COPROCULTIVO

Fundamento

La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente
amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (Bacteroides, bacilos
Gram positivos, Estreptococos), microorganismos entricos gran negativos y Enterococcus
fecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la separacin de
las especies patgenas, usualmente a travs del empleo de medios selectivos diferenciales y de
cultivos enriquecidos. Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen
a los virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos entricos gran
negativos invasores, los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la
Campilobacter. La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las
distintas partes del mundo.

Las heces y los raspados rectales son los especmenes de que se dispone con mayor
facilidad. Debe anotarse, en el examen macroscpico la presencia de sangre, moco o helmintos
en la inspeccin inicial. Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo como el Caldo de
Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios, as como en medios selectivos diferenciales,
por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para permitir la separacin de los bacilos
gran negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entricas comunes.

Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos

microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse para
diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que deben
realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en la muestra
como son las pruebas bioqumicas.

Material

Agua destilada
Gradilla
Tubos de ensayo
Asa de siembra desechable y normales
Hisopo
Papel de filtro
Pipetas de vidrio
Medios de cultivo
Pinzas metlicas
Alcohol
Algodn graso
Vaso de precipitado
Mechero Bunsen
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio
Cubeta de tincin
Pinzas de madera
Frasco lavador
Reactivos:

Medios de cultivo para aislamiento:

Agar sangre
Agar Mc Conkey
Agar entrico Hektoen (HK)

Medios para pruebas bioqumicas:

Agar Christensen
KIA

Colorantes para tincin de Gram: Lugol, cristal violeta, fucsina bsica, alcohol

Muestras:

Heces de adulto.

Procedimiento

El procedimiento fue el siguiente:

1. Recogida de la muestra

Preparacin o indicaciones del paciente: Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas.

A. Para nios/as

Para bebs y nios pequeos que usan paales:

Se puede cubrir el paal con un envoltorio plstico. Si se coloca correctamente el envoltorio

plstico, separando las heces de la orina, se puede evitar que stas se mezclen con el fin de
obtener una muestra mejor.

B. Para adultos

Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la ayuda
de un envoltorio plstico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el
asiento. Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para recoleccin de la
muestra trae una gasa especial que se usa para recogerla y luego se coloca la muestra en un
recipiente limpio.

1.1.Condiciones para la toma de muestras

Heces que no tengan ms de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente

del recto con un hisopo de algodn. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato
o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de
heces en 1 ml de un lquido conservador, o bien, depositar en ste el hisopo rectal.
Muestra de heces de 12 o 24 hrs.

Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la

esterilidad. El anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la muestra
en el frigorfico a 4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir un volumen
igual al de las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial.

1.2.Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio.

Evitar contaminacin por material no estril.

Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.
Etiquetar muestra adecuadamente.
Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana.

2. Examen macroscpico de la muestra

Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin

digerir.

3. Examen y en fresco.

Observacin en el microscopio: lugol- fresco:

En fresco: Colocamos una gota diluida en agua destila de la muestra en un portaobjetos

y colocamos un cubre encima.

Se realiza una dilucin en un tubo de ensayo con una pequea cantidad de heces
recogida con la ayuda de un asa de siembra desechable y se le aade un poco de agua destilada,
se agita un poco y se obtiene una gota de esta dilucin. Dicha gota la colocamos en un
portaobjetos y aadimos una gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima para
su posterior Observacin al microscopio.

Otro mtodo de observacin es realizando el mismo procedimiento, pero sustituyendo

el Lugol por el negro sudan. Esta tincin est indicada para la observacin de grasa.

Prueba de parasitologa:

Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parsitos.

En nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una sintomatologa
como diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores clicos, elevacin de eosinfilos en
sangre u otros sntomas.

En el examen de parasitologa se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se

agrega una gota de Lugol.

Con un bote de muestra colocar una gasa y aadir 50 ml de suero fisiolgico para poder
filtrar dicha muestra. Al liquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y
se centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el sedimento que
observaremos con una gota de Lugol aadida para poder observar mejor.
Realizacin de medios de cultivo y siembra

Siembra e inoculacin de placas

Se procede a realizar la siembra, en estra mltiple, con la ayuda de un asa de siembra,

tomando una pequea cantidad de inculo de las heces, previamente diluido en suero, teniendo
en cuenta de trabajar en condiciones lo ms aspticas posibles. Se tapa la placa y se mete en la
estufa en un periodo de 24-48 horas.

Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscpicamente y

al microscopio.

Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada
microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma, tamao,
textura, olor, brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes enteros,
estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubacin necesario para que aparezcan
las colonias tambin puede tener valor en la identificacin. Las caractersticas de las colonias
tampoco ofrecen un diagnstico por si solas, pero dirigen los esfuerzos hacia un grupo ms o
menos amplio de microorganismos.

Hay colonias muy caractersticas, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso de

las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo muy
caracterstico.
 1. Examen microscpico

Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa
de Petri y se obtiene una pequea muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca en un
porta previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la muestra lo
podremos realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y cuidando de no
quemarnos lo haremos con la ayuda de una pinza de madera.

A continuacin, se procede a teir la muestra.

Tincin azul de metileno:

El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el

portaobjeto por el mechero varias veces. Luego se tie con el azul de metileno cubrindola
entera. Pasado 5 min. Se lava con agua destilada se deja secar y se proceder a observar en el
microscopio con aceite de inmersin y en el objetivo de 100x.

Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. As:

Presencia de leucocitos: La infeccin ha cursado con inflamacin intestinal. Se trata por

tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella.
Ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamacin por lo que la infeccin
puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas (Vibrio cholerae).

Para realizar la tincin de Gram:

Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con

tres colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca despus en la cubeta para
proceder a teirla.

Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de Lugol, 30 seg y 1 min de
fucsina bsica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante adems del alcohol y se
deja secar.

Esta tincin nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram segn sea la
composicin de su pared y apreciar visualmente su forma y organizacin.

2. Realizacin de pruebas bioqumicas

Prueba KIA: Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C
durante 18-24 horas. Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la
capacidad que tienen las enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o
lactosa, produccin de gas y de cido sulfhdrico.
B-GALACTOSIDASA: Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la
lactosa. Esta prueba la realizaremos preparando una suspensin densa del
microorganismo en un tubo donde aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para
despus aadir el disco de ONPG. Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el
resultado.
OXIDASA :Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo
oxidasa descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser
 aerobio o anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una
muestra de la colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reaccin que
produce cambiando de color.
CATALASA: Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se
coloca sobre un portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno
observando si produce o no burbujas.
UREASA: Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen
en tubo inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una
incubacin a 37C con un cambio de color del indicador.
UROCULTIVO

El urocultivo es el cultivo de orina para diagnosticar infeccin sintomtica del tracto

urinario o infeccin asintomtica (bacteriuria asintomtica) en pacientes con riesgo de
infeccin.

Est basada en la presencia de un nmero significativo de bacterias (generalmente

>100.000 bacterias/ml.)

La piuria, junto con la bacteriuria, es un dato muy importante para el diagnstico de

infeccin del tracto urinario, ya que prcticamente est presente en todas las infecciones
urinarias. Una excepcin es la bacteriuria asintomtica en la que la piuria puede estar ausente.

Agentes etiolgicos a investigar rutinariamente

Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Serratia spp.
Enterococus spp.
Proteus spp.
Pseudomonas spp.
Acinetobacter spp.
Candida spp.
Staphylococus spp.
Estreptococo grupo B (imprescindible en embarazadas)

Recogida de muestras

Para la recogida, transporte y manipulacin de muestras podrn tenerse en cuenta los

protocolos establecidos por la SEIMC.

La correcta recogida y conservacin de la orina para urocultivos es fundamental para

que puedan obtenerse resultados fiables.

Los puntos clave son:

- Mujeres: Obtencin de la orina despus de separar los labios vaginales de manera que el
chorro de orina no toque genitales externos.

- Hombres: Retraccin del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente.
Examen microscpico (recomendado)

El procedimiento elegido debe permitir:

Recuento de leucocitos al menos semicuantitativo

Deteccin de clulas epiteliales (CE): su presencia indica muy probablemente
contaminacin de la muestra por contacto con genitales externos. Ante un resultado
(urocultivo) positivo si se observa presencia de clulas epiteliales debe pedirse nueva
muestra para confirmar.

Cultivo

Debe permitir el aislamiento y el recuento cuantitativo desde 1.000 10.000 Unidades

Formadoras de Colonias (UFC)/ml. de los uropatgenos ms comunes:

Se sembrar cuantitativamente, generalmente con asa calibrada de 1 10 ml. en uno de

los siguientes medios en placa:

Cled
Agar cromognico de orina o
Agar sangre + agar MacConkey (Levine)

Incubar a 35-37 C en aerobiosis durante 24-48 horas.

Lectura de cultivo en UFC/ml:

- Menos de 1.000 10.000 UFC, se informar: Menos de 1.000 10.000

UFC/ml.

- De 10.000 a 100.000 UFC.

- Un patgeno sin clulas epiteliales: informar microorganismo, nmero de colonias,

antibiograma y valorar clnicamente

- Dos patgenos: informar microorganismos, nmero de colonias y solicitar nueva muestra.

- Ms de dos patgenos: informar Cultivo mixto, probable contaminacin.

- > 100.000 ms UFC:

Uno o dos patgenos: informar identificacin ms antibiograma.

Ms de dos especies: informar cultivo mixto, probable contaminacin.

Situaciones especiales

1. En embarazadas adicionar (sembrando con escobilln) medio de Granada o Agar sangre

nalidxico. El primero se incubar en anaerobiosis (o bajo un cubre) y el segundo en 5-7%
CO2. Estreptococo grupo B en embarazadas, se informar en cualquier cantidad.
2. Orinas obtenidas por tcnica invasiva (puncin suprapbica o por citoscopia): Sembrar
siempre con asa calibrada o con pipeta estril al menos 10 ml. Incluyendo una placa de agar
sangre. Reincubar hasta 48 horas y tomar como significativo cualquier crecimiento a partir
de 100 UFC /ml. La orina de puncin suprapbica es la muestra adecuada para
investigacin de Anaerobios o de mycoplasmas genitales. Si se considera procedente o se
solicita por el clnico en una muestra adecuada estas muestras se trabajarn para deteccin
de estos microorganismos y se informar el resultado.
3. En orinas obtenidas y conservadas con garanta de que se ha evitado la contaminacin y en
enfermos sintomticos en que urocultivos previos no hayan ofrecido un nmero
significativo de colonias se podran estudiar microorganismos ms exigentes y recuentos
ms bajos. Por ejemplo sembrando ms cantidad de muestras (0,1 ml.) en agar sangre e
incubando las placas 48 72 horas.
4. Solicitud por el clnico de investigacin de otros microorganismos. Si la muestra es correcta
y la peticin esta motivada se debe efectuar el procedimiento de trabajo adecuado a la
solicitud.
5. Para el cultivo de se tendr en cuenta lo establecido en el protocolo de la SEIMC de
diagnstico de Micobacterias.

NO SE CULTIVARN NUNCA por no ser muestras adecuadas:

Catteres de Foley.
Orina de miccin o de catter para anaerobios.
Orinas de ms de 2 horas de su recogida sin conservacin adecuada.

En caso de que no exista posibilidad de recibir las muestras de orina en el laboratorio con
menos de dos horas desde el momento de la recogida y no se puedan refrigerar las muestras,
se podr optar entre uno de los siguientes procedimientos:

a) Enviar la muestra con un conservante.

b) Enviar la muestra ya sembrada por el sistema de laminocultivo o similar.

En este ltimo caso sera recomendable que el personal del centro de salud en el
momento de la siembra introdujese una tira para deteccin de leucocitos/nitritos en la orina y
anotase los datos correspondientes a los leucocitos en el vale de solicitud del cultivo.

Mtodo de despistaje automatizado: Los mtodos automatizados de despistaje de infecciones

urinarias tienen un excelente valor predictivo negativo por lo que si el nmero de muestras es
elevado podr ser un mtodo alternativo a los mtodos convencionales.
Qu es un medio de cultivo cromognico?

Un medio de cultivo cromognico es un medio microbiolgico adecuado para la incubacin,

diferenciacin o seleccin de muchos microorganismos usando un sustrato cromognico que
da como resultado un color. Este color ser caracterstico de cada microorganismo siendo ms
fcil y precisa la diferenciacin.

Cmo funciona un medio cromognico?

Los medios cromognicos contienen nutrientes tales como peptonas, aminocidos, extracto de
levadura, minerales y vitaminas, adems de inhibidores, gelificantes y sustrato cromognico o
cromgenos.
Se ha comprobado que los sustratos cromognicos son una herramienta potente en la
identificacin de microorganismos, debido a la deteccin de enzimas especficas producidas
por los microorganismos en estudio. El principio de los medios cromognicos son los sustratos
cromognicos como ONPG, X-Gal, o X-Glu junto con una selectividad especfica del medio.

Los microorganismos de estudio se caracterizan por tener sistemas de enzimas especficas que
son responsables de la escisin del sustrato en el interior del cromgeno. Con el fin de separar
el sustrato, la unin entre las dos partes del cromgeno se rompe por la enzima. De ese modo,
los cromfobos son liberados y pueden ser detectados visualmente mediante la observacin de
un cambio de color en el medio.

Cules son sus ventajas?

1. Menor tiempo en dar resultado comparado con los mtodos tradicionales tanto negativo
como presunto positivo. Algunos medios confirman resultado en 24 horas.

2. Con solo medio se puede identificar ms de un organismo. Si adquirimos cada medio

especfico para ms de un organismo, el medio cromognico es ms barato.

3. La interpretacin del resultado es visual sin la necesidad de habilidades especiales o de

instrumentos.

4. Los medios cromognicos eliminan la necesidad de anlisis bioqumicos adicionales para la

identificacin del agente patgeno.

5. La virulencia de un determinado microorganismo se puede detectar simultneamente con su

diferenciacin y seleccin. Las pruebas de coagulasa y fibrino-lisina tambin se puede llevar a
cabo de forma simultnea en el medio.

6. Los medios cromognicos se componen de nutrientes y hacen posible la supervivencia de

los microorganismos daados que estn a punto de desaparecer.