Entwicklung einer Markergen-freien

Amylopektin-Kartoffel

Dr. Andrea Schwarzfischer

Dr. Michael Reichmann

Bayerische Landesanstalt fr Landwirtschaft

Institut fr Pflanzenbau und Pflanzenzchtung

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Das erwartet Sie:

- Gentechnik an der LfL

- Gentechnik bei Kartoffeln

- Amylopektin-Kartoffel

- Markerfreie Transformation

- Ausblick

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Gentechnik ist eine neue Zchtungsmethode
Ziele: konventionell und biotechnologisch

Erhaltung und Verbesserung der

- Gesundheit
- Qualitt
- Ertragsleistung unserer Kulturpflanzen

Zielgruppe:
Verbraucher, Landwirte, Umwelt

Zchtungsfortschritt bei Kartoffeln

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln
Vorteil: gezielte Verbesserung
Klassische Zchtung Gentransfer
Kreuzung Transformation
Zufllige Neukombination von Addition weniger Gene (1-4)
ca. 30.000 Genen zu 30.000 Genen in zuflliger
Position

Selektion
Langjhrig (>10 Jahre), aufwndig schneller (6 Jahre), gezielter

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Vorteil: neue Mglichkeiten

- Inaktivierung von arteigenen Genen zur Hemmung der

Produktion von Inhaltsstoffen
Amylopektin-Kartoffeln, Kartoffeln mit weniger Glykoalkaloiden

- Nutzung artbergreifender Resistenzmechanismen

Virusresistente Kartoffeln (cpPVY),
Flavonoid-Kartoffeln
Phytophthora-Resistenzgen aus Solanum bulbocastanum

- Produktion vllig neuer Inhaltsstoffe

Kartoffeln mit Taq-Polymerase

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Biotechnologische Methoden fr die Kartoffelzchtung

Hochentwickeltes Zuchtmaterial/Genpool

Haploidiezchtung
Gentransfer
Konventionelle Selektion
Zchtung

Protoplasten-
Selektion Marker- fusion
entwicklung

Neue Sorten

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Gentransfer - Methoden

1. Genfhre: Agrobacterium 2. Genkanone

natrliches System Wurzelhalsgalle

Verwundung
Anlockung
Infektion

3. Direkter Gentransfer:
chemisch (PEG)

elektrisch

Ultraschall

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Ablauf der Agrobacterium-Transformation bei Kartoffeln

Genklonierung in E. coli
Regeneration

Selektion
PCR, Biotest
Zielgen Vektor

Transformation Gentransfer
von A. tumefaciens in vitro-Vermehrung
GV3101/pMP90RK Knollenproduktion
im Gewchshaus

Prparation von
Internodien
gemeinsame
Inkubation
zchterische Evaluierung
im Rahmen von
transformierte Freisetzungs-
Pflanzenzelle versuchen
Zellkern mit zufllig
eingebautem Zielgen
In vitro-Etablierung der eventuelle
Kartoffelpflanzen Sorten-
Zulassung

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Ablauf der Kartoffel-Transformation in Bildern

nativ transgen

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Strkezusammensetzung

Verzweigtes Amylopektin Amylopektin-Strke

1,4- und 1,6-Glucose-Gemisch
Ausschnitt des 75% T amylosefre
i
Strkemolekls B
HOCH 2

O
H H H
Glucose

o oH H
H o

H oH
1
Lugol-gefrbte Viskosittsprofil
Verzweigung Strkekrner
CH 2
6

HOCH 2

O O
H H H H

Native Strke
H H
Glucose
Glucose

o oH H
H o oH H
H o
1 4
H oH H oH

T
Kettenverlngerung B

Lineare helikale Amylose

reines 1,4-Glucose-Polymer Lugol-gefrbte Viskosittsprofil
Strkekrner
25%

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Strkebiosynthese

Blatt Photosynthese
Chloroplast

Phloem
Saccharose
UTP
Saccharose-Synthase
Pi
UDP-Glucose + Fructose
Invertase UTP UTP-Glucose Phosphorylase Cytosol
Pi

Glucose + Fructose Glucose-6-P

Hexose-1-P
ATP-Glucose-Pyrophosphorylase
ATP
PPi

Knolle ADP-Glucose
granulr gebundene
Strkesynthase
1,4-Glucan lsliche
Amyloplast
Verzweigungsenzym
Strke
1,4 und 1,6-Glucan

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Genkonstrukt zur Vernderung der Strkezusammensetzung

GBSS-Promotor
GBSS
Intron 1 Exon 1

asGBSS Terminator
(Exon 2) NptII
Terminator T- DNA
Promotor

LB RB
(Linke Grenze (Rechte Grenze
der T-DNA) der T-DNA)
13672 bp

NptIII
Promotor

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Zerstrung 1999

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 TGA (mg/100 g fw)

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
077-2

051-2

213-1

310-1

220-4

262-1

285-3

448-2

146-1

262-3

270-4

320-1

220-2

220-1

361-4

170-3
1999

194-1

405-1

353-3
2001

407-1
21,0
2001

464-1

581

Walli

Walli

Walli
1999
23,5
Glykoalkaloid-Gehalt in asGBSS-Kartoffeln

Walli
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24,5
 Genkonstrukte zur Vernderung der
Strkezusammensetzung
Freisetzung 2004 Freisetzung 1999
Promotor pWx
GBSS Exon1/Intron 1 GBSS
Promotor pWx
Intron 1 Exon 1

asGBSS RB asGBSS Terminator

581 bp T35S NptII

pUC19
Promotor
T35S
LB
MPI RB
LB pMFlp9-1
9510 bp 13672 bp

aadA

pVS1

NptIII Promotor

Hemmung des Gens der granulr gebundenen Strkesynthase

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Besonderheiten der Freisetzung der LfL

Keine bertragung von Antibiotikum- oder

Herbizid-Resistenzgenen
Erstmalige Freisetzung Markergen-freier Pflanzen
in Europa nach ber 1900 Freisetzungen
Ausschlieliche bertragung von Fruchtart-
spezifischen Gensequenzen
Entwicklung vom Genkonstrukt bis zum Produkt
und Evaluierung ausschlielich durch ffentliche
Hand

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Mehrfachintegration des Genkonstruktes

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Sicherheit durch Genehmigungsverfahren
Zulassungsbedingung: kein Risiko fr Mensch und Umwelt!

Freisetzungsantrag
nach Gentechnik-Gesetz
Antragsteller

Bundesamt fr Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

Genehmigungsbehrde

Information an EU Biologische Bundesanstalt

Kommentar von EU Bundesamt fr Naturschutz
ffentliche Auslegung Einvernehmensbehrden, Veto-Recht
Einwnde
Zentrale Kommission fr
Information der Landesbehrde
Stellungnahme
Biologische Sicherheit (ZKBS)
Beratung
berwachung

Freisetzung

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Rekombinationssysteme (cre/lox, -Resolvase/res,
Ac/ds, FLP/FRT) zur Markergenentfernung
1. Transfer der T-DNA mit res-Markergen 3. Einfhrung der Rekombinase-Aktivitt

Agrobacterium
Resolvase

Zellkern

Markergen

LB res RB
res
2. Selektion mit res-Markergen 4. Auswahlverfahren (Gegenselektion)

Transgene, markerhaltige Transgene, markerfreie

Pflanzen Pflanzen

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Rekombination in Kartoffelprotoplasten

Expressionsplasmid

x GBSS

mRNA

Cytoplasma

x
Zellkern
mRNA asGBSS

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Basenpaargenaue Rekombination genomischer
Substrate

FLP YQ
res [28 bp] res [28 bp]
ag2- nptII ag1+

pGRKR3
res [28 bp]
c gt c cg a aa t a t t a t a a a t t a t c g c a c a t g c a g g - - - - - - - c c t g c a
ag2- ag1+

T C T C A T C T A G A CGT CC G AAAT AT T A T AA A T T A T C GC AC A A C GC G T T C T G

pGRKR3/ Resolvase
Episom
CGT C C GA AA T A T TA T A A A T TA T CGC AC A A C GC G T T C T G
T C T C A T C T A G A CGTC
YQ T C T C A T C T A G A C GAA A T A T T A T A A A T T A T CGCACA A C GC G T T C T G

Genom
T C T C A T C T A G A CGTC C GAA A TA T T A TAA A T T A TCGCACA A C GC G T T C T G
YQ T C T C A T C T A G A CGTC C GAA A TA T T A TAA A T T A TCGCACA A C GC G T T C T G

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RNAi: Doppelstrang RNA fhrt zu Geninaktivierung

Mobiles silencing
silencer Dicer Signal
pUC19

siRNA
pSD11a
10590 bp
RISC

Nucleus
aadA

mRNA Abbau
Transformation
hp RNA

Cytoplasma
DNA/histone Methylierung

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Kreuzungen mit transgenen Linien
aufgrund hoher Virusanflligkeit (PVY) und zur Transgenreduktion

1999: 6 asGBSS-Linien (Walli, Patrona) x 18 konv. Sorten/Stmme

15591 Samen von 46 Kreuzungen
4371 in vitro-Smlinge analysiert
1121 transgene Smlinge identifiziert (PCR/Jodtest)
2004: 2 asGBSS-Linien (Walli) x 3 konv. Sorten/Stmme + S. phureja
ca. 4000 + 9 Samen

nicht alle Transgene zeigen vernderten Strkephnotyp!

Kreuzungsbedingte Inaktivierung?
Stumme Integration?
nicht alle Amylopektin-Kartoffeln zeigen Transgenitt!
epigenetische Inaktivierung?

Schwarzfischer/Reichmann Biotechnologie Kartoffeln

Vorteile der Amylopektin-Strkekartoffel

Strkeproduktion einer
mittelstndischen
Strkefabrik:
150.000 Tonnen/Jahr

reale Menge an dadurch

entsprechend chemisch Abwasserbelastung:
modifizierter Strke: 15.000 EGW/Tag (1EGW =
kobilanz Abwasser/Einwohner/Tag)
15.000 Tonnen/Jahr

mit amylosefreier Strke aus

transgenen Kartoffeln
keine Abwasserbelastung

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 Vorteile der Amylopektin-Strkekartoffel
Landwirtschaft:
Neuer Nachwachsender Rohstoff

Strkefabrik:
- Kostengnstigere Produktion durch
Einsparung der chemischen Modifizierung
- Neue Anwendungsmglichkeiten (Rohstoffreinheit)

aber:
- Strenge Auflagen durch GenTG Umwelt:
- ffentlicher Druck
Aufwandsentschdigung Einsparung von Abwasser,
Chemie und Energie
aber:
separate Erfassung ntig

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