PRACTICA No 9

CONSERVACIN DE HONGOS FILAMENTOSOS

Docente Catedrtico: Marcela Quintero. Mic.Industrial

9.1. INTRODUCCIN

Otro grupo de gran importancia en produccin agroindustrial son los hongos

filamentosos, organismos que se caracterizan por producir gran cantidad de

enzimas, saborizantes, antibiticos y algunos de ellos ejercen control biolgico

sobre organismos patgenos para el hombre, animales y plantas, razn por la cual

su conservacin es fundamental para garantizar estabilidad, viabilidad y actividad.

(Monroy, 2005)

La conservacin se puede realizar por:

- Mtodos a corto plazo: Subcultivo en medios especficos

- Mtodos a mediano plazo: Aceite mineral, agua , suelo y arena

- Mtodos a largo plazo: Liofilizacin, criopreservacin y secado

De acuerdo al crecimiento que tienen estos microorganismos se puede conservar:

Micelio o esporas, sin embargo las ltimas son ms utilizadas por la facilidad de

manejo y mayor resistencia por su composicin celular

De la misma forma que en las bacterias y levaduras se debe conocer la poblacin

inicial, se realiza por medio de recuento en cmara (conidios) y tcnica de dilucin

decimal y siembra en placa, para estimar las UFC/ml.

Con respecto al muestreo, seguimiento y evaluacin en funcin del tiempo se

deben tener las mismas consideraciones que los bancos para bacterias y

levaduras.

9.2. OBJETIVOS

Objetivo general

Elaborar y evaluar un banco de cepas de trabajo a base de conidios de hongos

utilizando mtodos a corto y mediano plazo

Objetivos especficos

- Realizar conservacin de Trichoderma harzianum utilizando aceite mineral

- Determinar la funcin de la tcnica de desprendimiento de conidios por

medio de perlas de vidrio.

- Determinar la concentracin inicial del banco de clulas o el N o de la

poblacin, mediante recuento de conidios/ml

- Evaluar el mtodo de conservacin, de acuerdo al recuento de conidios

obtenido.

9.3. REACTIVOS Y MEDIOS

- Agar PDA

- Aceite mineral

- Azul de lactofenol

- Solucin salina 0.85% p/v

- Tween 0.1% v/v

9.4. MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO

9.4.1. Conservacin en aceite mineral

- Tubo eppendorf de 1.5 ml con 1 ml de aceite mineral (1)

- Tubo eppendorf estril vacio (1)

- Caja de petri con Trichoderma sp crecido y esporulado (2 por grupo de

trabajo).

- Pipeta Pasteur vidrio estril (1)

- Caja de petri con medio PDA (1)

- Laminas y laminillas

- Agujas de diseccin

- Agar Saboureaud (2)

9.4.2 Obtencin de conidios por desprendimiento con perlas de vidrio

- Caja de petri con Trichoderma harzianum esporulado (1)

- 2 perlas de vidrio estriles .

- Tubo de 12 x 75 mm con 5 ml de solucin salina con tween al 0.1% v/v

estril (1)

- Tubo para tomar porciones del medio de cultivo

- Tubo de 12 x 75 mm estril solo.(1)

- Tubos de 13 x 100 mm con 4.5 ml con agua destilada estril (4)

- Pipetas pasteur estril (2)

- Cmara de Neubawer

9.5.EQUIPOS

- Nevera de 7oC
 - Microscopio

- Autoclave

9.6.MICROORGANISMO A EVALUAR

- Trichoderma sp

9.7. METODOLOGA

9.7.1.Pruebas de pureza: Realice preparacin de azul de lactofenol para verificar

pureza del microorganismo

9.7.2. Conservacin en aceite mineral: Para esta parte a cada lado de mesa se

le entregar una caja con un cultivo de Trichoderma harzianum, a partir de esta

caja obtenga una muestra utilizando la pipeta pasteur invertida, de tal manera que

se obtenga un disco de 5mm de dimetro que contiene un fragmento de agar y el

microorganismo. (figura1). Bajo condiciones de esterilidad, destape el tubo

eppendorf y deposite dentro, el disco de agar , tpelo y gurdelo en refrigeracin.

Repita el mismo procedimiento para el tubo eppendorf vacio.

Cultivo de Trichoderma Disco sumergido en

harzianum esporulado aceite mineral

Figura Conservacin de hongos

Al termino de 5 das conservacin, coloque los discos que se que se encuentran

dentro de los tubos eppendorf en agar saboureaud. Mida desde el dia 1 con una

regla el dimetro del crecimiento del micelio y realice una curva de crecimiento.

9.7.3. Desprendimiento de conidios con perlas de vidrio

Tome el cultivo de Trichoderma que se le entreg y bajo condiciones aspticas

destape la caja y adicione los 5 ml de solucin salina al 0.85% p/v con Tween al

0.1% v/v, posteriormente coloque las tres perlas de vidrio y empiece a moverlas

con movimientos de rotacin para favorecer es desprendimiento de conidios.

Con la pipeta pasteur tome la totalidad de muestra y transfirala al tubo de 12x

754 mm solo.

A partir de este tubo prepare diluciones decimales 101 y 102 y realice el recuento

en cmara utilizando las dos diluciones. Conserve esta suspensin a temperatura

de refrigeracin.

9.8.RESULTADOS

9.8.1.Determinacin de pureza :

Tabla . Prueba de pureza

Microorganismo Caractersticas Caractersticas

evaluado macroscpicas microscopicas
9.8.2. Recuento de conidios/ml en cmara

Tabla. Recuento de conidios/ml

Microorganismo Conidios/ml
Dilucin 102

9.8.3 Evaluacin de la conservacin

Despus de 8 das en congelacin, coloque cada uno de los discos pertenecientes

a cada vial en medio de cultivo PDA, realice lecturas diarias de crecimiento radial

del micelio. Estas mediciones deben hacerse hasta que el hongo alcance el borde

de la caja.

Da Crecimiento
micelial (mm)
1

9.9.REVISIN TEORICA DE COMPLEMENTACION

.Cal es el fundamento de la tcnica de conservacin por liofilizacin,

nitrgeno lquido, leche descremada, sensidiscos y papel para esporas de

hongos?

Cmo se realiza la prueba de viabilidad para hongos segn la norma

expedida por CENICAFE?

 .Cmo se conservan clulas eucariotas?

Realice la bsqueda de un artculo de los ltimos cuatro aos, donde se

establezca la importancia de la conservacin de microorganismos filamentosos

en produccin industrial. Anexar artculo.