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BlOMEDlCA

Vol. 8, NOS.1 v 2 - 1988

ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE


ADN GENOM ICO DE Plasmodium falciparum

FERNANDO ANGEL S.*, RAMON MANTILLA*, MOISES WASSERMAN*, **

Se describe la preparacin de plsmidos pUC18 recombinantes


provenientes de la construccin de una biblioteca genmica del parsito
Plasmodium falciparum usando una modificacin del mtodo de lisis
alcalina (1). La cantidad de plsmido producido es suficiente para llevar
a cabo varios anlisis de digestin con enzimas de restriccin y
electroforesis en geles de agarosa.

INTRODUCCION biblioteca genmica de Plasmodium falciparum cons-


truida en el plsmido pUC18 (10-12). La cantidad de
Para determinar si una bacteria posee un plsmido plsmido producida por el mtodo usado oscila entre
en su interior, es necesario aislar el ADN mediante 3 y 5 ug, lo que permite llevar a cabo entre 10 y 15
varias etapas sucesivas. El ADN cromosomal y el anlisis electroforticos en minigeles de agarosa, de
plasmdico son generalmente extraidos a partir de bac- cada plsmido extraido.
terias que han sido tratadas con lisozima y lisadas con
un detergente. Posteriormente el ADN es liberado de MATERIALES Y METODOS
ARN y de protenas mediante tratamientoscon ribonu-
cleasa y proteasa. Despus de sucesivas extracciones Cultivo Bacteriano
fenlicas, el ADN plasmdico circular es purificado
en un gradiente de CsCl en presencia de bromuro de Se utiliz la bacteria Escherichia coli JM83 transfor-
etidio (2). mada con el plsmido pUC18 recombinado (10-14).
Las bacterias de la misma cepa, conteniendo el pls-
Varios mtodos para la preparacin de plsmidos mido pUC18 no recombinado, fueron usadas como
recombinantes a partir de Escherichia coli han sido control.
descritos (3-8), siendo el mtodo de la lisis alcalina
uno de los ms usados por su sencillez y buen rendi- A partir de una colonia transformada, se inocul
miento (9). Sin embargo, este mtodo no es ideal con un asa estril, un volumen de 2,5 m1 de medio
cuando se requiere examinar un gran nmero de clones de cultivo TB, suplementado con ampicilina en una
de una forma rpida. Con el fin de resolver estos concentracin de 25 uglml (15). El cultivo fue incu-
problemas, una modificacin del mtodo de lisis alca- bado a 37C durante 15 horas.
lina fue establecida (l), permitiendo aislar plsmidos
recombinantes a partir de cultivos de poco volumen Lisis alcalina
y facilitando de esta forma el anlisis de una gran
cantidad de clones en corto tiempo. Las clulas bacterianas fueron recuperadas tomando
1,3 m1 del cultivo en un tubo de polipropileno de 1,6
En el presente trabajo se describe el anlisis por m1 por centrifugacin a 1600xg durante 10 minutos a
dicho mtodo de varios plsmidos pUC18 recombina- 4C en una microcentrfuga Tomy MR 150. El sobre-
dos. Los plsmidos recombinantes provienen de una nandante fue desechado y 1,2 m1 de cultivo fueron

Grupo de Bioquimica. Instituto Nacional de Salud.


""Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia
F. ANGEL, R. MANTILLA, M. WASSERMAN

centrifugados de la misma forma. Una vez eliminado lavado con 0.5 m1 de etanol absoluto y recuperado
el sobrenandante, el precipitado fue suspendido en 1 nuevamente por centrifugacin a 12000xg durante 10
m1 de tampn STE (IOmM Tris HCl pH 8.0 - l00mM minutos, a 4C. El sobrenadante fue eliminado y el
NaCl - 1mM EDTA) y precipitado nuevamente por precipitado se dej secar colocando el tubo invertido
centrifugacin a 1600xg durante 10 minutos a 4C. sobre un papel absorbente. Una vez seco, el precipi-
El sobrenadante fue eliminado por aspiracin dejando tado fue disuelto en 50 u1 de tampn TE conteniendo
el precipitado lo ms seco posible. ribonucleasa A en una concentracin final de 50 uglml.
La solucin fue incubada por 10 minutos a 37C e
El precipitado fue resuspendido en 0,2 m1 de tampn inmediatamente despus analizada por electroforesis.
de lisis (50mm glucosa - lOmm EDTA - 25mM Tris-
HCl pH 8.0 - lisozima 10 mglml), homogenizado y Electroforesis y Digestin
mantenido 10 minutos a temperatura ambiente. Poste-
riormente, 0,4 ml de solucin alcalina fra (NaOH Con el fin de determinar la concentracin de ADN
0,2N-SDS 1%) preparada en el momento de usar, plasmdico obtenido, una pequea cantidad del prepa-
fueron agregados a la suspensin. La solucin fue rado final (2-5111) fue comparada con ADN plasmdico
mezclada por inversin del tubo y mantenida en hielo patrn, de concentracin conocida, mediante electro-
por 5 minutos. Luego fueron agregados 0,3 ml de una foresis en un gel de agarosa al 1%. Alternativamente,
solucin de acetato de potasio 3M (pH 4.8) (16), mez- tambin se us la tcnica de fluorescencia, emitida
clados durante 10 segundos y la mezcla final fue incu- por coloracin con bromuro de etidio para determinar
bada en hielo por 15 minutos; posteriormente fue cen- la concentracin de ADN plasmdico obtenido (16).
trifugada a 6&0xg durante O minutos a 4C y el
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo, teniendo Una vez establecida la concentracin de ADN plas-
cuidado de no pasar partculas de precipitado. El vo- mdico, se digirieron con la enzima de restriccin
lumen correspondiente al sobrenadanterecuperado os- apropiada entre 100 y 300 nanogramos del plsmido
cil en todos los experimentos entre 0,80 y 0,85 rnl. a 37C; los fragmentos generados por la digestin
fueron separados por electroforesis.
Una mezcla fenol-cloroformo en un volumen de 0,6.
ml, fue agregada al sobrenadante y la solucin resul- RESULTADOS
tante fue mezclada por inversin suave varias veces Para determinar la presencia de plsmidos recombi-
durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Despus nantes a partir de varios clones provenientes de una
de la centrifugacin a 800xg durante 5 minutos, a Genoteca de ADN de Plasmodium falcipmm, se us
temperatura ambiente, la fase acuosa superior fue re- el mtodo de minipreparacin por lisis alcalina (1).
cuperada (0,75 ml), transferida a un nuevo tubo y
extrada nuevamente con 0,75 m1 de una nueva mezcla Inicialmente se hicieron ensayos omitiendo la diges-
fenol-cloroformo. Despus de centrifugar como se tin del preparado final con ribonucleasa A y precipi-
describi anteriormente, la fase acuosa fue recuperada tando el ADN plasmdico con etanol absoluto, en lugar
(0,6 ml) y extraida con un volumen igual de clorofor- de isopropanol. En la Figura 1 se muestra claramente
mo. La fase acuosa (0,45 - 0,50 ml) fue transferida la cantidad de ARN presente en los minipreparad os
a un nuevo tubo y extraida 2 veces con igual volumen (carriles b-k) comparados con plsmido purificado en
de ter etlico saturado en tampn TE (lOmM Tris-HC1 gradiente de cloruro de cesio usado como control (ca-
pH 7.5-lmM EDTA). El ter fue eliminado comple- rriles a, l ' m).
tamente por calentamiento a 68C durante 10 minutos.
La solucin se dej enfriar a temperatura ambiente y Con el fin de eliminar el ARN, los preparados fueron
0.6 volmenes de isopropanol fueron agregados. Des- incubados con ribonucleasa A.como se describi en
pus de mezclar suavemente, el ADN fue precipitado materiales y mtodos. Bajo estas condiciones el ARN
a temperatura ambiente durante 5 minutos. fue eliminado en gran parte pero no totalmente (resul-
tados no mostrados). La precipitacin con isopropa-
El ADN precipitado fue recuperado por centrifuga- nol, adems de la digestin con ribonucleasa A, per-
cin a 7000xg por 30 minutos, a temperatura ambiente. mitieron eliminar el ARN eficientemente como se ob-
El sobrenadante fue eliminado y el precipitado fue serva en la Figura 2.
ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE ADN GENOMICO DE Plasmodium falcigarum

os con ribonucleasa A

describid en

Fig. 2. AnBlisis electrofor6tico de los


mismos preparados de la figura 1
precipitados con isopropanol y tratados con
ribonucleasa A. Carriles a-e, g-k: diferentes
preparados tratados como se describi.

Los preparados ya libres de ARN fueron analizados ADN del parsito y analizados en este trabajo, oscila
por electroforesisen geles de agarosa, antes y despus entre 0,3 Kb y 10 Kb. Adems mostraron claramente
de digestin. Los preparados sin digerir muestran los que stos estn libres de contaminacin por ADN bac-
diferentes grados de enrollamiento que presentan las teriano y por ARN. La eliminacin total del ARN es
molculas de ADN circulares (Figura 3A). muy importante ya que la presencia de ste enmarca-
rara fcilmente fragmentos de bajo peso molecular
Los preparados digeridos con la enzima EcoRI mos- como es el caso de 4 de los fragmentos analizados
traron que el tamao de los fragmentos clonados de (Figura 3B, carriles d, e, f, g).
F. ANGEL, R. MANTILLA. M . WASSERMAN

Fig.3. 25 diferentes preparados separados por electroforesis en gel de agarosa.

A. Preparados sin digerir


a: ADN de lambda digerido con Hind III
b: plsmido pUC18
c: mezcla de plsmidos recombinados
d-z: diferentes preparados sin digerir.

a: plsmido pUC18
b: mezcla de plsmidos recombinados
c-z: diferentes preparados digeridos
A: ADN de lambda diferido con Hind III
Los pesos moleculares son expresados en kilobases (kb).
ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE ADN GENOMICO DE Plasmodium falciparum

DISCUSION a modification of alkaline lysis method (1). This met-


hod yields a quantity of plasmid DNA that is suficient
La preparacin rpida y el anlisis de plsmidos a for subsequent analysis by restriction digestion and
partir de pequeos cultivos, es esencial en estudios agarose electrophoresis.
de biologa molecular y de resistencia de bacterias a
diferentes antibiticos. Varios mtodos para la prepa-
AGRADECIMIENTOS
racin rpida de plsmidos, que permiten el anlisis
de muchas muestras en poco tiempo a partir de peque-
Este trabajo fue realizado con la ayuda de JICA,
os cultivos, han sido descritos (7-9, 17, 18), siendo
Japan Intemational Cooperation Agency y el Fondo
el mtodo de la lisis alcalina uno de los ms usados
de Investigaciones Francisco Jos de Caldas "Colcien-
por su sencillez y buen rendimiento (1).
cias".
Nosotros analizamos 25 plsmidos recombinantes
provenientes de una genoteca de ADN de Plasmwlium
falcpamm constmida en el plsmido pUC 18 (10- 12).
Las preparaciones obtenidas mostraron un alto grado 1. Isch-Horowicz D, Burke JF. Rapid and efficient cosmid
de pureza, ya que se elimin eficientemente el ARN cloning. Nucleic Acids Res. 1981; 9: 2989.
y el ADN bacteriano, como fue verificado por electro-
2. Radloff R, Bauer W, Vinograd J. A dye-buoyant density
foresis (Figura 2). La eliminacin de ARN es esencial,
method for the detection and isolation of closed circular du-
ya que la presencia de ste hubiera imposibilitado la plex DNA: The closed DNA in Hela cells. Proc Natl Acad
visualizacin de fragmentos de bajo peso molecular Sci U.S.A. 1967; 57: 1514.
(Figura 3B, carriles d, e, f, g).
3. Meyers JA, Sbnchez D. Simple gel electrophoreticmethod
La cantidad de plsmido producido a partir de 2,5 for the identification and characterization of plasmid deoxy-
ribonucleic acid. J Bacteriol. 1976; 127: 1529.
m1 de cultivo fue de 3 a 5 ug, cantidad que permite
llevar a cabo de 10 a 15 electroforesis en agarosa. En 4. Barnes WM. Plamid detection and sizing in single colony
el caso de producir plsmido pUC 18, el rendimiento lysates. Science 1977; 195: 393.
es cerca de cinco veces mayor, cuando se usa el medio
TB que cuando se usa el medio LB corrientemente 5. Michel S, Arena V, Bauer W. Physical properties and gel
utilizado; este resultado ha sido recientemente infor- electrophoresis behavior of R12-denved plasmid DNAs. Nu-
cleic Acids Res. 1977: 4: 1465.
mado (15) y ha sido verificado por nosotros tanto en
pequeos como en grandes preparaciones de dicho 6. Telford J, Boseley P. Novel screeningprocedureforrecom-
plsmido. binant plasmids. Science 1977; 195: 391.

El mtodo de minipreparacin por lisis alcalina nos 7. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid
permiti hacer un anlisis de 25 muestras en un solo deoxyrbonucleic acid in bacteria. Plasmid 1978; 1: 584.
da, 10 cual es ~ n ventaja
a cuando se quieren analiza 8. Klein RD, selsing E, Wells,RD, A rapid microscale tech-
clones recombinantes provenientes de la construccin nique for isolation of recombinant plasmid DNA for restic-
de una biblioteca genmica. tion enzyme analysis. Plasmid 1980; 3: 68.

Los fragmentos analizados aqu debern ser estudia- 9. Birnboin HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure
dos en ms detalle, debido a que son elementos muy for screening recombinat plasmid DNA. Nucleic Acids Res.
1979; 7: 1513.
tiles para el diagnstico de la malaria por hibridacin
mO1eculary para llevar a cabo sobre la biolo- 10. Angel F, Mantilla R, Wasserman M. Clonaje molecular
ga del parsito. del DNA de Plasmoium falcipamm (FCB-1). 11 Congreso
Latinoamericano de Medicina Tropical, Mayo 25-29, 1987.
Si'i4MAi?Y . Bogot (Colombia).

11. Mantilla R. Construccin de una biblioteca genmica de


We describe here the growth and preparation of Plasmodium falcipamm e identificacin de clones por hibridi-
pUC 18 recombinant plasmids from a Plasmodjum fd- zacin. Tesis Ms.Sc., Facultad de Qumica, Universidad Na-
cipmm genomic DNA library. The protocol used is cional de Colombia, 1988.
F. ANGEL, R. MANTILLA, M. WASSERMAN

12. Lpez E, Acosta H. Caracterizacin de fragmentos genmi- 15. Tartof KD, Hobbs CA. Improved media for growingplasmid
cos de ADN de Plasmodium falciparum generados con la and cosmid clones. Focus, BRL 1987; 9(2): 12.
enzima EcoRI y clonados en el plsmido pUC18. Tesis de
Grado, Facultad de Qumica, Universidad Nacional de Co- 16. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning.
lombia, 1988. A laboratory manual. Cold Spnng Harbor Laboratory; Cold
Spring Harbor 1982.
13. Viera J, Messing J. ThepUCplasmids, anM13mp7denved
system for insertion mutagenesis and sequencing with synthe- 17. Kado CI, Liu ST. Rapid procedure for detection and isolation.
tic universal primers. Gene 1982; 19: 259. of latge and small plasmids. J Bacteriol. 1981; 141: 1365.

14. Ruther U. Constmction and properties of a new cloning 18. Gibson TJ, Sulston JC. Preparation of large numbers of
vehicle, allowing d i t screening for recombinant plasmids. plasmid DNA samples in microtiter plates by the alkalyne
Molec Gen Genet. 1980; 178: 475. lysis method. Gene Anal Techn. 1987; 4: 41.

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