FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUMICA

TEMA
MICROBIOLOGIA APLICADA A LA INDUSTRIA FARMACEUTICA

CURSO : MICROBIOLOGIA

DOCENTE : Blgo.Carlos Esqueche

INTEGRANTES : Alicia Castillo Leon

Pascual Tuesta Cotrina
Antonio Choroco Condor

AULA : 303A

CICLO : VII

TURNO : NOCHE
Microbiologa I Microbiologa Aplicada a la Industria Farmacutica

I. INTRODUCCION

Es muy diverso el apoyo que realiza la Microbiologa a la industria farmacutica y de

Cosmticos. Participa en los diferentes procesos de produccin y anlisis
microbiolgicos para garantizar la calidad de productos farmacuticos y cosmticos,
verificar la ausencia de microorganismos contaminantes.
Los medicamentos y cosmticos no pueden contener microorganismos patgenos y
la cantidad de microorganismos no patgenos no debe sobrepasar determinados
lmites.
Las Bacterias aerobias Mesfilas son todas aquellas capaces de crecer en un medio
de cultivo sin mayores exigencias nutricionales. Se investigan por el mtodo de
recuento en placa por siembra en profundidad. Prueba de endotoxinas. La prueba de
pirgenos, endotoxina, y la prueba de deteccin de endotoxina es una prueba para
detectar la presencia de endotoxina de origen bacteriano en productos farmacuticos
Participa adems en esta rea, la microbiologa en pruebas para el control de
desinfeccin de superficies y equipos, validacin de Procesos de Saneamiento,
eficacia de preservantes y conservantes en productos farmacuticos y cosmticos,
valoracin de reas y ambientes, control de Filtros HEPA, flujo laminar y cabinas de
bioseguridad.

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II. INDICE Pag.

Introduccin................................ 2
Desarrollo del tema.. 4
1. Crecimiento microbiano............................ 4
1.1. Visualizacin del cremiento. 5
1.2. Medicin del crecimiento.. 5
1.3. Recuento de microorganismos viables.. 5
2. Endotoxinas bacterianas. 8
2.1. Sustancias pirognicas. 8
2.2. Endotoxinas Bacterianas: estructura, propiedades biolgicas y
fisicoqumicas 8
2.3. Despirogenizacin 9
3. Biopelculas. 10
3.1. Formacin y desarrollo de biopelculas 10
4. Filtros hepa. 12
4.1. Elementos de los filtros hepa. 13
4.2. Equipos de flujo laminar. 15
5. Indicadores biolgicos.. 17
5.1. Tipos de indicadores.. 18
5.2. Esterilizacin de lquidos 21

Referencias bibliogrficas. 23

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III. DESARROLLO DEL TEMA

1. Crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano puede definirse como el aumento de los constituyentes
celulares. En los microorganismos que se multiplican por fisin binaria o gemacin, el
crecimiento produce un aumento del nmero de clulas. En los microorganismos
cenocticos, el crecimiento produce aumento del tamao pero no del nmero de
clulas.
En bacterias, la sntesis regulada de todos los constituyentes de una clula bacteriana
produce primero un aumento de su masa y luego, cuando sta ha sido duplicada, la
divisin de la bacteria por el mecanismo de fisin binaria. De esta manera se originan
dos bacterias hijas de las que puede decirse que, son iguales entre s e iguales a la
bacteria que les dio origen. A continuacin cada una de las bacterias hijas repetir el
ciclo de la bacteria parental y se originarn 4 bacterias, aumentando el nmero de
ellas, es decir de la poblacin bacteriana, en progresin geomtrica.

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1.1. Visualizacin del cremiento

En medios lquidos el aumento del nmero de bacterias se visualiza como turbidez
y/o formacin de sedimento o pelcula en los cultivos. En cambio, en medios
agarizados el aumento del nmero de bacterias produce colonias
macroscpicamente visibles, algunas de cuyas caractersticas (tamao, forma, color,
etc.) pueden contribuir a la identificacin del microorganismo.
1.2. Medicin del crecimiento
Para medir el crecimiento se pueden emplear tcnicas que estimen el nmero de
bacterias, ya sea totales o viables, o la masa celular. De acuerdo a la tcnica
empleada para el recuento, su resultado expresar el nmero de microorganismos
totales (viables ms no viables) o solamente viables presentes en una muestra,
siendo stos ltimos los que poseen la capacidad de crecer y multiplicarse.

1.3. Recuento de microorganismos viables

A. Recuento en placa

El recuento de microorganismos viables en placa se basa en la formacin de una

colonia a partir de cada clula viable, utilizando como soporte, medios agarizados
en placas de Petri. No puede asegurarse indubitablemente que toda colonia
derive de un solo microorganismo, por eso la forma correcta de expresar los
resultados es como unidades formadoras de colonias (UFC). El recuento se
puede realizar por plaqueo en medios agarizados o por retencin en una
membrana filtrante. Las tcnicas de recuento viables en placas son sensibles,
relativamente sencillas y se usan ampliamente para el recuento de bacterias y
otros microorganismos en muestras de alimentos, medicamentos, agua, etc.

La forma correcta de realizar un recuento de unidades formadoras de colonias

es la siguiente: realizar diluciones 1/10 de una suspensin bacteriana o de una
muestra en ensayo y sembrar volmenes medidos de varias de ellas, a modo de
obtener colonias separadas. Esto se logra cuando el nmero de colonias por
placa Petri es entre 30 y 300, dependiendo del tamao de las colonias originadas.
En general, por encima de ese lmite hay superposicin de colonias y por debajo
de l la significacin estadstica es muy pobre. Las siembras se pueden hacer:

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Por diseminacin: sobre la superficie del medio ya gelificado y secado,

contenido en la placa, de volmenes de 0,1 0,2 ml de las diluciones
correspondientes.

En profundidad: incorporando el inculo en un volumen de medio fundido,

mantenido a temperaturas compatibles con la viabilidad microbiana
(aproximadamente 45C), que luego se vuelca en una placa Petri y se deja
gelificar. Los volmenes inoculados pueden ser de hasta el 10% del volumen del
medio. Luego de la incubacin en las condiciones apropiadas para cada
microorganismo, la concentracin de UFCs presentes en una suspensin se
calcula multiplicando el nmero de colonias por placa, promedio de varias placas,
por la inversa de la dilucin de la suspensin, y dividiendo por el volumen
sembrado. Cuando el nmero de microorganismos viables presentes en una
muestra es bajo, se puede recurrir a la filtracin de la misma a travs de filtros de
membrana que retienen bacterias. Luego de filtrar la suspensin que contiene las
bacterias a cuantificar, la membrana se coloca sobre la superficie de un medio
agarizado o sobre una fina almohadilla de papel absorbente embebido con medio
lquido, se incuba en condiciones adecuadas y se cuentan las colonias, que
representan el nmero de UFC presentes en el volumen de muestra filtrado.

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B. Recuento directo

El recuento en cmara por microscopa ptica es un mtodo til para determinar

el nmero de bacterias totales en una suspensin, cuando su concentracin no
es demasiado baja. Brinda tambin informacin sobre el tamao y la morfologa
de los microorganismos.Las suspensiones se colocan en cmaras de recuento
de volumen conocido. En el caso del recuento de bacterias estas cmaras poseen
un espesor sensiblemente menor que los hemocitmetros, debido al menor
tamao de las bacterias. Las cmaras de recuento de Petroff-Hausser tienen un
espesor de 0,02 mm, que las hace particularmente aptas para el recuento de
bacterias. La superficie de la cmara es de 1 mm2 y est dividida en 25
cuadrados. Luego, el nmero de bacterias por mm3 se calcula multiplicando el
nmero de bacterias en un cuadrado por el nmero de cuadrados (25) y por la
inversa del espesor (1 / 0.02= 50).

C. Determinacin de microorganismos totales

Se emplean mtodos que determinan directamente el nmero de bacterias

suspendidas en un medio lquido o el peso correspondiente a la fraccin celular.
Tambin se pueden utilizar mtodos indirectos, entre ellos el ms utilizado es la
determinacin de la absorbancia de las suspensiones celulares, que, dentro de
cierta imagen y en condiciones estandarizadas, es proporcional a la masa celular.

D. Medicin de la masa celular

El aumento del nmero de microorganismos va acompaado de un aumento

continuo de la masa celular en el cultivo que, por supuesto, refleja el total de las
clulas (viables ms no viables). La masa celular en un cultivo microbiano puede
medirse directamente determinando el peso de la fraccin celular o
indirectamente midiendo la absorbancia de las suspensiones microbianas.

E. Determinacin de la absorbancia

Una tcnica ms rpida, ms sensible y de uso corriente se basa en medir

espectrofotomtricamente la dispersin de la luz producida por las bacterias
presentes en una suspensin. A medida que aumenta la concentracin de
bacterias el cultivo se vuelve ms turbio (aumenta la absorbancia) y la luz

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transmitida es menor. Debido a que las clulas de una especie bacteriana tienen
tamaos relativamente constantes, la dispersin de la luz puede considerarse
proporcional a la concentracin de bacterias en la suspensin. La relacin lineal
entre absorbancia y concentracin celular slo se cumple en un rango
determinado de concentraciones y, adems, la absorbancia de una suspensin
bacteriana no depende slo de la masa celular sino tambin de otros factores,
como por ejemplo la forma de las bacterias. Por ello es aconsejable realizar una
curva de calibracin para cada sistema, a modo de establecer la relacin entre la
densidad ptica (DO) y el parmetro estimado, efectuando distintas diluciones de
una suspensin concentrada y midiendo sus respectivas absorbancias.

2. Endotoxinas bacterianas
2.1. Sustancias pirognicas
Se define como pirgeno a toda sustancia que, cuando es inyectada en sangre o LCR
en humanos o en animales de experimentacin, produce fiebre, se reconocen como los
pirgenos ms frecuentes y se originan en bacterias Gram negativas. stas, adems
de la pared celular (murena o peptidoglicano) que caracteriza a las bacterias en general
y que contribuye a su rigidez mecnica poseen una capa adicional externa compuesta
por protenas, fosfolpidos y lipopolisacridos (LPS) de alto peso molecular (PM). Slo
algunas pocas especies de bacterias Gram negativas, como las Sphingomonas, carecen
de LPS.

Las endotoxinas Bacterianas se liberan continuamente en el medio en que se encuentran

las bacterias, en pequeas cantidades durante su divisin y en mayora, durante su lisis.
Por esto, un producto estril no necesariamente ser apirognico.

La importancia de las EB radica en su naturaleza, su mayor toxicidad en relacin a otros

piretgenos, estabilidad frente a condiciones extremas de tratamiento, su ocurrencia en
soluciones de uso parenteral y su tamao demasiado pequeo para ser retenidas por
filtros esterilizantes convencionales.

2.2 .Endotoxinas Bacterianas: estructura, propiedades biolgicas y fisicoqumicas.

La estructura bsica activa de las EB es la de un LPS con 3 fracciones unidas
covalentemente: lpido A- que, adems de ser responsable de la mayora de los
efectos biolgicos (ej. toxicidad) les confiere estabilidad y resistencia, un polisacrido
central y un polisacrido O-especfico, que se extiende en el medio en que se

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encuentra la bacteria, de estructura altamente variable y que le confiere

antigenicidad. La regin central y el lpido A se encuentran parcialmente fosforilados,
lo que le confiere a la endotoxina una carga neta negativa
La estructura anfiflica de las EB (polisacrido hidroflico y lpido A hidrofbico),
asociada a sus propiedades biolgicas txicas, tambin dificulta su remocin durante
la elaboracin farmacutica o puede afectar la capacidad de deteccin durante los
controles por adsorberse con facilidad a distintas superficies como el vidrio, plsticos
u otras.

2.3 . Despirogenizacin

La Despirogenizacin puede realizarse por detoxificacin o destruccin del LPS

(esterilizacin por calor seco, tratamiento con cidos, bases, agentes oxidantes o
alquilantes, etc.) o remocin de las EB.

Dentro de los mtodos esterilizantes convencionales el Calor seco es el mtodo por

excelencia para la destruccin del LPS y clsico cuando se trata de sustancias
resistentes al calor (ej.: material de vidrio). Los ciclos temperatura-tiempo deben ser
validados siendo habituales 180C /3 horas o, como refiere USP 250C/ 30 minutos. La
esterilizacin por Calor hmedo (121C/15- 20 min) es inefectiva para destruccin de EB.
Se ha intentado su empleo asociado a soluciones de perxido de hidrgeno para

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despirogenizar preparaciones o recoleccin de soluciones. En este caso, su eficacia ser

dependiente de factores tales como concentracin, tiempo, temperatura y pH. Se trata
de un enfoque que, como ocurre con otros mtodos qumicos, ofrece las dificultades
propias de la validacin del sistema de limpieza de residuos.

La destilacin es el mtodo por excelencia para obtencin de agua calidad inyectable,

dejando detrs grandes aglomerados de piretgenos durante la etapa de evaporacin.
Otros mtodos de remocin basados en tamao molecular, si adecuadamente
mantenidos, son la Osmosis inversa (OI) y la ultrafiltracin (UF). Mientras la OI se acepta
como mtodo alternativo para la obtencin de Agua para inyectables no puede emplearse
para otros productos. La UF es considerada un mtodo de alta eficiencia para purificar
productos de uso parenteral distintos de agua, no slo como parte de un proceso
productivo si no tambin con fines analticos.

Los distintos mtodos de filtracin esterilizante se realiza empleando membranas de

0,22um utilizados frecuentemente en la fabricacin de inyectables, resultan altamente
efectivos para prevenir la contaminacin con EB.

Otros enfoques tambin han considerado centrifugacin en gradientes de sacarosa y

separacin de fases con Triton X-114 o cromatografa de intercambio aninico.

La Radiacin, se utiliza para esterilizacin de jeringas y dispositivos mdicos, aquellos

con contacto directo o indirecto con el sistema cardiovascular y algunas materias primas
biolgicas como enzimas. En cuanto a los mtodos qumicos, el tratamiento con bases
como hidrxido de sodio que produce la destruccin por saponificacin de los cidos
grasos en el lpido A mientras que, el tratamiento con cidos como clorhdrico o actico,
se asocia con la ruptura parcial de la unin de la cadena del polisacrido al cido graso
y eliminacin del primero por ser hidrosoluble, con la desventaja de que el Lpido A puede
permanecer

3. Biopelculas

3.1. Formacin y desarrollo de biopelculas.

Una gran variedad de microorganismos estn presentes en todos los ambientes

acuticos (o muy hidratados), tanto naturales como industriales. Estos microorganismos

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constituyen y viven en comunidades multicelulares y presentan gran tendencia a fijarse

y crecer sobre superficies biticas o abiticas inmersas en el agua y formar las
denominadas biopelculas Si bien existen varios modelos y descripciones, el desarrollo
de una biopelcula puede generalizarse en las siguientes etapas:

a) Acondicionamiento: se produce la instantnea adsorcin de productos orgnicos

con los cuales los microorganismos no estn relacionados (pelcula condicionante).

b) Adhesin de especies bacterianas pioneras: algunas bacterias se adhieren a la

superficie sumergida en cuestin de horas.

c) Colonizacin de otros microorganismos: otras bacterias y hongos comienzan

a asociarse a la superficie luego de la colonizacin de las pioneras en cuestin de das.

d) Acumulacin: se produce el agregado de partculas, clulas muertas y compuestos

de metales. Estos pueden encontrarse como productos de corrosin o como iones en
solucin.

Figura 1. Etapas de desarrollo de una biopelcula. Extrado de Jenkinson and

Lappin-Scott, 2001.

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En el inicio de la formacin de la biopelcula las clulas se adhieren a un sustrato, La falta

de comprensin o al interpretar la informacin de la superficie de la clula, tal como su
hidrofobicidad o carga, ha resultado al menos en lo que a las clulas bacterianas
concierne, en una falta de consenso sobre la importancia de factores fisicoqumicos en
la adherencia no especfica. Una perspectiva sostiene que la distincin entre la
adherencia especfica (mediada por el receptor) y no especfica es artificial. Sin embargo,
est claro que en la adherencia no especfica una combinacin de todos los rasgos
conduce a un conjunto clula superficie que establece la afinidad por el sustrato. Si la
composicin de la superficie de la clula o del sustrato cambia, la afinidad puede cambiar.
Organismos modelo, tales como cepas con definidas mutaciones en la pared celular o
composicin conocida de exopolmero, y sustratos modelo cuyas caractersticas fsico-
qumicas superficiales fueran conocidas podran usarse para predecir su tendencia a
adherirse no especficamente.

Las caractersticas estructurales, qumicas y fisiolgicas de una biopelcula dependen

tanto de los microorganismos que la constituyen como de las condiciones ambientales
locales. Las bacterias en biopelculas no slo difieren de las planctnicas de su misma
especie, sino adems en biopelculas monoespecficas demuestran vasta
heterogeneidad en trminos de metabolismo, expresin de genes y fisiologa debido a
las diferentes condiciones o microubicaciones. Las biopelculas son dinmicas con
respecto a su estructura y composicin, pero pocos estudios se han ocupado de las
consecuencias del crecimiento de las biopelculas o de las ltimas etapas de su
desarrollo. Por lo tanto, se sugiere que las biopelculas deberan ser estudiadas desde
un punto de vista diferencial espacio/temporal similar al del desarrollo de la biologa.
Como ya se ha mencionado, un componente muy importante que mantiene la integridad
estructural de la biopelcula lo constituye el MPE, tambin llamado matriz extracelular,
esta matriz tiene un aspecto de gel y est constituida por protenas, iones Ca+2, cadenas
de polisacridos y agua que permiten la cohesin entre las clulas y las protegen de las
condiciones hostiles del medio.

4. Filtros HEPA

HEPA (High Efficiency Particulate Air) es un filtro descartable de medio filtrante seco y
extendido dentro de un marco rgido, que tiene una eficiencia mnima de retencin del
99,97 %.

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4.1. Elementos de los filtros hepa

Medio filtrante: Es papel corrugado con pliegues profundos y cercanos entre s, de modo
tal que permita un caudal de aire suficientemente grande. Puede llegar a usarse una
superficie de papel hasta 50 veces mayor que la seccin plana de entrada del filtro.

Separadores: Son elementos que mantienen los pliegues del papel separados, dando
rigidez mecnica a la superficie filtrante.

Marco: Es la caja rgida dentro de la cual se halla el medio filtrante y los separadores.

Adhesivo: Es el producto que une el papel de filtro al marco

Burletes: Revisten la superficie del marco donde ste se une al soporte portante
del filtro, dando estanqueidad al sistema.

A. Papel filtro o medio filtrante.

En las primeras tentativas de fabricacin de materiales de alta eficiencia se utilizaron

fibras relativamente groseras como soporte de fibras de amianto. Posteriormente,
fueron hechos papeles de celulosa y amianto, vidrio, amianto y vidrio, fibras plsticas
y cermicas. El papel de celulosa y amianto fue el ms barato de los medios filtrante.
En l las fibras celulsicas relativamente gruesas servan de soporte a las de amianto
que son de dimetros de pocos micrones. Estn en desuso por ser el amianto
potencialmente cancergeno.

El papel de vidrio es actualmente el ms comn de los medios filtrantes. Esto se debe

a que la mayora de sus microfibras es inferior al micrn. Con fibras plsticas se han
fabricado medios de polietileno, polipropileno y nylon con dimetros de fibras entre
0,5 y 1,5 micrones. Tienen buena compatibilidad qumica, pero poca resistencia a las
altas temperaturas. Las partculas de materiales costosos se pueden recuperar
disolviendo el medio filtrante para su separacin.

Las microfibras cermicas se utilizan cuando es necesario trabajar con altas

temperaturas (hasta 1000 C).

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B. Separadores.

Para evitar que los pliegues adyacentes se superpongan entre si se usan separadores
que pueden ser de los siguientes materiales:

Papel Kraft o cartn: son los ms baratos, sin embargo tienen poca resistencia a la
humedad y al calor.

Aluminio: Resisten hasta 300 C y son aplicados en filtros que deben ser resistentes
a la humedad.

Acero inoxidable: Son usados solo en casos especiales

Cordones adheridos al medio. Fabricantes europeos han desarrollado filtros donde

el medio filtrante se mantiene separado por medio de cordones adheridos al papel
para mantener su conformacin lisa, con la ventaja de poder disponer de ms medio
filtrante por unidad de volumen. Pueden mantenerse as iguales caudales con
menores cadas de presin.

En la actualidad los separadores ms usados son los de un adhesivo que se inyecta

en la superficie del papel poco antes de ser corrugado y al secarse en el momento
del plegado, aumenta la cantidad de pliegues obtenindose un filtro de mayor
superficie filtrante.

C. Marco

Inicialmente los filtros HEPA ms comunes eran fabricados con marcos de madera
aglomerada o terciada. Su mayor inconveniente era su poca resistencia a la humedad.
La madera puede hincharse, desplazndose el burlete, perdindose la estanquidad y
permitiendo fugas o prdidas entre el burlete y el marco de sustentacin. Se usan
cuando es necesario incinerar el filtro una vez saturado. Los marcos metlicos usados
en la mayora de las aplicaciones son de chapa galvanizada o cadmiada. Los marcos
plsticos se usan en general en filtros de muy pequeo tamao. Actualmente, los
filtros para equipos de flujo laminar y los mdulos tienen como marco perfiles de
aluminio.

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D. Adhesivos

Una vez obtenido en la fabricacin el medio filtrante corrugado se adhieren los

extremos al marco por medio de adhesivos de los siguientes tipos:

Adhesivos de tipo goma y siliconados: son los ms comunes donde no se requiere

alta resistencia a la temperatura.

Adhesivos refractarios: para altas temperaturas.

E. Burletes

Los materiales usados para sta aplicacin cumplen la funcin de evitar las fugas
entre los filtros y la estructura portante. Segn sus aplicaciones son de los siguientes
tipos:

Goma: solamente usados para bajas temperaturas.

Neopreno: los ms usados.

Fibras de vidrio y minerales: se aplican donde se deben soportar altas

temperaturas. Es fundamental el buen cierre con los burletes, de lo contrario habr
prdidas.

4.2. Equipos de flujo laminar.

a) Mesadas de flujo laminar horizontal

Cuando se controlan productos alimenticios, veterinarios y farmacuticos, es comn

usar las mesas de flujo laminar horizontal llamadas vulgarmente clean-bench.

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Constan de un gabinete metlico con un banco de filtros HEPA dispuestos en un plano

vertical, prefiltros, un ventilador centrfugo, una mesada plstica o de acero inoxidable
y vidrios laterales con un techo de luces fluorescentes. El ventilador impulsa a los
filtros HEPA aire ambiente que es aspirado a travs de los prefiltros. El aire se
desplaza entonces en lneas unidireccionales paralelas, perpendiculares a los filtros
HEPA, barriendo cualquier contaminante generado sobre una mesada como si un
pistn de aire estril se moviera dentro del cilindro formado por un techo iluminado, la
mesada y los vidrios o acrlicos laterales. Estos equipos sirven para evitar que al
controlar la calidad microbiolgica, el producto se contamine con bacterias, hongos o
levaduras dispersas en el ambiente. Estos equipos se usan en industrias tan variadas
como aguas minerales, gaseosas, vinos, cervezas, alimentos, productos
farmacuticos, etc

Las reas limpias y los gabinetes de flujo laminar cumplen 2 funciones, la primera es
proveer aire libre del contaminante exterior y la segunda es barrer con el contaminante
generado por los individuos en el interior del gabinete.

b) Campanas o cabinas de flujo laminar.

Las cabinas de flujo laminar se ubican sobre las zonas de envasado de productos que
deben mantenerse libres de contaminacin. En ellas el aire ambiente es aspirado por
ventiladores centrfugos a travs de los prefiltros, y se inyecta a travs de un plano
horizontal de filtros HEPA. El aire se desplaza entonces en una corriente vertical de
lneas paralelas unidireccionales a una velocidad de 0,5 m/ seg, siendo las cortinas
laterales las guas de flujo de aire. Toda llenadora de ampollas inyectables para uso
humano debe ser provista de un flujo de aire clase 100 (ISO 5), es decir, de una
campana de flujo laminar.

El aire ultrafiltrado se desplaza como un pistn dentro de un cilindro, barriendo por su

rgimen laminar cualquier partcula generada en el interior del equipo. Todas las
superficies son lisas, siendo la seccin de salida de aire idntica a la seccin de filtros
HEPA de entrada.

La funcin del prefiltro es aumentar la vida til del filtro final. Se lo ubica en la seccin
de entrada de aire al ventilador y es fundamental cambiarlo cuando se acerca su punto
de saturacin.

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5. Indicadores biolgicos

Los mtodos de control de esterilizacin universalmente aceptados pueden dividirse en

dos, los indicadores qumicos (IQ) y los indicadores biolgicos (IB). Cada uno de ellos
cumple un rol especfico y tiene sus propias ventajas y limitaciones. El conocimiento
minucioso de las caractersticas propias de cada sistema, resulta fundamental a fin de
efectuar un uso adecuado de los mismos.

A. indicadores qumicos

Estos indicadores estn diseados para responder a las variables fsicas y qumicas que
deben alcanzarse dentro del equipo durante el proceso de esterilizacin. Algunos
indicadores nicamente proveen informacin logstica, Otros, brindan informacin sobre
la calidad del proceso de esterilizacin al que fue sometido el instrumento. Ciertos IQs
son capaces de monitorear una nica variable, mientras que otros responden a dos, tres
o ms variables proporcionando un mtodo de control ms eficaz que aquellos que
responden a una nica variable. Cada clase de IQ vara en su comportamiento y sus
condiciones de uso, por lo cual resulta de suma importancia que el personal encargado
de utilizarlos conozca qu tipo de informacin brinda el indicador en cuestin, su correcto
modo de utilizacin y las limitaciones que el mismo posee. La principal ventaja de los
indicadores qumicos es que los resultados se obtienen al finalizar el ciclo de
esterilizacin, permitiendo detectar inmediatamente fallas en el proceso y tomar las
precauciones apropiadas.

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B. Indicadores biolgicos.
Son considerados el control de excelencia para monitoreo de procesos de esterilizacin.
Los IBs, consisten en preparados de esporas de microorganismos no patgenos, las
cuales se exponen al agente esterilizante y a continuacin se evala la supervivencia de
los mismos. La eliminacin de dichos microorganismos evidencia la eficacia del
procedimiento de esterilizacin. Los microorganismos utilizados en la elaboracin de IBs
son esporas bacterianas cuya resistencia a los agentes esterilizantes es elevada en
comparacin a la resistencia de los microorganismos potencialmente presentes en los
objetos a esterilizar. Por este motivo, si un proceso de esterilizacin es suficientemente
efectivo como para matar una poblacin de esporas resistentes, tambin es capaz de
eliminar microorganismos menos resistentes de los objetos de inters. Como un control
adicional, los IBs se fabrican con una cantidad de esporas notablemente superior a la
cantidad de organismos que normalmente pueden hallarse en los objetos a esterilizar.La
norma EN ISO 11138 establece requerimientos de fabricacin, comportamiento y
comercializacin de los indicadores biolgicos a fin de garantizar el adecuado
desempeo de los mismos. Para los mtodos de esterilizacin ms comunes, se han
seleccionado como organismos de referencia esporas bacterianas provenientes de
Geobacillus stearothermophilus para procesos de esterilizacin por vapor, formaldehdo
y perxido de hidrgeno y Bacillus atrophaeus para calor seco y xido de etileno. La
normativa estipula que el fabricante debe ensayar la resistencia de cada lote de
indicadores biolgicos y declarar los parmetros

5.1. Tipos de indicadores

A. Indicadores de tiras de esporas

Contienen una cantidad conocida de esporas inoculadas en un material portador,

generalmente de naturaleza celulsica y que luego de ser sometidas al proceso de
esterilizacin se transfieren a un medio de cultivo adecuado mediante la tcnica asptica.
El medio de cultivo inoculado, se incuba a la temperatura de crecimiento del
microorganismo presente en la tira de esporas durante un perodo de tiempo
determinado. El medio de cultivo contiene un indicador de pH, el cual cambia de color
ante la presencia de bacterias metablicamente activas. Un cambio de color del medio
seala una falla en el proceso de esterilizacin; sin embargo, si el proceso de
esterilizacin fue efectivo, el medio indicador permanecer del color original. Este tipo de

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indicador, tiene algunos inconvenientes asociados; por un lado, los resultados del ensayo
estn disponibles 24 o 48 horas segn el caso, adems requiere que el personal
encargado de esta tarea posea conocimientos bsicos de tcnicas microbiolgicas. Por
otro lado existe una elevada probabilidad de obtener falsos positivos por contaminacin
cruzada del medio de cultivo durante el traspaso de la tira de esporas. La contaminacin
cruzada consiste en la transferencia accidental de microorganismos, distintos a las
esporas presentes en la tira, al medio de cultivo.

B. indicadores biolgicos autocontenidos.

Contienen un papel de filtro embebido con esporas bacterianas y un medio de cultivo

especficamente diseado en una ampolla de vidrio. Estos componentes estn alojados
dentro de un tubo plstico contenedor, permeable al agente esterilizante. Luego de la
exposicin al agente, se rompe la ampolla de vidrio, quedando el medio de cultivo en
contacto con las esporas. A continuacin, el sistema se incuba a la temperatura ptima
de crecimiento del microorganismo durante 24 a 48 horas segn el microorganismo en
cuestin. Del mismo modo que al utilizar tiras de esporas, como resultado de un ciclo de
esterilizacin fallido se observa un viraje de color del medio. Para el usuario, esta
tecnologa resulta metodolgicamente ms sencilla de utilizar que la incubacin de tiras
de esporas, y se elimina la obtencin de falsos positivos por fallas en la manipulacin del
indicador que conducen a contaminaciones cruzadas.

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C. indicadores biolgicos autocontenidos rpidos colorimtricos

El principio de funcionamiento de los mismos es similar al de los Indicadores biolgicos

autocontenidos, pero difieren en su presentacin. El sistema contiene un tubo con base
cnica en donde se inoculan directamente la esporas bacterianas, adems poseen un
filtro especial que permite mantener el vidrio en la parte superior del tubo luego de la
rotura de la ampolla de vidrio. Luego de la incubacin a la temperatura de crecimiento
del microorganismo en cuestin se lleva a cabo la lectura del resultado.

D. indicadores biolgicos autocontenidos de lectura rpida de fluorescencia

Poseen una presentacin similar a los indicadores biolgicos autocontenidos pero estos
indicadores revelan la presencia de esporas vivas mediante la deteccin de la actividad
de enzimas asociadas a las esporas de Geobacillus stearothermophilus y Bacillus
atrophaeus. Tales enzimas son del tipo glucosidasas y son capaces de degradar un
sustrato especfico generando un compuesto fluorescente, el cual es detectado por una

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incubadora de lectura rpida de fluorescencia. La deteccin de fluorescencia indica una

falla en el ciclo de esterilizacin mientras que la ausencia de fluorescencia indica la
inactivacin de las enzimas y por lo tanto de las esporas, evidenciando que el proceso
de esterilizacin fue eficaz. Este sistema arroja resultados en tiempos muy cortos que
oscilan entre 1 y 4 horas segn el caso.

E. indicadores biolgicos autocontenidos de lectura sper rpida de

fluorescencia

El principio de funcionamiento de los mismos es equivalente al de los Indicadores

biolgicos autocontenidos de lectura rpida, pero los componentes del sistema han sido
optimizados de modo tal que permiten la deteccin de fluorescencia en tiempos
extremadamente cortos que van de los 30 minutos a 1 hora.

Son capaces de medir directamente la letalidad inducida por un dado ciclo de

esterilizacin, sumado a la posibilidad de evaluar los resultados en tiempos tan cortos,
convierten a este sistema en la alternativa ms poderosa del mercado al momento de
decidir la liberacin de los materiales para su utilizacin.

5.2. Esterilizacin de lquidos

Al momento de esterilizar lquidos por vapor y monitorear tales procesos de esterilizacin,

deben considerarse algunas variables asociadas a este tipo de sistemas. Dado que el
lquido debe disponerse en un recipiente contenedor, el agente esterilizante no estar en
contacto directo con el mismo; adems dependiendo del volumen de lquido y formato
del envase contenedor seleccionados, la penetracin efectiva del vapor debe tenerse en

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consideracin al momento de establecer la duracin del ciclo a fin de que el mismo sea
efectivo.

Se han diseado mtodos de control especiales para el monitoreo de procesos

industriales de esterilizacin de lquidos por vapor. ste consiste en la utilizacin de
ampollas autocontenidas con esporas, las ampollas se colocan dentro del recipiente que
contiene el lquido a esterilizar, o alternativamente, en un envase con algn lquido de
caractersticas fisicoqumicas similares al del lquido a esterilizar. Luego de la exposicin
al agente esterilizante, las ampollas se incuban entre 24 y 48 horas a la temperatura de
crecimiento del microorganismo en cuestin.

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IV. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3 ed. OMS 2005

2. Biorisk Management: Laboratory Biosecurity Guidance OMS. 200
3. Directive of the European Parliament and of the council. 2000 /54/EC.
4. Casimiro, A. M. Niveles de riesgo y condiciones de bioseguridad en el laboratorio
clnico Subcomisin de Bioseguridad AAM 2005.
5. Micucci, Horacio A. Niveles de Bioseguridad en Microbiologa. La Norma IRAM
80059. Publicacin del Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana 35(4) 515-519,
2001
6. Mazzali, L. R. Nivel 4 de Bioseguridad. Publicacin Revista Sociedad de
Microbiologa de Venezuela 25(1).50-53, 2005
7. Publicacin Unidad 2. Bioseguridad. Facultad Cs. Qumicas y Farmacuticas.
UNR 2009

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