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Introduccin

El cultivo de tejidos o propagacin in vitro, es una tcnica que consiste en cultivar un inoculo con
potencialidad de diferenciacin bajo condiciones aspticas en presencia de una dieta balanceada
de nutrientes y hormonas. Esta capacidad de regenerar no solamente tejidos y rganos, sino
tambin una planta entera son nicas en plantas, no puede encontrarse un fenmeno similar en
animales superiores. Se puede definir el cultivo de tejidos como un conjunto de tcnicas con las
cuales podemos ejercer un control relativo sobre los procesos morfogenticos fisiolgicos y
bioqumicos que se llevan a cabo en los tejidos bajo estudio. Al igual que en otros mtodos de
multiplicacin vegetativa o asexual los individuos descendientes de una planta madre propagadaa
in vitro son clones, es decir, son copias genticamente idnticas.

El cultivo de clulas y tejidos vegetales se refiere al conjunto de tcnicas usadas para crecer
clulas, tejidos u rganos vegetales in vitro, bajo condiciones aspticas, controladas y libres de
microorganismos

Antecedentes

Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902,
pero recin en 1922 se logr el primer experimento exitoso: la germinacin in vitro de semillas de
orqudeas. Luego de la germinacin, las plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo
en condiciones aspticas, y as se mantuvieron protegidas del ataque de patgenos (hongos, virus
y bacterias). El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigacin de botnicos y
fisilogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional
importante en la seleccin, cruzamiento, control de enfermedades y produccin en masa de
cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.
La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigacin sobre hormonas que
controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combin con las tcnicas
bsicas de microbiologa por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estriles
para la produccin de microorganismos e identificacin. Desde estas dos fuentes provino la
tecnologa por la cual las plantas u rganos de plantas se pueden multiplicar en gran nmero, o su
crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeos trozos de tejido vegetal sobre una
receta precisa de nutrientes en un recipiente estril.

En los aos 60s se reconoci lo que el cultivo de tejido poda ofrecer a la horticultura y la
agricultura y esto provey un estmulo para la evolucin de la tecnologa. Particularmente los
beneficios aparecan en aquellas especies de cosecha donde existan algunos problemas de
propagacin. Por ejemplo, donde la produccin de semillas es limitada, o las semillas no originan
plantas veraces al tipo, o la propagacin por medio de bulbos, tubrculos o esquejes es muy baja.
La habilidad del cultivo de tejido para acelerar la multiplicacin de lneas nuevas obtenidas por
cruzamiento acelera su evaluacin, y las puede colocar rpidamente en mercado. Este fue un
avance radical para los mejoradores de estas cosechas. Adems, donde hay una necesidad por un
reemplazo rpido o anual con material sano nuevo en una escala confiable de tiempo. Hoy da, hay
muchas especies donde el cultivo de tejidos se ha vuelto un mtodo regular y establecido de
propagacin, por ej. para la papa, dtiles, banana, un amplio rango de cultivos para flor cortada y
numerosas plantas ornamentales de maceta.

1. Procedimiento del cultivo de tejidos

El cultivo de tejido in vitro consiste en tomar una porcin de una planta a la que se denomina
explanto, como por ejemplo: el pice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema,
embrin, nudo, semilla, antera, etc. y colocarla en un medio nutritivo estril (usualmente
gelificado, semislido) donde se regenerar una o muchas plantas. La formulacin del medio
cambia segn se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y races, u obtener
embriones somticos para producir semillas artificiales.

1. 1 Facilidades requeridas para que el cultivo de tejido sea efectivo

a) El laboratorio: Una habitacin limpia que provee aire filtrado, gabinetes de flujo de aire
laminar estril en los cuales el material puede ser manejado sin riesgos de contaminacin
por el operador y transferido en forma segura a medios nutritivos frescos. Esta
transferencia es el paso de manufactura individual en el cual los tejidos que crecieron
previamente en medio de cultivo son manipulados y subdivididos con escalpelo y pinzas
dentro del medio ambiente estril del gabinete de flujo laminar, de manera de
transferirlos a nuevo medio de cultivo y un nuevo recipiente para posterior crecimiento,
multiplicacin o desarrollo
b) El cuarto de crecimiento: Una habitacin iluminada, temperatura adecuada, con aire
acondicionado y con alto estndar de higiene en el cual los cultivos de tejidos pueden
crecer y desarrollarse en forma segura por perodos de semanas o meses.

La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo


menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo,
humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras
climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor) y una
buena y uniforme circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de
alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En
general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de
luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes
del tipo luz da con una irradiancia de entre 50 y 200 mol m-2s-1. La humedad
atmosfrica debe ser elevada (80- 90%).

1.2 Pasos para generar plantas a partir de explantos aislados

a) Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantos.


b) Establecimiento: Desinfeccin de los explantos generalmente con hipoclorito de sodio y
su posterior adaptacin al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raz o embrin
somtico, segn se desee.
c) Multiplicacin: Generar una masa vegetal suficiente para la regeneracin del nmero de
plantas necesarias.
d) Enraizamiento: Formacin de races con el fin de convertir los brotes o embriones
somticos en plntulas completas.
e) Rusticacin: Aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones
medioambientales ex vitro (suelo o algn sustrato inerte).

El xito de la tcnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta, a mayor edad,
menor potencial de regeneracin, el genotipo y las condiciones medio ambientales. Adems, se
necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos
laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estril, protegiendo as
a la muestra, tambin se necesita un soporte para el explanto, que puede ser slido o lquido, y
que est conformado por algn agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y
micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono,
vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales que ayudarn a obtener
una planta completa, o un rgano vegetal en particular a partir del explanto elegido; luego se
regulan las condiciones de temperatura, y de fotoperodo (relacin de horas luz y horas
oscuridad).

1.3 Relacin del cultivo in Vitro con la Biotecnologa

La propagacin de plantas in vitro es una tcnica de la biotecnologa muy utilizada en cultivos de


importancia econmica, pues permite cultivar clulas, tejidos, rganos, semillas, embriones y
obtener individuos selectos en forma rpida.

1.3.1 La micropropagacin

La micropropagacin (propagacin clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los mtodos
biotecnolgicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la
produccin masiva de especies hortcolas, aromticas, medicinales, frutcolas, ornamentales y
forestales.

La estimulacin de las yemas axilares o adventicias es el proceso ms comn que se conoce para la
micropropagacin de las plantas. Aqu, las citocininas causan una generacin contnua de estas
yemas en la base del cultivo que prolifera. Cada yema desarrolla en un tallo enanizado el cual a su
vez puede producir ms yemas en su base. Esta proliferacin de tallos y yemas continuar siempre
que sea mantenido un suministro adecuando de citocinina junto con nutrientes y espacio fsico
por subdivisin de los cultivos y transferencia de los mismos a medio fresco cuando sea necesario.
Alternativamente, el tallo puede separarse del suministro de esta hormona, la cual tiende a
suprimir la formacin de races, y ser transferido a medio nuevo conteniendo una hormona del
grupo de auxinas, la cual estimular el desarrollo radicular en la base del tallo. Tales tallos
enraizados pueden transferirse luego afuera del ambiente estril del cultivo de tejido y, con
cuidadoso control de humedad y luz, ser aclimatada para volverse una planta que crece
convencionalmente en forma dependiente de la fotosntesis.
Imagen: A partir de una planta madre, se obtienen numerosos explantos que, sujetos a condiciones y medios de
cultivo adecuados, darn lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original, permitiendo su
multiplicacin

Ventajas

- Otorga la posibilidad de incrementar rpidamente nuevos materiales.


- Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su independencia de los mismos
(luz, temperatura y humedad controlada).
- Permite estudiar diversos procesos fisiolgicos
- Evita el riesgo de que proliferen agentes patgenos porque la micropropagacin se
realiza en medios esterilizados.
- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
- Permite la obtencin de individuos uniformes.
- Facilita el transporte del material.

1.3.2 Cultivo de meristemas

En la yema apical se encuentra un grupo de clulas que conforman el meristema apical (con un
tamao entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los
tejidos de la planta y regenerar plantas completas.

El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las ms importantes, es la


obtencin de plantas libres de virus, ya que esta pequea zona de tejido generalmente no est
afectada por estos patgenos vegetales. Otra aplicacin es la multiplicacin vegetal de enorme
potencial: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4 millones de claveles en un ao.
La tcnica permite multiplicar especies de plantas con reproduccin lenta o dificultosa (como las
orqudeas), o acelerar la produccin de plantas bianuales.

Imagen: A partir de una planta madre, se obtienen numerosos explantos que, sujetos a condiciones y medios de
cultivo adecuados, darn lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original, permitiendo su
multiplicacin

1.3.3 Cultivo de clulas y rganos vegetales en biorreactores

A partir de los callos de algn explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una
suspensin de clulas. La misma puede utilizarse para generar embriones somticos (la base de las
semillas sintticas), o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que
son compuestos qumicos sintetizados por las clulas vegetales en determinadas condiciones, con
gran utilidad para las industrias farmacutica y alimenticia, entre otras. Los cultivos celulares se
llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles
de litros), diseados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicacin de distinto tipo de clulas
y/u rganos.

Imagen: A partir de un explanto, se pueden establecer cultivos de clulas para producir compuestos de inters, o
para obtener embriones somticos y semillas artificiales, entre mltiples aplicaciones.
Ventajas

Permiten un control preciso y fino del medio ambiente: En un solo cultivo se pueden
regular todos los factores del medio: Fsico-qumicos.

Caracterizacin y homogeneidad de la clula: Las clulas en cultivo de una lnea celular, o


de una lnea continua son homogneas, con morfologa y composicin uniformes debido a
esto se pueden obtener con facilidad un numero elevado de replicas idnticas

Economa. Suponen una economa en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al


realizarse en volmenes reducidos, y con un acceso directo de las clulas a la droga las
concentraciones requeridas son mucho ms bajas que en el animal completo

Desventajas

Tcnica sensible. El crecimiento de las clulas animales es mucho ms lento que el de los
contaminantes ms habituales y adems dado que proceden de organismos
pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes
que simula el plasma o el fluido intersticial.

Cantidad y costo. El costo de produccin de 1 g de tejido en cultivo es ms de 10 veces


superior al obtenido en el animal.

La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales


de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre el ensayo "in vivo"
pero es una alternativa vlida en muchas situaciones.

Inestabilidad. Muchas de las lneas celulares continuas son inestables, como


consecuencia de la dotacin cromosmica aneuploide.

Aplicaciones

Sus aplicaciones van desde estudios tericos sobre fisiologa y bioqumica vegetal, hasta la
obtencin de plantas libres de patgenos, conservacin de germoplasma, produccin de
metabolitos secundarios, propagacin masiva de plantas, mejoramiento gentico, induccin
de mutaciones, seleccin in vitro y desarrollo de protocolos de regeneracin de plantas para
su utilizacin en ingeniera gentica.

Organognesis.

Cultivos( Embrioides y anteras (Andrognesis)).

Resistencia.

Aislamiento de protoplastos.

Introduccin de nueva variabilidad gentica.


Propagacin masiva de plantas, especialmente para especies de difcil propagacin por
otros mtodos, o en vas de extincin.

Clonacin de individuos de caractersticas agronmicas muy deseables durante todo el


ao.

Produccin de semillas sintticas.

Conservacin de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad


gentica de una poblacin vegetal).

Obtencin de metabolitos secundarios.

Produccin de nuevos hbridos.

Mejora gentica de plantas (incluyendo obtencin de plantas transgnicas).

Germinacin de semillas.

Produccin de haploides.

Estudios fisiolgicos diversos.

Conclusin

El cultivo de tejidos es una tcnica de un enorme potencial, tanto en investigacin como en el


desarrollo y en la produccin de cosecha. En muchos sentidos an est operando en manera muy
cruda, y cada ao encuentra nueva sofisticacin y conocimiento aplicado. La principal limitacin es
nuestro pobre entendimiento de cmo funcionan las hormonas vegetales, las cuales tienen un rol
central en esta tecnologa, y el alto costo de los procesos que requieren adems una cuidadosa y
entrenada mano de obra. Estas limitaciones podrn hallar salida en la respuesta que puedan
brindar tanto los fisilogos vegetales que trabajan en el campo hormonal como los ingenieros que
trabajan en la mecanizacin de los procesos.

Bibliografa

Abdelnour- Esquivel, A., & Escalant, J. V. (1994). Conceptos bsicos del cultivo de tejidos
vegetales. CATIE.
ArgenBio. Consejo Argentino para la informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa.
(2007). Por Qu Biotecnologa. Programa educativo de ArgenBio. Obtenido de Por Qu
Biotecnologa: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/