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172.601 Biochemische Technologie

Allgemeine Biotechnologie (Biochemical Engineering)

B. Wachstum / Produktbildung

Univ.Prof.Dr. W. Hampel

Zellmaterial

• Arten von Zellen

• Wachstum und Produktbildung

– Stöchiometrie und Energetik

– Kinetische Grundlagen

• Herkunft

• Stammhaltung und Stammverbesserung

• Herführung

Arten von Zellen

• Mikroorganismen [Zellwand; effizienter Stoffwechsel, aerob/anaerob; kaum Wuchsstoffe, gen.Manipulation]

– Bakterien

– Hefen (Ascomyceten)

– Schimmelpilze

• Pflanzenzellen [Zellwand; td >; aerob/phototroph; geringe Wuchsstoffe, ein/mehrzellig]

• Tierische Zellen [Zellmembran (mechan.u.osmot.Instabil), aerob, td >; komplexer Wuchsstoffbedarf; mehrzellig]

– menschliche Zellen

Bakterien

Bakterien • keine Kompartimentierung • Größe: 0.5 – 20 µm • Unterschiede: – Form: Kugel/Stäbchen/Spirille
Bakterien • keine Kompartimentierung • Größe: 0.5 – 20 µm • Unterschiede: – Form: Kugel/Stäbchen/Spirille

• keine Kompartimentierung

• Größe: 0.5 – 20 µm

• Unterschiede:

– Form: Kugel/Stäbchen/Spirille

– Beweglichkeit (Geiseln)

– Sporenbildung

– Zellwandaufbau (Gram-Färbung)

– Substratverwertung

– Aerob/anaerob

• Wachstum: Teilung t d = 0.2 – 1 h

• DNA: circulär (3-9 Mio Bp); Plasmide (einf.genet. Manipulation)

• hohe Stoffwechselaktivität; einfache Regulation

• einfache Kultivierung (geringer Wuchsstoffbedarf )

• große metabolische Diversität

• vorwiegend GRAS (wenige pathogen)

Sprosspilze (Hefen) • Kompartimentierung (Eukaryont) • Größe: ca. 10 µm • Wachstum: Sprossung t d
Sprosspilze (Hefen) • Kompartimentierung (Eukaryont) • Größe: ca. 10 µm • Wachstum: Sprossung t d

Sprosspilze (Hefen)

• Kompartimentierung (Eukaryont)

• Größe: ca. 10 µm

• Wachstum: Sprossung t d = 2-10 h;

• Ascosporenbildung (sexueller Zyklus; dipoid/haploid)

• Genom: 4-16 Chromosomen; 10-20 Mio Bp; Plasmide

• Zellwand: Mannan/ß-Glucan/Chitin

• heterotroph (pH 3,5 – 5)

• Einfache Kultivierung

• Geringer Wuchstoffbedarf

• Vorwiegend GRAS

Schimmelpilze

Schimmelpilze • Kompartimentierung (Eukaryot) • Größe: bis 100µm; mehrzellig • Wachstum: verzweigte Fäden
Schimmelpilze • Kompartimentierung (Eukaryot) • Größe: bis 100µm; mehrzellig • Wachstum: verzweigte Fäden

• Kompartimentierung (Eukaryot)

• Größe: bis 100µm; mehrzellig

• Wachstum: verzweigte Fäden (Hyphen); Spitzenwachstum; Mycelbildung (Pellet)

• Zellwand: Chitin/ ß-Glucane

• Asexuelle Sporenbildung (Konidien)

• Sexuelle Fruchtkörperbildung

• Meistens GRAS-Organismen

• Aerober Stoffwechsel

• Einfache Kultivierung

Zellmaterial - Eigenschaften

• Pflanzenzellen [Zellwand; td >; aerob/phototroph; geringe Wuchsstoffe, ein/mehrzellig]

Kallusbildung (Differenzierung durch Auxin/Cytokinin)

Suspensionskultur (Protoplasten)

• Tierische Zellen [Zellmembran (mechan.u.osmot.Instabil), aerob, td >; komplexer Wuchsstoffbedarf; mehrzellig]

Gewebshaupttypen: Epithel-, Bindegewebs-, Muskel-, Nerven-, Lymph-Zellen

Primärzellen (direkt aus Gewebe; diploid): begrenzte Teilung[~50], Kontakthemmung, Oberflächenwachstum]

– Transformierte Zelllinien (aneuploid): gebildet z.B.

durch Carcinogenese, Virusinfektion, Protoplastenfusion

Spezielle Zelllinien (BHK, CHO, HeLa,

)

Zellwachstum - Stöchiometrie

BIOMASSE

• Molekulare Zusammensetzung

– Protein (32-55%); Kohlenhydrat (9-49%); Lipide (7-8 %); Nukleinsren (5-23%); Asche (5-10 %)

• Elementare Zusammensetzung:

– C (48.8 %) ; H (7.3 %), O (32.5 %), N (11.4%)

– C : H: O : N = 1 : 1.64 : 0.52 : 0.16

– CH 1.64 O 0.52 N 0.16 [MG 24,2] für organ.Substanz

– M x 25,5 g/C mol (bei 5% Asche)

– Abweichungen bei intrazelluläre Anhäufung von Speicherstoffen (z.B. N-Limitierung)

Zellwachstum

Biochemie:

Kopplung von Anabolismus und Katabolismus

Anabolismus:

C-Quelle + N-Quelle + Mineralstoffe + Energie[ATP] Biomasse

Katabolismus:

Energiequelle (e-Donor) + Oxidationsmittel (e-Akzeptor) ox.Donor + red.Akzeptor + Energie[ATP]

Biomasse Katabolismus: Energiequelle (e-Donor) + Oxid ationsmittel (e-Akzeptor) ox.Donor + red.Akzeptor + Energie[ATP]

Zellwachstum - Stöchiometrie

Elektronendonatoren

n-Alkane/CO 2 (Methan) R-OH/CO 2 (EtOH) Polyole/CO 2 (Glycerin) R-CHO/CO 2 Zucker/CO 2 (Glucose) R-COOH/CO 2 (Acetat) Dicarbonsren/CO 2 S/SO 4 2- NH 4 + /NO 2 Fe 2+ /Fe 3+

-

Elektronenakzep- C-Quelle

toren

Pyruvat/Laktat Acetaldehyd/EtOH Fumarat/Succinat O 2 /H 2 O (Atmung) SO 4 2- /HS -

NO 3 - /NH 4

NO 3 - /N 2

HCO 3 - /CH 4 H + /H 2

+

n-Alkane (Methan) R-OH (EtOH) Polyole (Glycerin) R-CHO Zucker (Glucose) R-COOH (Acetat)

Dicarbonsren

CO 2

Zellwachstum - Stöchiometrie

Reaktionsgleichung:

a CH m O l + b NH 3 + c O 2 CH p O n N q + d CH r O s N t + eH 2 O + f CO 2 + Energie ( G)

Konstante Proportionen [Ausbeutekoeffizienten]

Yx/s = 1/a Yp/s = d/a

RQ = Y CO2/O2 = f/c Respirationsquotient CEI [Carbon Efficiency Index] = (1 + d + f) / a

Biomasseausbeutekoeffizient

Produktausbeutekoeffizient

Ermittlung:

Gesamtumsatz: Y X/S = (X E – X O )/(S O – S E ) = X/S Reaktionsgeschwindigkeit: Y X/S = (dX/dt) / ((dS/dt)

Erstellung:

Elementbilanz (4), Elektronenbilanz (e av ), Messung

Gültigkeit: solange dieselbe Stoffwechselsituation vorliegt!!

Wachstum - Energetik

Erhaltungsenergie:endogene Atmung oder Substratbedarf f. Erhaltung (Maintenance)

Y x/s =

Y x/s max * µ /(µ + m)

[Pirt]

bzw. 1/Y x/s = 1/Y x/s max + m/µ

m

Erhaltungskoeffizient [gS/gX*h] (= Y X/S max * µ ½ Yx/s )

wirksam bei µ < 0.01 – 0.05 h -1

[gS/gX*h] (= Y X / S m a x * µ ½ Y x / s

Wachstum - Energetik

Y G/X [kJ/C-mol X]: Y G/X = Y G/X max + m G / µ

m

G unabhängig von C-Quelle, Energiequelle und Oxidationsmittel

m

G = 4,5*EXP[-(69000/R)*(1/T – 1/298)

Temperaturabhängigkeit

Y G/X max :Einfluss der C-Quelle

Y G/X = 200 + 18*(6 – c) 1.8 + exp[((3.8 -γ S ) 2 ) 0.16 (3.6 + 0.4*c)]

c

γ S

Anzahl der C-Atome im Substrat Reduktionsgrad

Bereich: 200 – 1000 kJ/C-molX [Glucose ←→CO 2 ]

Reduktionsgrad (γ)

Äquivalente an verfügbaren e av für vollständige. Oxidation

C 6 H 12 O 6 + 12H 2 O 6HCO 3 - + 30H + + 24e -

O 2 + 4H + 2H 2 O – 4e -

C = 4; H = 1; N = -3; O = -2

= -4/2 = -2 [H 2 O = CO 2 = 0]

γ = 24/6 = 4

KW (6-8); ROH (5-6); KH (4); R-COOH (1-5); X (4.2)

Wachstum - Energetik

Reduktionsgrad: Stöchiometrische Bilanzierung in Reaktions- gleichung Lineare Beziehung zwischen den stöchiometr.Koeffizienten, der Energiequelle, des Oxidationsmittel und der Biomasse (Produkt)

γ S *a

+ γ O2 *2*c =

γ X

+

γ P *d

Y H/X [kJ/C-molX] Wärmebildung

Bilanz mit H o Aerobe Prozesse: H o ≈ ∆G o Atmung: 1 Mol O 2 = (465 +/- 84) kJ Wärme Freisetzung Anaerobe Prozesse: H o ≠ ∆G o

Wärmeaufnahme: methanogene Bakterien [Acetat -> CH 4 + CO 2 ]

Wachstum - Wachstumsphasen

(1)

lag-Phase

(2)

Beschleunigungsphase

(3)

Log-Phase (balanced growth)

(4)

Negat.Beschleunigungsphase

(5)

(Limitierungen) Stationäre Phase

(6)

Absterbephase

growth) (4) Negat.Beschleunigungsphase (5) (Limitierungen) Stationäre Phase (6) Absterbephase
growth) (4) Negat.Beschleunigungsphase (5) (Limitierungen) Stationäre Phase (6) Absterbephase

WACHSTUM - KINETIK

• Wachstumsmodelle:

Black-Box Modelle: alle Zellen einheitlich

• Vorliegen eines ausgewogenen Wachstums (Balanced Growth)

Strukturierte Modelle: strukturelle Unterschiede

• Veränderungen im RNA(Ribosomen)-Gehalt

• Veränderungen im Enzymgehalt (metabolische Regulationen

• Intrazelluläre Anhäufung von Speichersubstanzen

Segregierte Modelle: (Populationsunterschiede)

• Unterschiede im Alter

• Unterschiede in der Form

• Unterschiede im genet. Make-up (Plasmide)

Wachstum - Kinetik

Einzellige Organismen:

Grundlage: Zellzahlbestimmung (Zählung)

Zellteilungsmodell (einzellige Organismen) 1 2 4 8 16 32

N t = N o * 2 t/td

td

Verdopplungszeit

Synchrones Wachstum: alle Zellen im selben Teilungszustand (Treppenkurve)

Grundlage: Zellmassebestimmung (Gewicht, Volumen)

dX/dt = µ * X

µ Spezifische Wachstumsrate

µ = ln2 / td

X t = X o * e µ*t

(Gewicht, Volumen) dX/dt = µ * X µ Spezifische Wachstumsrate µ = ln2 / td X

Wachstum - Kinetik

• Filamentöses Wachstum (Pilze)

Mycelbildung:

Apicales Wachstum: dL/dt = α * N

Zunahme der Länge/Knospe [m/HSP.sec] Verzweigungsbildung: dN/dt = β * L

α

β

Verzweigungsrate [HPS/m.sec]

„Hyphal Growth Unit“ HGU = L/N = konst

M t = M o * exp(µ *t)

µ = SQR(α * β)

Pellet-Bildung: (kugelförmige Zusammenballung)

Wachstum nur in der Außenschicht; im Inneren liegt Limitierung vor

dR/dt = k g = konst. (R

dM/dt = k * M 2/3 integriert

Pelletradius)

[k = k g *(36π*ρ) 1/3 ]

M t 1/3

=

M o 1/3 + k * t

Wachstum - Kinetik

WEITERE EINFLUSSFAKTOREN

• Absterben: -dN/dt = µ d * N

dN/dt = (µ g d ) * N Malthus

µ g > µ d

µ g = µ d µ g < µ d

• Zelldichte

exponentielles Wachstum N = konst exponentielles Absterben

µ = µ max * ( 1 – N/N max ) Verhulst Wachstum bis zum Erreichen einer maximalen Zelldichte [logistisches Wachstum]

* ( 1 – N/N m a x ) Verhulst Wachstum bis zum Erreichen einer maximalen

Wachstum - Kinetik

Substratkonzentration

– Abnahme von µ bei [S]<<, mit µ = 0 bei S = 0

• Blackman: lineare Abnahme ab S crit

• Monod: µ = µ max * S /(S + K s ) ; hyperbolisch; mechanistisches Modell (vgl. Enzymkinetik)

• Moser: µ = µ max * S n /(K S + S n )

• Teissier: µ = µ max * (1- e -S/Ks )

µ = µ m a x * S n /(K S + S n ) •

Wachstum - Kinetik

Substratkonzentration

– Abnahme von µ bei [S] >> [osmotische Effekte, etc]

• als kompetitive Hemmung (Substrathemmung) formulierbar

µ = µ max * S /[K S *(1 +S/K I ) + S]

• µ = µ max [S /(K S + S)](1 - S/S max ) n

[ n=1: lineare Abnahme bis S max ]

µ = µ max * [S /(K S + S)]*EXP(-S/K S )

Aiba

x ) n [ n=1: lineare Abnahme bis S m a x ] • µ =

Wachstum - Kinetik

Mehrere Substrate: Unterschiedliche Einflüsse

wachstumsfördernd/wachstumsnotwendig

µ = [1 + E i /(E i + K e,i )] * j [µ max,j * S j /(K S,j + S j )]

• Essentielle Substrate: multiplikative Verknüpfung von µ

µ / µ max = min{[S 1 /(K S1 + S 1 )],[S 2 /(K S2 + S 2 )]} Diauxie: sukzessive Verwertung

Produktkonzentration: hemmende Wirkung

– hyperbolisch: µ = µ max * [ 1 / (1 + [P]/K p )]

– linear: µ = µ max (1 - [P]/P max )

Wachstum - Temperatureinfluss

• Temperatur: vgl. Enzymkinetik; Arrhenius-Gleichung (psychrophile, mesophile, thermophile, hyperthermophile)

(psychrophile, mesophile, thermophile, hyperthermophile) µ = µ o * EXP(-K/T) µ = µ o * EXP(-E

µ = µo * EXP(-K/T)

µ = µ o * EXP(-E g /RT)/[1 + B * EXP(-E den /RT)]

lineare Teile

E den

Aktivierungsenergie d. Denaturierung

Produktbildung - Kinetik

• Formen d. Produktbildung (Deindoerfer)

Einfach: fixe Stöchiometrie; keine Zwischenproduktan- häufung [Energiestoffwechselprodukte]

Simultan: Verschiedene Substrate gleichzeitig in Produkt übergeführt; variable Stöchiometrie [Speicherstoffe]

Konsekutiv: Anhäufung v. Zwischenprodukten [Aceton/Butanol]

Stufenweise: Substrat zunächst vollständig in Zwischen- produkt übergeführt, erst dann Produktbildung [Glucose/Gluconsäure/Ketogluconsäure]

Produktbildung - Kinetik

• Produkt - Energiestoffwechsel (teilende Zelle) [EtOH, Laktat] - Trophophase

dP/dt = r p = α * dX/dt = α * µ q p = α * µ

* X

• Produkt - stationäre Phase (nichtteilende Zelle) [Penicillin] - Idiophase

dP/dt = r p = ß * X

q p = ß

• Gemischtes Verhalten

dP/dt = r p = α * dX/dt = α * µ

dP/dt = r p = ß * X q p = ß • Gemischtes Verhalten dP/dt

* X + ß * X

dP/dt = r p = ß * X q p = ß • Gemischtes Verhalten dP/dt
dP/dt = r p = ß * X q p = ß • Gemischtes Verhalten dP/dt
dP/dt = r p = ß * X q p = ß • Gemischtes Verhalten dP/dt
dP/dt = r p = ß * X q p = ß • Gemischtes Verhalten dP/dt
dP/dt = r p = ß * X q p = ß • Gemischtes Verhalten dP/dt

Organismenmaterial - Herkunft

Kriterien

Ernährungscharakteristik Temperaturbereich Genetische Stabilität Produktausbeute /Produktivität Produktreinheit / Reinigungskosten

Screening mit Stämmen aus

Stammsammlungen (ATCC, DSM, NCTC, etc.) Isolate (Boden, Luft, Wasser)

• Selektivmedien

• Kontinuierliche Kultur

• Ökologische Nischen

Organismenmaterial - Stammhaltung

Kriterien:

– Vermehrungsfähigkeit

– Kontaminationsfreiheit

– Keine genetische Veränderung

Lagermöglichkeiten

– Tieftemperaturlagerung

• Schrägagar in Kühlschrank/Tiefkühlschrank (max. 1 a)

• Flüssiger Stickstoff – Zusatz von 10% Glycerin

– Trockenlagerung

• Erd(Sand)kultur

• Lyophilisierung

Organismenmaterial - Stammverbesserung

Unspezifische Wirkung

– Vereinzelung und Selektion (natürl. Mutation)

– Vereinzelung und Selektion nach künstl. Mutation (UV-Licht; EMS, MMS, MNNG, etc.)

und Selektion (natürl. Mutation) – Vereinzelung und Selektion nach künstl. Mutation (UV-Licht; EMS, MMS, MNNG, etc.)

Organismenmaterial - Stammverbesserung

Gezielte Veränderungen (Gentechnik)

– Rekombination

• Konjugation, Protoplastenfusion, sex/parasex.Cyclus

– Transformation und Transduktion

• Zielgerichtete Klonierung spezif. Gene (Amplifikation, Promotormodifikation, etc.)

• Zielgerichtetes Ausschalten spezifischer Gene (Antisense RNA)

Organismenmaterial - Inokkulum

• Kriterien:

– Aktiver Zustand bzw. passende morphologische Form

– Kontaminationsfreiheit

– Produktbildungsfähigkeit

– Adäquates Volumen

• Bakterien: 3 – 10 % v.Kulturvolumen, stufenweise Herführung, Zellen aus exponentieller Phase (keine Sporen!)

• Hefe: vgl. Bakterien; Kulturphase unerheblich.

• Schimmelpilze : Konidiosporen oder vegetatives Mycel

– Sporenkonserve ( Züchtung auf Agar; Absaugen)

– Sporensuspension (Züchtung auf Feststoffen (Rollgerste), Abschwemmen)

– Sporulationsmedien (Züchtung in Submerskultur; Spezialmedien )

– Vegetative Vermehrung: vgl. Hefe; ca. 10% Inokkulatmenge

Organismenmaterial - Herführung

Organismenmaterial - Herführung