz en comparacin con la E.coli, ya que a partir del tratamiento de
la segunda semana, se inhibi su carga microbiana.
VII. CONCLUSIONES

Los resultados del anlisis microbiolgico de la espinaca, desinfectada con

cido ctrico en solucin, a distintos porcentajes p/v fueron satisfactorios,
ya que se logr reducir e inhibir la carga microbiana de E. coli y salmonella
respectivamente.

A partir de la segunda semana de investigacin, en la cual el % p/v de cido

ctrico vara desde 2% hasta 6%, se lleg a inhibir la carga microbiana de
salmonella sp en la muestra analizada (espinaca).

La concentracin de cido ctrico al 6% p/v tuvo un mayor efecto de

reduccin en la poblacin microbiana de E. Coli en la muestra analizada
(espinaca), pues se redujo hasta el mximo limite permisible (Segn R.M
591-2008 MINSA) 1*102 ufc/g, de la misma forma, sucedi con la inhibicin
de la carga microbiana de salmonella a dicha concentracin de cido ctrico,
dando como resultado ausencia/25g, por lo tanto, se considera apta para el
consumo humano.

VIII. RECOMENDACIONES

Desarrollar todas las actividades del laboratorio con los mayores cuidados
de asepsia.
En todo momento no se debe de retirar los implementos personales ya que
podra contaminarse la muestra.
Pesar la muestra, sal y el cido ctrico con mucho cuidado para tener una
buena precisin y exactitud.
Fundir bien los agares y tenerlos a su temperatura adecuada antes de
agregarlos a las placas Petri para que no se forme grumos.
Antes de realizar la desinfeccin de la espinaca con cido ctrico, es
necesario enjuagar la muestra con agua potable.
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Proyecto especial de graduacin Ingenieros en Agroindustria Alimentaria,

Efecto del uso de cido actico, ctrico e hipoclorito de calcio para
 control de Escherichia coli(ATCC 25922)en lechuga (Lactuca sativaL.)y
chile dulce (Capsicum annuum L.) - Mario Mendoza Velsquez y Flix
Roberto Cantor Barreiro(2012).

Publicacin de la Revista Iberoamericana de Tecnologa Postcosecha,

Lavado y desinfeccin de espinaca (Spinacia Oleracea L.):
Evaluacin de desinfectantes alternativos al hipoclorito de sodio-
Alejandra Rubinstein , Rosa Jagus y Victoria Agero (2013).

Trabajo de graduacin previo a la opcin al grado de Ingeniera de

Alimentos, Evaluacin de mtodos de desinfeccin para hortalizas que se
consumen en crudo- Mara Antonieta Campos Durn y Wendy Aymeth
Manzano Polo (2007).

www.digesa.minsa.gob.pe/DEPA/BD_plaguicidas/DESINFECTANTES_NAC
IONALES_MAY2012.pdf
www.redalyc.org/pdf/813/81327871013.pdf
 X. ANEXOS

ANEXO 1
RELACIN DE DESINFECTANTES Y PLAGUICIDAS VIGENTES SEGN
DIGESA

DESINFECTANTES APROBADOS POR DIGESA

Para el trabajo de laboratorio se har uso del desinfectante CLOROX, que segn la direccin
General de Salud (DIGESA) est permitido su uso ya que para poder realizar una buena prctica
y la no contaminacin de otros agentes patgenos que no sean el E. coli y Salmonella sp.
Propios de la espinaca, evita as la contaminacin en la lectura de los resultados.

Es importante la asepsia y desinfeccin de los materiales da usar en el laboratorio as como

tambin del mismo estudiante, todo esto genera una buena prctica.

A continuacin se muestra una tabla donde estn algunos de los desinfectantes usados y
aprobados por DIGESA.
DESINFECTANTES NACIONALES APROBADOS POR DIGESA