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centrifugados de la misma forma. Una vez eliminado lavado con 0.5 m1 de etanol absoluto y recuperado
el sobrenandante, el precipitado fue suspendido en 1 nuevamente por centrifugacin a 12000xg durante 10
m1 de tampn STE (IOmM Tris HCl pH 8.0 - l00mM minutos, a 4C. El sobrenadante fue eliminado y el
NaCl - 1mM EDTA) y precipitado nuevamente por precipitado se dej secar colocando el tubo invertido
centrifugacin a 1600xg durante 10 minutos a 4C. sobre un papel absorbente. Una vez seco, el precipi-
El sobrenadante fue eliminado por aspiracin dejando tado fue disuelto en 50 u1 de tampn TE conteniendo
el precipitado lo ms seco posible. ribonucleasa A en una concentracin final de 50 uglml.
La solucin fue incubada por 10 minutos a 37C e
El precipitado fue resuspendido en 0,2 m1 de tampn inmediatamente despus analizada por electroforesis.
de lisis (50mm glucosa - lOmm EDTA - 25mM Tris-
HCl pH 8.0 - lisozima 10 mglml), homogenizado y Electroforesis y Digestin
mantenido 10 minutos a temperatura ambiente. Poste-
riormente, 0,4 ml de solucin alcalina fra (NaOH Con el fin de determinar la concentracin de ADN
0,2N-SDS 1%) preparada en el momento de usar, plasmdico obtenido, una pequea cantidad del prepa-
fueron agregados a la suspensin. La solucin fue rado final (2-5111) fue comparada con ADN plasmdico
mezclada por inversin del tubo y mantenida en hielo patrn, de concentracin conocida, mediante electro-
por 5 minutos. Luego fueron agregados 0,3 ml de una foresis en un gel de agarosa al 1%. Alternativamente,
solucin de acetato de potasio 3M (pH 4.8) (16), mez- tambin se us la tcnica de fluorescencia, emitida
clados durante 10 segundos y la mezcla final fue incu- por coloracin con bromuro de etidio para determinar
bada en hielo por 15 minutos; posteriormente fue cen- la concentracin de ADN plasmdico obtenido (16).
trifugada a 6&0xg durante O minutos a 4C y el
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo, teniendo Una vez establecida la concentracin de ADN plas-
cuidado de no pasar partculas de precipitado. El vo- mdico, se digirieron con la enzima de restriccin
lumen correspondiente al sobrenadanterecuperado os- apropiada entre 100 y 300 nanogramos del plsmido
cil en todos los experimentos entre 0,80 y 0,85 rnl. a 37C; los fragmentos generados por la digestin
fueron separados por electroforesis.
Una mezcla fenol-cloroformo en un volumen de 0,6.
ml, fue agregada al sobrenadante y la solucin resul- RESULTADOS
tante fue mezclada por inversin suave varias veces Para determinar la presencia de plsmidos recombi-
durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Despus nantes a partir de varios clones provenientes de una
de la centrifugacin a 800xg durante 5 minutos, a Genoteca de ADN de Plasmodium falcipmm, se us
temperatura ambiente, la fase acuosa superior fue re- el mtodo de minipreparacin por lisis alcalina (1).
cuperada (0,75 ml), transferida a un nuevo tubo y
extrada nuevamente con 0,75 m1 de una nueva mezcla Inicialmente se hicieron ensayos omitiendo la diges-
fenol-cloroformo. Despus de centrifugar como se tin del preparado final con ribonucleasa A y precipi-
describi anteriormente, la fase acuosa fue recuperada tando el ADN plasmdico con etanol absoluto, en lugar
(0,6 ml) y extraida con un volumen igual de clorofor- de isopropanol. En la Figura 1 se muestra claramente
mo. La fase acuosa (0,45 - 0,50 ml) fue transferida la cantidad de ARN presente en los minipreparad os
a un nuevo tubo y extraida 2 veces con igual volumen (carriles b-k) comparados con plsmido purificado en
de ter etlico saturado en tampn TE (lOmM Tris-HC1 gradiente de cloruro de cesio usado como control (ca-
pH 7.5-lmM EDTA). El ter fue eliminado comple- rriles a, l ' m).
tamente por calentamiento a 68C durante 10 minutos.
La solucin se dej enfriar a temperatura ambiente y Con el fin de eliminar el ARN, los preparados fueron
0.6 volmenes de isopropanol fueron agregados. Des- incubados con ribonucleasa A.como se describi en
pus de mezclar suavemente, el ADN fue precipitado materiales y mtodos. Bajo estas condiciones el ARN
a temperatura ambiente durante 5 minutos. fue eliminado en gran parte pero no totalmente (resul-
tados no mostrados). La precipitacin con isopropa-
El ADN precipitado fue recuperado por centrifuga- nol, adems de la digestin con ribonucleasa A, per-
cin a 7000xg por 30 minutos, a temperatura ambiente. mitieron eliminar el ARN eficientemente como se ob-
El sobrenadante fue eliminado y el precipitado fue serva en la Figura 2.
ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE ADN GENOMICO DE Plasmodium falcigarum
os con ribonucleasa A
describid en
Los preparados ya libres de ARN fueron analizados ADN del parsito y analizados en este trabajo, oscila
por electroforesisen geles de agarosa, antes y despus entre 0,3 Kb y 10 Kb. Adems mostraron claramente
de digestin. Los preparados sin digerir muestran los que stos estn libres de contaminacin por ADN bac-
diferentes grados de enrollamiento que presentan las teriano y por ARN. La eliminacin total del ARN es
molculas de ADN circulares (Figura 3A). muy importante ya que la presencia de ste enmarca-
rara fcilmente fragmentos de bajo peso molecular
Los preparados digeridos con la enzima EcoRI mos- como es el caso de 4 de los fragmentos analizados
traron que el tamao de los fragmentos clonados de (Figura 3B, carriles d, e, f, g).
F. ANGEL, R. MANTILLA. M . WASSERMAN
a: plsmido pUC18
b: mezcla de plsmidos recombinados
c-z: diferentes preparados digeridos
A: ADN de lambda diferido con Hind III
Los pesos moleculares son expresados en kilobases (kb).
ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE ADN GENOMICO DE Plasmodium falciparum
El mtodo de minipreparacin por lisis alcalina nos 7. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid
permiti hacer un anlisis de 25 muestras en un solo deoxyrbonucleic acid in bacteria. Plasmid 1978; 1: 584.
da, 10 cual es ~ n ventaja
a cuando se quieren analiza 8. Klein RD, selsing E, Wells,RD, A rapid microscale tech-
clones recombinantes provenientes de la construccin nique for isolation of recombinant plasmid DNA for restic-
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Los fragmentos analizados aqu debern ser estudia- 9. Birnboin HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure
dos en ms detalle, debido a que son elementos muy for screening recombinat plasmid DNA. Nucleic Acids Res.
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tiles para el diagnstico de la malaria por hibridacin
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