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BIOQUIMICA BACTERIANA I

Tovalino León Evelyn

Escuela Profesional de Ingeniería en Acuicultura

Facultad de Oceanografía, Pesquería, Ciencias Alimentarias y Acuicultura

Universidad Nacional Federico Villarreal

2016

Objetivos

Determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar ciertos azucares

Diferenciar la metabolización por cambios en el medio de cultivo

Clasificar al microorganismo

Método

Participantes

-

Ámbito espacial y temporal

La práctica se realizó el 21 de Junio en el laboratorio de microbiología de la Facultad de Oceanografía, Pesquería, Ciencias Alimentarias y Acuicultura, ubicado en Roma 350, distrito de Miraflores

Materiales

Tubos de ensayo

Papel kraft

Hilo pabilo

Algodón

Aguja kohle

Gradillas para tubos de ensayo

Mechero Bunsen

Encendedor

Rotulador

Lata

EQUIPOS

Estufa

PROCEDIMIENTO

1.

FERMENTACION DE AZUCARES Cerrar puertas y ventanas

Desinfectar la mesa de trabajo y las manos con alcohol

Seleccionar los materiales a utilizar

Elegir la muestra a cultivar

Abrir la llave general de gas

Seleccionar el agar rojo fenol con maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa en tubos de

ensayo (previamente preparados) Colocar una lata con agua en calentamiento

Regenerar los medios de cultivo hasta pasar de fase solida a liquida

Enfriar hasta 45 °C

Esterilizar el alambre de la aguja kohle, colocándola oblicuamente a la llama

Abrir el tubo de ensayo que contiene la cepa, flamear tres veces su boca

Introducir la aguja kohle y tomar el inoculo

Flamear nuevamente la boca del tubo y taparlo

Sembrar el inoculo en los tubos de ensayo por picadura profunda

Flamear tres veces la boca del tubo que contiene el agar y taparlo

Colocar el tubo en la gradilla

Esterilizar el alambre de la aguja kohle, colocándola oblicuamente a la llama

Rotular los tubos que contiene el agar

Dejar solidificar

Colocar los tubos en una lata vacía y cubrir la superficie con papel craff

Incubar a 37 °C por 24 - 48 horas

Leer el cambio de color y clasificar al microorganismo

Figura 1. Calentamiento de los tubos kohle Figura 3. Siembra del inoculo Figura 2. riEsterilización de

Figura 1. Calentamiento de los tubos kohle

Figura 1. Calentamiento de los tubos kohle Figura 3. Siembra del inoculo Figura 2. riEsterilización de

Figura 3. Siembra del inoculo

Figura 1. Calentamiento de los tubos kohle Figura 3. Siembra del inoculo Figura 2. riEsterilización de

Figura 2. riEsterilización de la aguja

Figura 1. Calentamiento de los tubos kohle Figura 3. Siembra del inoculo Figura 2. riEsterilización de

Figura 4. Incubación en la estufa

Figura 1. Calentamiento de los tubos kohle Figura 3. Siembra del inoculo Figura 2. riEsterilización de

Figura 5. Resultados

2.

PRUEBA POLITROPA DE TSI

Cerrar puertas y ventanas Desinfectar la mesa de trabajo y las manos con alcohol

Seleccionar los materiales a utilizar

Elegir la muestra a cultivar

Abrir la llave general de gas

Seleccionar el medio TSI previamente preparado

Encender el mechero Bunsen

Esterilizar el alambre de la aguja kohle, colocándola oblicuamente a la llama

Abrir el tubo de ensayo que contiene la cepa, flamear tres veces su boca

Introducir la asa kohle y tomar el inoculo

Flamear nuevamente la boca del tubo y taparlo

Introducir el inoculo en el medio TSI en el centro y luego hacer una estria en la parte inclinada

Flamear tres veces la boca del tubo que contiene el medio TSI y taparlo

Colocar el tubo en la gradilla

Esterilizar el alambre de la asa kohle, colocándola oblicuamente a la llama

Rotular el tubo que contiene el medio

Colocar el tubo en una lata vacía

Cubrir la lata con papel craft y asegurar el papel con hilo pabilo

Incubar a 37 °C por 24 - 48 horas

Anotar los cambios en el medio

Figura 6. Toma del inoculo Figura 7. Resultado Resultados En la tabla 1 se presentan los

Figura 6. Toma del inoculo

Figura 6. Toma del inoculo Figura 7. Resultado Resultados En la tabla 1 se presentan los

Figura 7. Resultado

Resultados

En la tabla 1 se presentan los datos de fermentación de azucares

CEPA

MEDIO

TIEMPO/

COLOR

FERMENTACION

  • E. COLI

ARF + GLUCOSA

  • 48 AMARILLO

HORAS

 

  • 37 °C

  • E. COLI

ARF + MALTOSA

  • 48 ROJO

HORAS

 

-

  • 37 °C

  • E. COLI

ARF + LACTOSA

  • 48 AMARILLO

HORAS

 

  • 37 °C

  • E. COLI

ARF + SACAROSA

  • 48 AMARILLO

HORAS

 

  • 37 °C

ARF = Agar Rojo Fenol

En la tabla 2 se presentan los datos de prueba politropa de TSI

CEPA

MEDIO

TIEMPO/ T°

CLASIFICACION

E. COLI

TSI

48 HORAS 37 °C

FERMENTACION DE GLUCOSA Y LACTOSA

Discusiones

  • FERMENTACION DE AZUCARES

El caldo rojo de fenol es usado para observar la fermentación de algún carbohidrato como puede ser maltosa, glucosa, sacarosa, lactosa, trealosa, etc. El caldo rojo de fenol solo lleva un carbohidrato a la vez.

Ingredientes básicos:

Peptona de caseína, 12g Extracto de carne, 1g Cloruro sódico, 5g Rojo fenol, 0.018g Carbohidrato, 10g Agua destilada, 1000ml

El caldo debe estar a PH 7.4, el color del caldo queda naranja-rojizo.

Si hay fermentación del carbohidrato el caldo tornara de color amarillo, puede observarse gas en forma de burbujas, estas burbujas se pueden ver mucho mejor en una campana de Durham. Si no hay fermentación el caldo tiene una coloración naranja- rojiza.

Este fenómeno se basa en que el metabolismo de la fermentación produce ácidos medianamente fuertes como el ácido acético, acido fórmico, ácido láctico, ácido málico, entre otros, esto depende del tipo de carbohidrato que se ponga en el caldo. El rango de pH del indicador rojo de fenol es: 6.8 8.4, esto nos dice que a PH de 6.8 o menos el medio esta ácido y el indicador cambia a color amarillo y si el pH es de 8.4 o más el medio esta básico y el color se mantiene naranja-rojizo.

  • PRUEBA TSI

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.

El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias.

Este medio contiene lactosa con una concentración de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, además de la producción de gas y de ácido sulfhídrico.

La fermentación es un proceso que se lleva acabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacárido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaeróbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar ácido pirúvico, y posteriormente éste será degradado a través del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O y energía.

Por otra parte la lactosa (disacárido) será primero degradada a sus monosacáridos correspondientes (glucosa y galactosa).

Lactosa

Beta-galactosidasa

 PRUEBA TSI Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico

glucosa + galactosa

Ciclo de Krebs

Glucosa o galactosa

 PRUEBA TSI Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico

CO2 + H2O + energía anaeróbico

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentración 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa están presentes

como constituyentes de las bacterias, y éstas pueden obtener mayor energía por utilización del azúcar más simple.

Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilización de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estría, donde el oxígeno presente actúa como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzará a metabolizar el piruvato a través del ciclo aeróbico de Krebs (sobre la estría), formando productos finales ácidos. El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrán un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecerá rojo (indicando que no hay variación del pH) o se alcalinizará (lo que puede visualizarse por un color rojo algo más intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.

Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzará a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces más lactosa que glucosa, las bacterias encontrarán sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos. Luego 18 24 horas de incubación todo el medio TSI permanecerá de color amarillo. Esta reacción se denomina ácido sobre ácido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La producción de gas provocará la ruptura de la columna de agar o la empujará hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dará una reacción A/A más gas.

Si el organismo en estudio no es capaz de usar la lactosa del medio, debe producir energía en forma menos eficiente al utilizar las proteínas y aminoácidos del medio como fuentes nutritivas.

El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante. Los productos de la degradación de la peptona (como el amoniaco) son alcalinos y provocan el viraje del indicador rojo de fenol a su color rojo original. Un TSI inoculado con una bacteria que no fermenta la lactosa al cabo de 18-24 horas de incubación presentará la zona inclinada roja y el fondo del agar permanecerá amarillo debido al metabolismo anaerobio de la glucosa durante la primera etapa. Esta reacción se denomina alcalina sobre ácido (K/A).

Las bacterias que fermentan la glucosa también pueden formar productos alcalinos a partir de la utilización de la peptona, sobre la zona inclinada. Estas reacciones serán K/K.

Referencias bibliográficas

  • Microbiology, 2002.

  • http://www.microscience.com/STM.htm

  • http://www.microbiologyonline.org.uk/about.html