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Abschlussbericht
Projektarbeit
Chemietechnikerkurs 2007
Leverkusen
von
Sebastian Lachmuth und Christine Fütterer
Langenfeld
2010
Inhalt
1. EINLEITUNG ..............................................................................................3
6. LITERATURVERZEICHNIS .....................................................................13
7. ANHANG ..................................................................................................13
2
1. Einleitung
Capsaicinoide sind Scharfstoffe, die ausschließlich in Gewächsen der Gattung
Capsicum gebildet werden. Die Gattung Capsicum gehört zu der Familie der
Nachtschattengewächse (Solanaceae) und teilt sich in mehrere Arten wie C. annuum
und C. baccatum auf, denen die verschiedenen Sorten wie Peperoni, Tabasco und
Jalapeno zugeordnet werden (s. Anhang S.13, Abbildung 4). Es gibt weltweit ca. 50
verschiedene Capsicum Arten, wobei sechs kommerziell genutzt werden. Im Rahmen
dieser Arbeit werden einige bekannte Sorten hinsichtlich ihrer Capsaicinoid-
Zusammensetzung untersucht. [1][3]
Die Capsaicinoide sind geruchlos, farblos, nährwert- und bis auf die Schärfe
geschmacksfrei. In natürlich vorkommenden Mengen sind sie nicht toxisch,
verursachen aber im Mundraum ein scharfes Brennen. Dabei werden sie nicht über
die Geschmacksknospen sondern durch Schmerzrezeptoren wahrgenommen, die sich
im Mund, Nase und Magen befinden. Werden diese Rezeptoren angeregt, setzen sie
Neurotransmitter frei, die einen Schmerzimpuls an das Gehirn senden. [4]
Die Struktur der Capsaicinoide leitet sich von Vanillylamin ab. Sie unterscheiden
sich lediglich in den angehängten Fettsäureresten. Die am häufigsten vorkommenden
Capsaicinoide sind Capsaicin (C), Dihydrocapsaicin (DC) und Nordihydrocapsaicin
(NC). Sie machen zusammen mehr als 95% der in den Schoten enthaltenen
Capsaicinoide aus. In Abbildung 5 (s. Anhang S.14) sind die Strukturformeln der
drei häufigsten Capsaicinoide dargestellt. [1][2]
Im weiteren Verlauf des Berichts werden die Derivate mit ihren oben genannten
Abkürzungen bezeichnet.
Der Capsaicinoidgehalt sowie die Zusammensetzung variieren sehr stark bei
verschiedenen Chilisorten. Dies ist einer der Gründe, weshalb Schoten
unterschiedlicher Sorten sensorisch unterschiedlich wahrgenommen werden. Dabei
können Geschmacksnoten, Schärfedauer und Lokalität der Wirkung variieren. [2]
3
3. Experimenteller Teil
3.1 Auswahl der Chilisorten
Um ein möglichst breites Spektrum an unterschiedlichen Capsaicinoid-
Zusammensetzungen zu bekommen, werden die Chiliproben so ausgewählt, dass von
jeder gängigen Art mindestens eine Sorte vorliegt. Von der jeweiligen Art wird die
am weitesten verbreitete Sorte ausgewählt. Des Weiteren werden bei zwei Arten –
Habanero und Jalapeno – je zwei verschiedene Sorten untersucht, um der These über
die gleiche Zusammensetzung bei gleicher Art nachzugehen. Außerdem wird eine
weitere Sorte – Aji Picante – mit HPLC untersucht, die nicht eindeutig einer Art
zugeordnet werden konnte. Damit wird angestrebt eine Zugehörigkeit zu einer Art
festzustellen oder einzugrenzen. Im Anhang werden die ausgewählten Sorten mit der
zugehörigen Art aufgelistet (s. Anhang S.13, Liste 1).
4
Im Verlauf der Projektarbeit werden die Capsaicinoid-Gemische mittels Soxhlet-
Extraktion gewonnen. Der Aufbau der Soxhlet-Apparatur sowie das Grundprinzip
sind in Abbildung 1 dargestellt.
Verwendete Geräte: 100 mL-Mehrhalskolben
100 mL Soxhlet-Aufsatz mit Hülse
Intensivkühler
Reduzierstück mit Septum
Spritze mit 20 cm-Kanüle (0,2 mm Durchmesser),
Ölbad
Julabo-Temperaturregler
Chemikalien: je 150 mL Ethanol, absolut
Um die maximal notwendige Extraktionszeit zu ermitteln, werden die
Veränderungen der Zusammensetzung des Extrakts im Verlauf der Extraktion
untersucht. Von besonderem Interesse ist die Frage, nach welcher Dauer ein Extrakt
mit konstanter Zusammensetzung der Capsaicinoide vorliegt. Dazu werden Proben
während des Extraktionsverlaufs für eine HPLC-Analyse entnommen. Die
Probenahme erfolgt immer nach einem Überlauf des Extraktes im Soxhlet-Aufsatz –
anfangs nach jedem Überlauf, später in größeren Abständen (s. Anhang S.16, Tabelle
2). Um eine fortwährende Extraktion zu gewährleisten, werden die Proben mittels
einer Kanüle durch das Septum gezogen. Die Chiliprobe wird zwei Stunden unter
Rückfluss extrahiert.
3.4 Extraktion
Verwendete Geräte: 250 mL-Rundkolben
100 mL Soxhlet-Aufsatz mit Hülse
Intensivkühler
Heizpilz
ggf. Rotationsverdampfer
Chemikalien: je 200 mL Ethanol, absolut
Die verschiedenen Chiliproben werden mittels einer Soxhlet-Apparatur extrahiert.
Dazu werden jeweils ca. 40 g der Probe in die Extraktionshülse eingewogen und in
die Apparatur gegeben. Es wird 1,5 Stunden nach dem Beginn des Siedevorgangs
mit 200 mL Ethanol unter Rückfluss extrahiert. Anschließend werden die Extrakte
durch einen Papierfilter filtriert und in Glasflaschen aufbewahrt.
Erste Analysen der Extrakte führen zu der Erkenntnis, dass einige Proben zu gering
konzentriert sind, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Die betroffenen Proben werden
deshalb eingedampft. Dazu werden die Proben in einen Rotationsverdampfer
gegeben und bei 150 mbar und 60°C etwa 20 min eingeengt. Anschließend werden
die Extrakte durch einen Papierfilter filtriert.
3.5 Reinigungsversuche
Verwendete Geräte: 500 mL-Scheidetrichter
100 mL-Erlenmeyerkolben
Ceran-Kochfeld
Chemikalien: je 200 mL Ethanol, absolut
50 mL n-Hexan
Aktivkohle
5
Um die Extrakte von eventuellen Verunreinigungen zu befreien, werden
verschiedene Reinigungsversuche durchgeführt.
a) Ausschütteln des Extraktes mit n-Hexan
Laut Literatur sind Capsaicinoide in n-Hexan schlecht löslich [5]. Aus diesem Grund
wird versucht, das ethanolische Extrakt mit Hexan auszuschütteln und so die
Verunreinigungen zu entfernen. Zu 200 mL Extrakt werden 50 mL Hexan gegeben.
Anschließend sollte das Gemisch im Scheidetrichter geschüttelt und die Hexanphase
abgetrennt werden.
b) Adsorption der Verunreinigungen mit A-Kohle
Zu 50 mL Extrakt werden 0,5 g A-Kohle gegeben. Das Gemisch wird aufgekocht
und nach Abkühlen durch einen Papierfilter filtriert. Das Gemisch wird vor und nach
der Aktivkohle-Reinigung mittels HPLC analysiert.
3.7 HPLC-Analyse
Die Extrakte werden zunächst unverdünnt analysiert. Wenn die Extrakte zu gering
konzentriert sind, müssen sie – wie im Kapitel 3.4 bereits beschrieben – eingeengt
werden. Die eingeengten und filtrierten Proben werden ebenfalls unverdünnt
gemessen. Falls die Notwendigkeit besteht, die Proben zu verdünnen, sollte abs.
Ethanol verwendet werden. Für eine Analyse werden ca. 2 mL des Extrakts durch
einen Spritzenvorfilter (0,4 µm) in ein Vial überführt und mit folgender Methode
mittels HPLC bestimmt.
Säule: Phenylharz, 250 mm x 4 mm, 5 µm
Eluenten: A: Milliporwasser, angesäuert (0,1% H3PO4)
B: Acetonitril
Eluentenverhältnis: 63% Eluent A, 37% Eluent B
Temperatur: 40°C
Flussgeschw.: 1 mL/min
Detektor: UV/VIS- Diodenarray
Wellenlänge: 280 nm
Injektionsvolumen: 20 µL
Die Intensitäten der drei Substanzen bei der Wellenlänge 280 nm sind identisch und
proportional zu der Konzentration der Probe. Die UV-Aktivität wird vor allem durch
den Vanillylrest verursacht, der Einfluss des enthaltenen Fettsäurerests kann
vernachlässigt werden [1]. Die Capsaicinoide haben bei 280 nm ein
Absorptionsmaximum. In Abbildung 6 (s. Anhang S.14) ist ein 3D-Spektrum
dargestellt, das einen Ausschnitt aus dem Chromatogramm der drei Komponenten
zeigt.
6
Anfangs werden die Eluenten isokratisch gefahren. Um die Analysendauer zu
verkürzen, wird die Methode so optimiert, dass die organischen Komponenten
schneller von der Säule gespült werden.
100
Es ergibt sich folgender Gradient: 90
Eluent B [%]
80
0 min 63% Eluent A, 37% Eluent B 70
20 min 63% Eluent A, 37% Eluent B 60
21 min 0% Eluent A, 100% Eluent B 50
23 min 0% Eluent A, 100% Eluent B 40
Um die Peaks der drei Capsaicinoide zu identifizieren, wird ein Standard, der die
Komponenten C, DC und NC enthält, analysiert und die Retentionszeiten bestimmt.
In Abbildung 7 (s. Anhang S.14) ist ein Beispiel für ein Chromatogramm dargestellt.
Die Zuordnung der Peaks kann einerseits anhand der Größe erfolgen, denn die
Zusammensetzung des Standards ist bekannt. Er enthält ca. 4% NC, sodass der
kleinste Peak dieser Komponente zugehörig ist, 62% C mit dem größten Peak und
34% DC mit dem dritten Peak. Zum anderen kann die Reihenfolge der Komponenten
aus der Literatur entnommen werden. In der Abbildung 2 ist ein Ausschnitt aus dem
Patent [5] zu sehen, worin die Reihenfolge der Capsaicin-Derivate aufgeklärt wird.
Abbildung 2: Ausschnitt aus U.S. Patent No. 5.955.631; mit (1) Capsaicin,
(2) Nordihydrocapsaicin und (4) Dihydrocapsaicin sowie weiteren Derivaten
1
Gustatorisch: den Geschmackssinn betreffend
7
hauptsächlich empfunden wird (z.B. Zunge, Hals). Die Ausprägung soll auf einer
Skala von 1 „schwach ausgeprägt“ bis 5 „stark ausgeprägt“ eingeordnet werden.
8
In Diagramm 4 (s. Anhang S.17) sieht man, wie sich das Extrakt hinsichtlich der
Zusammensetzung der Capsaicinoide verändert. Zunächst ändern sich die Anteile
dahingehend, dass sich die Komponente NCII anreichert. Nach dem 3. Überlauf ist
die Zusammensetzung des Extraktes jedoch stabil und ändert sich nicht wesentlich.
4.3 Reinigungsversuche
a) Ausschütteln des Extraktes mit n-Hexan
Ethanol und n-Hexan mischen sich vollständig, somit kann n-Hexan nicht zum
Entfernen von Verunreinigungen verwendet werden. Laut Literatur (s. Anhang S.18,
Abbildung 10) ist Ethanol mit allen gängigen Lösemitteln vollständig mischbar.
Auch Mischbarkeitsversuche mit Methanol als Alternative zu Ethanol und
Kohlenwasserstoffen wie n-Hexan, n-Heptan, n-Octan und Cyclohexan brachten
keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Alle getesteten Kohlenwasserstoffe haben mit
Methanol zwar zwei Phasen ausgebildet, waren aber zumindest teilweise mischbar.
Da der Einfluss einer solchen Reinigung auf die Zusammensetzung des
Capsaicinoid-Gemischs unklar ist, wird von dieser abgesehen.
b) Adsorption der Verunreinigungen mit A-Kohle
Das Extrakt war nach der A-Kohle Behandlung klar und farblos. Die HPLC Analyse
zeigt eine gleichmäßige Abnahme aller Komponenten um ca. 50%. Auch die
Verunreinigungen nehmen im gleichen Verhältnis ab, sind aber noch vorhanden.
Da die Verunreinigungen die HPLC-Analyse nicht stören (siehe Abschnitt 4.5), wird
bei weiteren Extraktionen keine Reinigung durchgeführt.
9
der entsprechenden Tabelle rot gekennzeichnet. Die betroffenen Proben werden, wie
im experimentellen Teil beschrieben, eingeengt und nochmals analysiert. Die neuen
Ergebnisse sind in der Tabelle blau gekennzeichnet.
100%
Stoffmengenanteil [%]
80%
60%
DC
C
40%
NC
20%
0%
to
p
ot
e
n
ot
b
sc
ro
nt
co
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,r
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ro
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Pi
Ta
ro
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pe
ne
ji
ba
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la
A
Le
ba
Ja
la
Ha
Ha
Ja
10
werden die Proben überwiegend als beißend empfunden. Allerdings betragen die
Anteile der Schärfeeigenschaften etwa ein Drittel. Wie man im Diagramm 2 sieht,
lässt sich kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Proben feststellen.
Weitere Details zu der Auswertung der Schärfeeigenschaften können aus Tabelle 7
(s. Anhang S.21) entnommen werden.
100%
90%
80%
70%
Anteile [%]
60%
langanhaltend
50%
kratzend
40%
beißend
30%
20%
10%
0%
o
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m
ab
Le
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ab
H
Ja
11
4.7 Zusammenhang zwischen HPLC-Analyse und gustatorischer
Untersuchung
Bei dem Vergleich der HPLC-Ergebnisse und der Verköstigung wird eine allgemeine
Tendenz festgestellt. Je größer die gesamte Peakfläche des Capsaicinoid-Gemischs
war, desto höher werden die Chiliproben bewertet. Das bedeutet lediglich, dass die
geschmackliche Einschätzung der Schärfe mit der analytischen grob übereinstimmt.
Eine Schlussfolgerung von einem linearen Zusammenhang kann gezogen werden,
wenn das Bestimmtheitsmaß nahe 1 ist. Dies ist hier allerdings nicht angemessen, da
es in diesem Fall nur etwa 0,8 beträgt. Der Zusammenhang zwischen Peakfläche und
der Gesamtbewertung ist in Diagramm 6 (s. Anhang S.22) dargestellt.
Leider konnten aus dem Vergleich der Verköstigung und der HPLC-Ergebnisse
keine weiteren Schlüsse gezogen werden. Die Vermutung, dass jedem Capsaicin-
Derivat eine andere Schärfewirkung zugeordnet werden kann, konnte im Rahmen
dieser Projektarbeit nicht bestätigt werden.
12
6. Literaturverzeichnis
[1] Constanze Hippler - Capsaicinoide in Capsicum-Früchten definierter
Herkunft und ihre Stabilität bei Verarbeitung und Lagerung, Bergische
Universität Wuppertal, 2004
[2] Petra Kirschbaum – Capsaicinoide in frischem und verarbeitetem
Gewürzpaprika, Bergische Universität Wuppertal, 2002
[3] Harald Zoschke - Das Chili Pepper Buch - Anbau, Rezepte, Wissenswertes,
Suncoast Peppers GmbH, Kressbronn, Neuausgabe 2007
[4] Hans-Jörg Behrendt - Vergleichende funktionale Untersuchungen des Hitze-
Capsaicin-Rezeptors (TRPV1) und des Kälte-Menthol-Rezeptors (TRPM8) in
rekombinanten und nativen Zellsystemen (verwendete Spezies: Mensch, Ratte
und Maus), Ruhr-Universität Bochum, 2004
[5] Hisashi Segi, Shuji Yamada, Satoshi Kato, Shoji Murasugi – Method for
industrial purification of Capsaicin, United States Patent No. 5.955.631, Gifu-
ken, Japan 1999
7. Anhang
Solanaceae
Familie
Capsicum Gattung
13
Abbildung 5: Strukturformeln der drei häufigsten Capsaicinoide
14
Abbildung 8: Ausschnitt aus dem Bewertungsbogen
15
Abbildung 9: Chromatogramm einer unbekannten Chili-Probe mit vier Peaks von Capsaicin-
Derivaten
16
Anreicherung des Capsaicinoidgemisches im Extrakt
1800
1600
1400
Gesamtpeakfläche
1200
1000
800
600
400
200
0
1. 2. 3. 4. 5. 8. 11.
Überlauf Überlauf Überlauf Überlauf Überlauf Überlauf Überlauf
100%
90%
80%
Stoffmengenanteil [%]
70%
60% DC
50% C
40% NC II
30% NC
20%
10%
0%
uf
uf
uf
uf
uf
uf
uf
la
la
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la
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la
rl a
r
r
be
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be
be
be
be
Ü
.Ü
1.
2.
3.
4.
5.
8.
11
17
Abbildung 10: Mischbarkeit einiger wichtiger Lösemittel
18
Tabelle 3: Daten zur Wiederholbarkeit der HPLC-Methode am Beispiel des Extraktes der
grünen Jalapeno
Substanz
NC % C% DC %
1.Lauf 14.11.2009 10,5 54,9 34,6
1.Lauf 28.11.2009 9,9 54,3 35,8
2.Lauf 28.11.2009 10,6 54,0 35,4
1.Lauf 09.12.2009 9,5 52,6 34,0
2.Lauf 09.12.2009 9,7 52,7 35,5
3.Lauf 09.12.2009 11,4 52,9 33,7
Mittelwert 10,2 53,6 34,8
Standardabweichung 0,7 1,0 0,9
rel. Stabw. [%] 7,0 1,8 2,5
60,0
53,6
50,0
Stoffmengenanteil in %
40,0
34,8
NC
30,0 C
DC
20,0
10,2
10,0
0,0
19
Tabelle 4: HPLC Daten der extrahierten Chiliproben
20
Tabelle 5: Capsaicinoidverhältnis der Proben
NC % C% DC %
Jalapeno, rot 12,9 55,5 31,5
Jalapeno, grün 10,2 53,6 34,8
Rocoto 23,1 33,6 43,3
Habanero, gelb 1,3 86,3 12,3
Habanero, rot 0,8 85,4 13,8
Tabasco 4,5 68,8 26,7
Lemon Drop 5,4 41,4 53,3
Aji Picante 1,2 76,7 22,1
Tabelle 6: Auswertung der Verköstigung: Lokalität, Anzahl der Kreuze der einzelnen Regionen
bei verschiedenen Chili-Proben
Jalapeno Lemon Habanero Habanero
Rocoto Tabasco
grün Drop rot gelb
Mundraum 2 0 2 7 1 2
Lokalität
Zunge 13 14 12 12 10 7
Hals 4 8 5 12 3 9
Lippen 0 1 0 1 4 0
beißend 30 39 38 54 27 36
kratzend 26 33 36 42 26 30
langanhaltend 27 37 35 56 27 30
beißend 36,1% 35,8% 34,9% 35,5% 33,8% 37,5%
kratzend 31,3% 30,3% 33,0% 27,6% 32,5% 31,3%
langanhaltend 32,5% 33,9% 32,1% 36,8% 33,8% 31,3%
21
Zusammenhang zwischen Peakfläche und Gesamtnote
12,00
R2 = 0,7987
Summe der Durchschnittsnoten
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00
Peakfläche
Diagramm 6: Zusammenhang zwischen der gesamten Peakfläche und der Gesamtnote mit
Bestimmtheitsmaß R2
22