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1.

INTRODUCCION

Dentro de la microbiologa pesquera se encuentran los microorganismos, en donde presentan


clulas; algunas son eucariotas y otras procariotas, dentro de las procariotas tenemos a las
bacterias y arqueas. Las bacterias se presentan como causantes de enfermedades
(patgenos); para su desarrollo necesitan de auto alimentacin, auto replicacin, diferenciacin,
y evolucin.

Existen dos tipos de bacterias, gram positivas y gram negativas; las primeras presentan un
peptidoglicano en la pared celular ms grueso que las negativas, esto hace que cuando se
sometan al mtodo de coloracin o tincin gram, las bacterias positivas no se tian y las
negativas si se decoloren y finalmente se tian con las gotas de safrandina. Esto mtodo se
desarrollo en el laboratorio y a continuacin se explica y se analiza paso a paso.

2. REVISION LITERARIA

MORFOLOGA, AGRUPACIONES Y ESTRUCTURAS:

Las bacterias son microorganismos unicelulares mucho ms simples que las clulas eucariotas.
Su tamao puede variar aproximadamente entre 0,2 y 5 milsimas de milmetro.
Las bacterias tienen una envoltura rgida o pared bacteriana que determina su forma: cocos
(esfrica), bacilos (cilndrica alargada), cocobacilos (bacilos cortos redondeados),
espiroquetas (helicoidales), etc.

En ocasiones, sobre todo dependiendo de las condiciones de cultivo (edad de cultivo, tipo de
medio slido o lquido, presencia de antibiticos, etc.) una misma especie puede presentar una
morfologa variable. A este fenmeno se le denomina pleomorfismo.

Las bacterias pueden presentarse como clulas aisladas o formando grupos. Esta caracterstica
es tambin importante para poder identificarlas. En algunas casos la aparicin de las bacterias
formando agrupaciones no es una caracterstica de estas in vivo sino un efecto de ciertas
tcnicas de tincin (como en el caso del gnero Staphylococcus que aparece formando racimos
slo en preparaciones fijadas y teidas; pero no en muestras vivas).
A veces las bacterias no se dividen totalmente, no se individualizan, y entonces dan lugar a
agrupaciones de diferentes formas: estreptococos y estreptobacilos (cadenas de cocos o de
bacilos, respectivamente), estafilococos (racimos), diplococos (conjuntos de dos), difteroides
(en ngulo o empalizada), sarcinas (agrupaciones en ttradas o en grupos de ocho cocos
dispuestos en forma de cubo).

Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:

Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos
irregulares, a veces de gran tamao.

Bacilos

Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos.

Empalizadas,
Forma de vara: Dos bacilos
Cadenas de bacilos: Bacilos lado con
se llaman juntos:
Estreptobacilos lado o en figuras en
Bacilos Diplobacilos
X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias...)


Forma espiral rgida se Si la espiral es flexible y
llama: Espirilo ondulada se llama: Espiroqueta

TINTICIN DE GRAM

Es esta una coloracin diferencial que permite dividir a las bacterias en Grampositivas,
refirindose a aquellas que toman el primer colorante utilizado que tie las bacterias de color
violeta y las Gramnegativas, las que toman el ltimo colorante utilizado en la tcnica como
colorante de contraste que las tie de rojo o rosado.

La Tinticin de Gram, divide las bacterias en grampositivas y gramnegativas. Esta tinticin


constituye uno de los elementos ms importantes de la clasificacin de las bacterias, pues el
hecho de que una bacteria sea grampositiva o gramnegativa depende de la presencia de
elementos importantes de la composicin de la pared bacteriana. Tambin existen algunas
bacterias que no se tien irregularmente con el mtodo de Gram, por ello no son visibles en las
preparaciones cuando se utiliza esta tinticin (las bacterias del gnero Legionella)

En las bacterias gramnegativas, la pared est formada por dos capas. La capa interna est
compuesta por peptidoglucano. La capa externa contiene fosfolipidos y protenas y unas
molculas llamadas lipopolisacaridos. Estos lipopolisacaridos de las bacterias gramnegativas
son sustancias especialmente txicas: se denominan endotoxinas, y son responsables de
algunas de las consecuencias ms raves de las infecciones.

En las bacterias grampositivas, la capa de peptidoglucano es mucho ms gruesa y la pared


solo contiene una capa. El peptidoglucano existe en todas las clulas procariotas, y su bloqueo
por medio de antibiticos es un arma excelente contra las infecciones bacterianas
BACTERIAS GRAM + BACTERIAS GRAM -

Pared celular simple Pared celular compleja

Capa de peptidoglucano gruesa. Capa de peptidoglucano fina

No capa externa de lipopolisacridos. Capa externa de lipopolisacridos.

Retienen cristal violeta/iodo color azul/violeta Retienen safranina color rojo/rosado

Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:

El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en
agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los
microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no
puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en
las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del
complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la
importancia general de la pared celular.

Cocos Gram-positivos
Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp


Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Grficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis. Tambin Moraxella sp y Acinetobacter
sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece
como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a
menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli


Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

Grficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

3. MATERIALES Y METODOS

MATERIALES:

- Placas petri.

- Porta objetos.

- Aguja de kolle.

- Mechero bunsen.

- Cristal violeta.
- Lugol.

- Alcohol-cetona.

- Safranina.

- Aceite de inmersin.
4. RESULTADOS

4.1. FIJACION DE LA BACTERIA:

CEPAS:

1. Salmonella Estafilococo Aureus


Limpiar el portaobjeto.

Agregar 1 gota pequea de agua con el asa de kolle.

Colocar la cepa.

Homogeneizar, hasta que este seca. (en el mechero bunsen).

4.2. COLORACION GRAM:

Agregar gotas de Cristal Violeta (tiempo: 2 minutos)

Lavar hasta que desaparezca el color.

Agregar gotas de lugol (tiempo: 2minutos)


Decolorar con ALCOHOL ACETONA.

GOTAS SAFRANDINA (tiempo: 30 segundos).

Secar con papel toalla las partes alrededor donde se coloco la cepa.

Gram ( - ): No se va a decolorar.

Colocar una gota de Aceite (A. Inmersin) para ver al microscopio.


Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100X).

5. CONCLUSIONES

Se utilizaron las cepas: salmonella y Estafilococo Aureus para el experimento en el


laboratorio. Y resultaron ser gran negativa y gran positiva respectivamente.

En el laboratorio se logro observar la coloracin de ambas bacterias gram (+) y (-), luego con
el alcohol se pudo observar la decoloracin de la bacteria gram (+).

Con la ayuda del aceite, se puede observar en el microscopio (100x) las bacterias gram
positivas y negativas con su respectiva distribucin y coloracin.

Para la muestra nmero 2 Estafilococo Aureus no se observo bien la coloracin esto es


debido a que la cepa utilizada es demasiado vieja, no es una cepa fresca.

Muestra numero 1 tiene la forma: bacilos acocados.

Muestra numero 2 tiene la forma: coco racimo.

6. BIBLIOGRAFIA

Microbiologa en ciencias de la salud. Conceptos y aplicaciones. De la Rosa Manuel, Prieto


Jos. Elsevier Espaa. 2003.
7. CUESTIONARIO

7.1. Cules son las tcnicas de tincin

Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes que
empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin.

Sin Tincin

No se utiliza ningn tipo de colorante.

Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la
superficie de un portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado espeso para
permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina
fisiolgica estril.

Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparacin
se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba,
huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

Tincin Simple

Es la tincin en que se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien
con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH
digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta
sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos.

Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as como los tipos de
agrupaciones que forman.

Tincin diferencial

Con esta tincin tu vas a poder ver morfologa, tamao, organizacin de las bacterias y adems
categorizar los microorganismos en varios grupos, segn su afinidad con el colorante que tu estas
utilizando. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de ms de una
sustancia tintrea. En algunas tcnicas de coloracin, las tinciones diferenciales ms importantes
que se emplean en bacteriologa son las de Gram y la tincin cido-resistente. Ambas tinciones se
utilizan para obtener informacin acerca de la composicin de las capas de la pared celular de las
clulas bacterianas.

Los ejemplos clsicos seran la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen


Con la tincin de gram t puedes diferencias las bacterias en dos grupos: bacterias gram
positivas y bacterias gram negativas. Eso va a depender de si retienen o no el colorante
cristal violeta o el colorante safranina. La capacidad que tengan de retener un colorante o no
va a depender de la composicin de la pared celular de la bacteria.

Las gram positivas cuando realizar el procedimiento de tincin de gram, puede ver que
luego de aadir lugol, el colorante cristal violeta se mantiene en el interior de la bacteria. Las
gram negativas al aadir lugol pierden la coloracin del cristal violeta y si le aades otro
colorante, por ejemplo la safranina, adoptaran ese color.

Bacterias Escherichia coli


vista al microscopio tras
ser teidas con la tincin
de Gram

La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y


econmica, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias
contienen cidos grasos (por ejemplo, el cido miclico) de cadena larga (50 a 90 tomos de
carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido,
despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan bacilos cido-alcohol
resistentes o BAAR. Las microbacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos
coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol
resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Mycobacterium tuberculosis

Visualizacin usando la tincin de Ziehl-Neelsen.


7.2. Cules son los cuidados que hay que tener en cuenta para realizar una coloracin gran.

Los cuidados que hay que tener son:

Al fijar la muestra, evitar el sobrecalentamiento de esta para evitar la destruccin de las


estructuras.
Cuidar de no contaminar la muestra desinfectando con alcohol el portaobjetos y
permaneciendo cerca de la llama.
Agregar la cantidad suficiente de colorante, cubriendo la totalidad de la muestra.
Esperar los tiempos necesarios para que los colorantes se fijen.
Evitar que el chorro de agua destilada caiga directamente sobre la muestra.
Hay que tener presente que existen bacterias que tien como gramnegativas, pero son
de tendencia grampositivas.

7.3. De 6 ejemplos de bacterias grampositivas y gramnegativas.

GRAMPOSITIVAS

Staphylococcus aureus Es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas, que se dividen
en ms de un plano, por lo que se agrupan regularmente en racimos. Son inmviles y carecen de
esporas. Son gram positivas.

Streptococcus pneumoniae, es un microorganismo patgeno capaz de causar en humanos


diversas infecciones y procesos invasivos severos. Se trata de una bacteria Gram positiva de 1,2-
1,8 m de longitud, que presenta una forma oval y el extremo distal lanceolado. Es inmvil, no
forma endosporas.

Clostridium es un gnero de bacterias anaerobias, bacilos grampositivas, parsitas y saprfitas


algunas de ellas, que esporulan,[1] y son mviles, en general por intermedio de flagelos
peritricos. Toman la forma de fsforo, palillo de tambor o huso de hilar, de ah su nombre griego
"Klostro", que significa huso de hilar.

Micrococcus es un gnero de bacterias del filo Actinobacteria. 'Se encuentran en ambientes


diversos, incluyendo agua y suelo. Son bacterias Gram-positivas con clulas esfricas de
dimetro comprendido entre 0,5 y 3 micrmetros que tpicamente aparecen en ttradas.
Micrococcus tiene una gruesa pared celular que puede abarcar tanto como el 50% de la materia
celular.
Bacillus anthracis es inmvil y capsulada. La endospora caracterstica de Bacillus es de forma
redondeada y de situacin central, sin deformar la clula. Cada clula mide entre 1 y 6 m. Las
esporas son muy resistentes a la temperatura y a los desinfectantes qumicos, aunque se
muestran muy sensibles a la penicilina.

Listeria monocytogenes es un cocobacilo que responde positivamente a la tincin de Gram, es


aerobio, es catalasa positivo y no presenta cpsula ni espora. Es mvil a 25 C pero inmvil a 37
C por inactivacin del flagelo. Produce la fermentacin lctica y bacteriocinas (toxinas capaces
de matar a otras bacterias.

GRAMNEGATIVA

Neisseria meningitidis, tambin conocida por su nombre ms simple de meningococo, es una


bacteria diplocccica hetertrofa gram negativa, de importancia en salud pblica por su papel en
la meningitis y otras formas de enfermedad meningocccica. Slo afecta a seres humanos ya que
no existe ningn reservorio. Es la nica forma conocida de meningitis bacteriana en causar
epidemias.

Escherichia coli se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos
animales, y por ende en las aguas negras. sta y otras bacterias son necesarias para el
funcionamiento correcto del proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. Es un
bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram (gramnegativo), es anaerbico
facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas.

Haemophilus es un gnero de bacterias Gram negativas con forma de cocobacilos pero muy
pleomrficas. Aunque la forma tpica es la cocobacilar, se consideran pleomficas porque pueden
realmente variar drsticamente su morfologa.

Vibrio es un gnero de bacterias Gram negativas con forma de bacilos curvados.


Bioqumicamente se caracterizan por dar positivo en las pruebas de la catalasa y de la oxidasa.
Es una bacteria anaerobia facultativa, y su metabolismo es fermentativo; pueden fermentar, entre
otros sustratos, la glucosa. Poseen flagelacin polar, que les otorga una movilidad mxima.

Fusobacterias son un filo de bacterias que comprende nicamente el gnero Fusobacterium.


Algunos de los organismos que la representan contribuyen a numerosas enfermedades,
incluyendo enfermedades periodontales, sndrome de Lemierre y lcera de piel topical. En
humanos, constituyen uno de los principales tipos de flora del aparato digestivo, y se encuentran
en muchas partes del tracto gastrointestinal. Son bacterias Gram negativas, anaerobias y de
aspecto filamentoso.

Enterobacter cloacae es una bacteria que pertenece al gnero Enterobacter, de la familia de las
Enterobacteriaceae. Es un bacilo Gram negativo Oxidasa negativo y Catalasa positivo presente
en el aparato digestivo humano.