Desarrollo y Regulacin de Medicamentos Biotecnolgicos

los MB presentan diferencias sustanciales respecto a los Frmacos Tradicionales o Clsicos

La elaboracin y administracin de los MB est sujeta a normativas y exigencias especficas por

parte de las agencias reguladoras para garantizar su eficacia y seguridad2,3 lo que hace que
comparativamente resulten ms costosos que los frmacos tradicionales. los frmacos
biotecnolgicos suponen alrededor del 20% del total de medicamentos que alcanzan el mercado y
el 50% de los nuevos frmacos en desarrollo.

Caractersticas de los Medicamentos Biotecnolgicos

Para la obtencin de frmacos biolgicos se suele emplear la tecnologa del ADN recombinante e
hibridomas, generalmente incorporando el material gentico a organismos vivos (bacterias,
hongos, etc.), lo que permitir que estos organismos sinteticen un producto teraputico concreto.

Desde el punto de vista bioqumico estos frmacos son esencialmente cadenas polipeptdicas,
protenas o glucoprotenas, y esto explica que durante todo el proceso de su produccin sea
preciso un control riguroso.

Regulacin de los Frmacos Biotecnolgicos

la proteccin de la salud pblica y la libre circulacin de los medicamentos9 Debido a las

caractersticas de los frmacos biolgicos, al empleo cada vez ms frecuente de la biologa
molecular y la tecnologa de fabricacin, las agencias reguladoras imponen nuevas exigencias para
la aprobacin de un frmaco biolgico.

desarrollo de productos biotecnolgicos o biolgicos:

Existen tres reas que deben ser cuidadosamente consideradas: estabilidad, compatibilidad y
actividad biolgica en estudios de preformulacin o de formulacin.

Caracterizacin

Proceso de fabricacin:

Compatibilidad

Estabilidad de la sustancia activa:

2. La documentacin deber recoger la siguiente informacin

En resumen, los estudios de seguridad preclnica debern incluir: farmacocintica y toxicocintica,

vas metablicas, estudios con dosis nica y repetida, estudios de inmunotoxicidad, reproduccin,
fertilidad y desarrollo, genotoxicidad, carcinogenicidad y estudios de tolerancia local.

Los estudios de comparabilidad dependern de los siguientes factores: la complejidad de la

estructura molecular, el tipo de cambio o cambios introducidos en el proceso de fabricacin y el
impacto sobre la calidad del producto, su seguridad y eficacia.

La determinacin de la comparabilidad est basada en una combinacin de test analticos, ensayos

biolgicos y, en algunos casos, datos preclnicos y clnicos.

La determinacin de la comparabilidad est basada en una combinacin de test analticos, ensayos

biolgicos y, en algunos casos, datos preclnicos y clnicos. La realizacin de estos ltimos estudios
se reserva a los casos en los que la relacin entre la calidad del producto y la seguridad no est
bien establecida y se han observado cambios en el producto tras la variacin del proceso de
fabricacin. Estos cambios pueden estar relacionados con la calidad de producto final, as como la

A continuacin se detallan los fundamentos y caractersticas de los estudios preclnicos y Clnicos

BIOTECNOLOGA MOLECULAR es una excitante disciplina cientfica que se basa en la capacidad de

los investigadores para transferir unidades especficas de informacin gentica de un organismo a
otro. Este transporte de un gen o genes se basa en las tcnicas de ingeniera gentica (tecnologa
de ADN recombinante). El objetivo de la tecnologa de ADN recombinante es a menudo crear un
producto til o un proceso comercial.
EL DESARROLLO DE BIOTECNOLOGIA MOLECULAR

La emergencia de la biotecnologa molecular la biotecnologa se ocupa de la produccin de

productos comerciales generados por la accin metablica de los microorganismos. Ms
formalmente, la biotecnologa puede definirse como "la aplicacin de principios cientficos y de
ingeniera al procesamiento de Agentes para proveer bienes y servicios ".

la biotecnologa se ha asociado de manera clara e irrevocable al estudio de la "produccin

industrial de bienes y servicios mediante procesos que utilizan organismos, sistemas y procesos
biolgicos", y se basa firmemente en la experiencia en microbiologa, bioqumica y Ingeniera
Qumica. Un proceso de biotecnologa industrial que utiliza microorganismos para producir un
producto comercial suele tener tres etapas clave:

1. Procesamiento aguas arriba: preparacin del microorganismo y las materias primas necesarias
para que el microorganismo crezca y produzca El producto deseado.

2. Fermentacin y transformacin: crecimiento (fermentacin) del microorganismo diana en un

gran biorreactor (normalmente> 100 litros) con la consecuente produccin (biotransformacin) de
un compuesto deseado, que puede ser, por ejemplo, un antibitico, un aminocido, O una
protena.

3. Procesamiento aguas abajo: purificacin del compuesto deseado a partir del medio celular o de
la masa celular.

A pesar de estas limitaciones, a finales de los aos setenta, se haban perfeccionado los procesos
efectivos para la produccin en masa de una amplia gama de productos comerciales. Hoy en da,
hemos adquirido un conocimiento suficiente de la bioqumica, la gentica y la biologa molecular
de los microorganismos para acelerar el desarrollo de productos y procesos biolgicos tiles y
mejorados y para crear nuevos productos que no se producira de otra manera. Distintos de la
biotecnologa tradicional, los mtodos modernos requieren el conocimiento y la manipulacin de
genes, las unidades funcionales de herencia y la disciplina que se ocupa de la manipulacin de
genes con el fin de producir bienes y servicios tiles utilizando organismos vivos se conoce como
biotecnologa molecular . El desarrollo fundamental que permiti esta tecnologa fue el
establecimiento de tcnicas para aislar genes y transferirlos de un organismo a otro. Esta
tecnologa se conoce como tecnologa de cido desoxirribonucleico recombinante (DNA), y
comenz como una conversacin entre dos cientficos que trabajan en diferentes campos y que se
reunieron en una conferencia cientfica en 1973. Stanley Cohen haba estado desarrollando en su
laboratorio en la Universidad de Stanford en California Mtodos para transferir plsmidos,
pequeas molculas de ADN circulares, en clulas bacterianas. Mientras tanto, Herbert Boyer de la
Universidad de California en San Francisco estaba trabajando con enzimas que cortan el ADN en
secuencias de nucletidos especficas. Durante el almuerzo en una reunin cientfica, razonaron.
que la enzima de Boyer podra ser utilizada para empalmar un segmento especfico de ADN en un
plsmido y luego el plsmido recombinante podra ser introducido en una bacteria husped
usando el mtodo de Cohen.

El desarrollo fundamental que permiti esta tecnologa fue el establecimiento de tcnicas para
aislar genes y transferirlos de un organismo a otro. Esta tecnologa se conoce como tecnologa de
cido desoxirribonucleico recombinante (DNA), y comenz como una conversacin entre dos
cientficos que trabajan en diferentes campos y que se reunieron en una conferencia cientfica en
1973. Stanley Cohen haba estado desarrollando en su laboratorio en la Universidad de Stanford
en California Mtodos para transferir plsmidos, pequeas molculas de ADN circulares, en clulas
bacterianas. Mientras tanto, Herbert Boyer de la Universidad de California en San Francisco estaba
trabajando con enzimas que cortan el ADN en secuencias de nucletidos especficas. Durante el
almuerzo en una reunin cientfica, razonaron que la enzima de Boyer podra ser utilizada para
empalmar un segmento especfico de ADN en un plsmido y luego el plsmido recombinante
podra ser introducido en una bacteria husped usando el mtodo de Cohen.

Tecnologa de DNA recombinante

biotecnologa molecular se basa en el conocimiento de un conjunto diverso de disciplinas

cientficas fundamentales para crear productos comerciales que son tiles en una amplia gama de
aplicaciones

comercializaciond e la biotecnologa molecular

Papel de la tecnologa del ADN recombinante para mejorar la vida

la ingeniera gentica utiliza herramientas y enfoques modernos, como la clonacin molecular y la

transformacin.

la ingeniera gentica utiliza herramientas y enfoques modernos, como la clonacin molecular y la

transformacin. Productos confiables. Por ejemplo, en comparacin con la cra convencional que
transfiere un gran nmero de genes especficos y no especficos a la

Receptor, la ingeniera gentica slo transfiere un pequeo bloque de genes deseados a la meta a
travs de diversos enfoques, tales como Biolistic y Agrobacterium mediada por la transformacin

la ingeniera gentica utiliza herramientas y enfoques modernos, como la clonacin molecular y la

transformacin. Productos confiables. Por ejemplo, en comparacin con la cra convencional que
transfiere un gran nmero de genes especficos y no especficos a la

Receptor, la ingeniera gentica slo transfiere un pequeo bloque de genes deseados a la meta a
travs de diversos enfoques, tales como Biolistic y Agrobacterium mediada por la transformacin
[1]. La alteracin en los genomas de las plantas se lleva a cabo ya sea por recombinacin
homloga genes dependientes de orientacin o por nucleasa mediada por el sitio especfico de
modificacin del genoma. Recombinase mediada sitio especfico de la integracin del genoma y
oligonucletido mutagnesis dirigida tambin se puede utilizar [2]. La tecnologa del ADN
recombinante est desempeando un papel vital en la mejora de las condiciones de salud
mediante el desarrollo de nuevas vacunas y productos farmacuticos. Las estrategias de
tratamiento tambin se mejoran mediante el desarrollo de kits de diagnstico, dispositivos de
monitoreo y nuevos enfoques teraputicos. La sntesis de insulina humana sinttica y la
eritropoyetina por las bacterias modificadas genticamente [3] y la produccin de nuevos tipos de
ratones mutantes experimentales con fines de investigacin son uno de los principales ejemplos
de ingeniera gentica en salud. Asimismo, se han empleado estrategias de ingeniera gentica
para abordar las cuestiones ambientales como la conversin de desechos en biocombustibles y
bioetanol [4 - 7], la limpieza de derrames de petrleo, el carbono y otros desechos txicos y la
deteccin de arsnico y otros contaminantes en el agua potable. Los microbios genticamente
modificados tambin se utilizan eficazmente en biomining y bioremediacin.

El advenimiento de la tecnologa del ADN recombinante revolucion el desarrollo de la biologa y

dio lugar a una serie de cambios dramticos. Ofreci nuevas oportunidades de innovacin para
producir una gama de productos teraputicos con efecto inmediato en la gentica mdica y la
biomedicina modificando microorganismos, animales y plantas para producir sustancias tiles
desde el punto de vista mdico [8, 9]. La mayora de los productos farmacuticos biotecnolgicos
son de naturaleza recombinante, que desempea un papel clave contra las enfermedades letales
humanas. Los productos farmacuticos sintetizados a travs de la tecnologa del ADN
recombinante, cambiaron completamente la vida humana de tal manera que la Administracin de
Alimentos y Frmacos de Estados Unidos (FDA) aprob ms frmacos recombinantes en 1997 que
en los aos anteriores combinados, incluyendo anemia, SIDA, cnceres Sarcoma de Kaposi,
leucemia y cncer colorrectal, renal y ovrico), trastornos hereditarios (fibrosis qustica,
hipercolesterolemia familiar, enfermedad de Gaucher, hemofilia A, enfermedad de
inmunodeficiencia combinada severa y sndrome de Turnor), lceras de pie diabtico, difteria,
verrugas genitales, hepatitis B, hepatitis C, deficiencia de hormona de crecimiento humana y
esclerosis mltiple. Teniendo en cuenta que las plantas desarrollan multigene transferencia, la
integracin de sitios especficos y regulados la expresin gnica son cruciales enfoques avanzados
[10]. La regulacin transcripcional de los genes endgenos, su eficacia en las nuevas localizaciones
y el control preciso de la expresin del transgn son desafos importantes en la biotecnologa
vegetal que necesitan desarrollos adicionales para su uso exitoso. La vida humana est muy
amenazada por diversos factores, como las limitaciones alimentarias que conducen a la
desnutricin, los diferentes tipos de enfermedades letales, los problemas ambientales causados
por la dramtica industrializacin y urbanizacin y muchos otros. La ingeniera gentica ha
sustituido a las estrategias convencionales y tiene el mayor potencial para superar tales desafos.
La revisin actual resumi los principales retos encontrados por los seres humanos y aborda el
papel de la tecnologa del ADN recombinante para superar los problemas antes mencionados. En
lnea con esto, hemos detallado las limitaciones de la ingeniera gentica y las posibles direcciones
futuras para los investigadores para superar tales limitaciones a travs de la modificacin en las
actuales estrategias de ingeniera gentica.

Tecnologia del dna recombinante

Material fuera de un organismo para obtener caractersticas mejoradas y deseadas en organismos

vivos o como sus productos. Esta tecnologa implica la insercin de fragmentos de ADN de una
variedad de fuentes, con una secuencia de genes deseable a travs de vector apropiado [12]. La
manipulacin en el genoma del organismo se lleva a cabo ya sea a travs de la introduccin de uno
o varios nuevos genes y elementos reguladores o por disminuir o bloquear la expresin de genes
endgenos a travs de la recombinacin de genes y elementos [13]. La escisin enzimtica se
aplica para obtener diferentes fragmentos de ADN usando endo-nucleasas de restriccin para
sitios de ADN de secuencia diana especficos seguidos por actividad de ADN ligasa para unir los
fragmentos para fijar el gen deseado en el vector. El vector se introduce a continuacin en un
organismo husped, que se cultiva para producir copias mltiples del fragmento de ADN
incorporado en cultivo, y finalmente se seleccionan y cosechan clones que contienen un
fragmento de ADN relevante [11]. Las primeras molculas de ADN recombinante (ADNr) fueron
generadas en 1973 por Paul Berg, Herbert Boyer, Annie Chang y Stanley Cohen de la Universidad
de Stanford y la Universidad de California en San Francisco. En 1975, durante la "Conferencia
Asilomar" regulacin y uso seguro de la tecnologa rDNA se discuti. Paradjicamente, a la opinin
de los cientficos en el momento de Asilomar, los mtodos de ADN recombinante para fomentar la
agricultura y los desarrollos de drogas tard ms de lo previsto debido a las dificultades
inesperadas y las barreras para lograr los resultados satisfactorios. Sin embargo, desde mediados
de los aos ochenta, el nmero de productos como hormonas, vacunas, agentes teraputicos y
herramientas de diagnstico se ha desarrollado continuamente para mejorar la salud [13]. Un
enfoque rpido es ofrecido por la tecnologa de ADN recombinante para examinar la expresin
gentica de las mutaciones que se introdujeron en los genes eucariotas a travs de la insercin de
genes de insulina clonada dentro de un fragmento de virus simio [3]. De forma similar, el
crecimiento tumoral fue inhibido por el vector adenoviral que codifica la forma secretora humana
endoscita a travs de efectos antiangiognicos. Antiangiogenic efecto puede ser mejorado por
dl1520 a travs de rescatar la replicacin de Ad-Endo [14]. Se ha utilizado la disrupcin de genes
dirigidos para producir derivados antitumorales en otros huspedes que eran estructuralmente
similares para las vas de produccin [15]. Adems, las protenas teraputicas de accin
prolongada se han desarrollado a travs de tecnologas de ADN recombinante; Por ejemplo,
secuencias

Que contiene el sitio de glicosilacin adicional son uno de los enfoques ms seguidos. Se ha
desarrollado un nuevo gen quimrico a travs de esta tcnica que contiene las secuencias de
codificacin de la subunidad de FSH y el pptido C-terminal de las secuencias codificantes de la
subunidad de hCG [16]. Los investigadores tambin han desarrollado vectores y vectores
combinados para la terapia gnica y enfoques de modificacin gentica. En la actualidad, los
vectores virales han recibido inmensa consideracin en entornos clnicos, algunos de los cuales
tambin se han comercializado. En principio, los virus se modifican para ser seguros para
propsitos clnicos. Tienen varias aplicaciones incluyendo el tratamiento de enfermedades graves,
incluyendo el cncer ya sea a travs de terapia in vivo o terapia gnica (ex vivo), la vacunacin y la
transduccin de protenas [17]. La produccin de grado clnico viral vectores mejora ha sido
posible debido a las tecnologas avanzadas de fabricacin [18]. En la actualidad, debido a los
graves efectos adversos, los vectores retrovirales estn perdiendo su importancia, aunque las
entidades virales transfieren genes rpidamente y correctamente en varias especies. El sistema de
administracin de genes no virales ms simple usa "desnudo"

El ADN, cuando se inyecta directamente en ciertos tejidos, en particular los msculos, produce
niveles significativos de expresin gnica con menos efectos secundarios [19]. Ms recientemente,
se ha diseado un vector P1 para introducir el ADN recombinante en E. coli a travs de
procedimientos de electroporacin. Este nuevo sistema de clonacin se utiliza para establecer
15.000 libras de clones inicialmente de tamao medio de inserto de 130-150 kb. PACcloning
sistema se considera til para el anlisis del genoma complejo y en la cartografa [20]. La
construccin de vectores de bajo nmero de copias, por ejemplo, pWSK29, pWKS30, pWSK129 y
pWKS130, se llev a cabo usando PCR y tecnologa de ADN recombinante. Estos vectores tambin
pueden usarse para generar supresiones unidireccionales con exonucleasa, anlisis de
complementacin, secuenciacin de ADN y Run-off transcripcin [21]. Una amplia gama de
aplicaciones de la tecnologa del ADN recombinante se ha resumido en la Figura 1.
Progreso actual de la investigacin

La tecnologa de ADN recombinante es un campo de rpido crecimiento y los investigadores de

todo el mundo estn desarrollando nuevos enfoques, dispositivos y productos de ingeniera para
su aplicacin en diferentes sectores, incluyendo la agricultura, la salud y el medio ambiente. Por
ejemplo, Lispro (Humalog), en comparacin con la insulina humana normal, es una insulina
recombinante eficaz y de accin rpida [3]. Del mismo modo, la epoetina alfa es una novela y bien
reconocida protena recombinante que puede ser utilizado eficazmente en el curado de la anemia
[22]. La hGH recombinante se encontr con una gran mejora en el tratamiento de los nios que
carecen de la capacidad para producir HGH en una cantidad requerida. La aprobacin de las
pruebas clnicas de la FDA en diciembre de 1997 para una versin recombinante del factor
inhibidor 1 de los progenitores mieloides de las citoquinas (MPIF-1) fue un logro para dar
reconocimiento a esta tecnologa. Con su ayuda los efectos secundarios del frmaco
anticancergeno se pueden mitigar mientras que tiene la capacidad de imitar la divisin de clulas
inmunolgicamente importantes [23, 24]. La siguiente seccin resume los desarrollos ms
recientes de la tecnologa del ADN recombinante. Clustered regularmente interpaced palindromic
repeticiones cortas (CRISPR), un desarrollo ms reciente de la tecnologa de ADN recombinante, ha
trado soluciones a varios problemas en diferentes especies. Este sistema puede utilizarse para
atacar la destruccin de genes en clulas humanas. La activacin, supresin, adicin y delecin de
genes en clulas humanas, ratones, ratas, pez cebra, bacterias, moscas de la fruta, levaduras,
nemtodos y cultivos demostr que la tcnica era prometedora. Modelos de ratn se puede
gestionar para el estudio de las enfermedades humanas con CRISPR, donde el estudio de genes
individuales se hace mucho ms rpido y los estudios de interacciones de genes se hacen fciles,
cambiando mltiples genes en las clulas [25]. El CRISPR del genoma de H. hispanica es capaz de
adaptarse a los virus no lticos de manera muy eficiente. El opern Cas asociado codifica las
nucleasas Cas3 que interfieren y otras protenas Cas. La ingeniera de una cepa se requiere con
priming CRISPR para la produccin de crRNAs priming y la aceptacin de los periodistas. CRISPR-
cas sistema tiene que integrar nuevos espaciadores en su lugar para la inmunidad adaptativa
generacin [26]. Reconocimiento de foreignDNA / RNA y su clivaje es un proceso controlado en
secuencia de manera especfica. La informacin relacionada con el material gentico del intruso es
almacenada por el sistema husped con la ayuda de la incorporacin foto-espaciador en el sistema
CRISPR [27]. Cas9t (herramienta de geneediting) representa endonucleasas de ADN que utilizan
molculas de ARN para reconocer objetivo especfico [28]. Clase 2 CRISPRCas sistema con una sola
protena efectores pueden ser empleados para genomeediting procesos.DeadCas9 es importante
para el reclutamiento de la enzima modificadora de histonas, la represin transcripcional, la
localizacin de etiquetas de protenas fluorescentes, y la activacin transcripcional [29]. El
direccionamiento de los genes implicados en el proceso de aislamiento de los knockouts de genes
homocigticos se lleva a cabo mediante mutaciones inducidas por CRISPR. De esta manera, los
genes esenciales se pueden analizar que a su vez puede ser utilizado para "potenciales
antifngicos objetivos" de exploracin [30]. Natural CRISPR-cas inmunidad explotacin se ha
utilizado para la generacin de cepas que son resistentes a diferentes tipos de virus disruptivos
[31].

CRISPR-Cas, el nico sistema inmune adaptativo en procariotas, contiene locus genmico conocido
como CRISPR que tiene elementos repetitivos cortos y espaciadores (secuencias nicas). CRISPR
matriz est precedida por AT-ricos lder secuencia y flanqueado por cas genes que codifican Cas
protenas [32, 33]. En Escherichia coli cas1 y cas2 las catalasas promueven nuevos espaciadores a
travs de la formacin de complejos. El motivo adyacente foto-espaciador (PAM) se requiere para
la interferencia y la adquisicin debido a que la seleccin de secuencia objetivo no es aleatoria. La
memorizacin de la secuencia del invasor comienza despus de la transcripcin de la matriz
CRISPR en el crRNA precursor largo. Durante las etapas finales del proceso de inmunidad, el
objetivo se degrada por interferencia con cidos nucleicos invadidos. El reconocimiento especfico
impide que el sistema de auto-orientacin [32, 34]. En diferentes especies de Sulfolobus, los loci
CRISPR contienen espaciadores mltiples cuya secuencia coincide con plsmidos conjugativos
significativamente, mientras que en algunos casos los plsmidos conjugativos tambin contienen
pequeos loci CRISPR. La adquisicin del espaciador se ve afectada por la replicacin activa del
ADN viral en especies de Sulfolobus, mientras que el ADN se rompe la formacin en la horquilla de
replicacin hace que el proceso sea estimulado [35]. De acuerdo con la informacin anterior, el
sistema CRISPR-Cas ha obtenido una posicin nica en sistemas biolgicos avanzados debido a su
enorme papel en la estabilidad y mejora de la inmunidad. Las nucleasas de Zinc-dedo (ZFNs) y las
nucleasas efectoras de activacin de la transcripcin (TALENs) son nucleasas quimricas
compuestas de mdulos de unin a ADN especficos de secuencias, programables y vinculados a
un dominio de escisin de DNA inespecfico. El potencial teraputico de ZFNs y TALENs es ms
especfico y objetivo. , 36, 37]. De forma similar, se ha desarrollado factor de crecimiento de
fibroblastos de protena recombinante (FGF-1) que funciona para inducir la formacin de nuevos
vasos sanguneos en el miocardio.

u inyeccin (bypass biolgico) en un miocardio humano causa un aumento del suministro de

sangre al corazn. Apligraf, un producto aprobado por la FDA, que sirve como un sustituto de piel
recombinante, especificado para el tratamiento de la lcera de la pierna y Derma-Graft, es eficaz
en el tratamiento de las lceras diabticas [38 - 40]. Despus de la produccin exitosa de insulina
de E. coli a travs de la tecnologa del ADN recombinante, actualmente varios animales,
especialmente ganado y cerdos, han sido seleccionados como fuente de produccin de insulina,
que sin embargo, desencaden respuestas inmunes. La insulina humana recombinante es idntica
a la insulina porcina humana y, comparativamente, produce respuestas inmunognicas.

Adems, es ms asequible y puede satisfacer las necesidades mdicas ms fcilmente. La hormona

del crecimiento humano fue la primera protena expresada en las plantas de tabaco [41, 42].
Adems de la insulina, varios nuevos frmacos relacionados con la tecnologa del ADN
recombinante han experimentado mejoras en el desarrollo y se han desarrollado una serie de
sistemas de produccin de protenas. Varias cepas microbianas de ingeniera se han desarrollado
para llevar a cabo la formulacin de frmacos [41, 43, 44]. Formacin de la medicina molecular
que se basa especficamente en las protenas se enfrenta a graves problemas, incluidos los
mtodos y la biologa de las clulas que funcionan para producir compuestos de importancia
mdica a travs de tcnicas de ADN recombinante. Para superar estos obstculos, existe una
necesidad intensa de mejorar la calidad y la cantidad de medicamentos basados en un fenmeno
molecular. Las fbricas de clulas se consideran importantes en las tecnologas de ADN
recombinante, pero stas deben ser exploradas con ms detalles y profundidad ya que las fbricas
convencionales no estn satisfaciendo las necesidades [42]. De forma similar, se utiliz el factor de
crecimiento endotelial y la sealizacin Notch para disear un adenovirus oncoltico que acta
como un agente selectivo del cncer de mama para la expresin del antagonista.

a como un agente selectivo del cncer de mama para la expresin del antagonista. Esto, adems, a
travs de la alteracin de la angiognesis tumoral acta como agente anticancergeno. Esto
disminuye el nmero total de vasos sanguneos y provoca un cambio dramtico junto con los
vasos perfundidos que indica la eficacia mejorada contra el tumor y los efectos vasculares [13]. Se
han realizado esfuerzos para modificar el genoma del virus de la gripe utilizando tecnologa de
ADN recombinante para el desarrollo de vacunas. Las modificaciones se basan en la ingeniera de
vectores para la expresin de genes extraos. En la prctica, se reemplaz el gen NS del virus de la
gripe por medio de la prctica, se reemplaz el gen NS del virus de la gripe por un gen extrao,
comnmente el gen del cloranfenicol acetiltransferasa. A continuacin, el ARN previamente
recombinado se expresa y envasa en partculas virales despus de transfeccin con virus A La
presencia de virus auxiliar. Se ha aclarado que el terminal 5 and y las bases terminales 3 son
suficientes del ARN del virus de la influenza A para producir seales para la replicacin del ARN, la
transcripcin del ARN y el envasado del ARN en el virus de la gripe 15.

En el virus de la gripe [15]. Los nuevos sistemas de produccin mencionados mejoran los
oleoductos para el desarrollo de diversas vacunas y frmacos, entre otros. La produccin de
protenas de alta calidad depende de la fisiologa de una clula y de las condiciones que se le
proporcionan. La expresin de protenas se vuelve retardada si una clula pasa bajo condiciones
estresantes, lo que tambin puede favorecer la produccin en algunos casos. Por lo tanto, se

Necesarios para una mejor y segura produccin a niveles genticos y metablicos. Los
microorganismos se consideran los huspedes ms convenientes para producir medicamentos
moleculares. Estas clulas permiten la incorporacin de genes extraos con barreras menos
resistentes y la expresin se controla fcilmente. En comparacin con las clulas de plantas y
mamferos que deben tomarse como huspedes, los sistemas microbianos proporcionan una
maquinaria menos complicada que en ltima instancia mejora el rendimiento y la calidad de la
produccin de protenas. El uso de especies microbianas comunes, incluyendo bacterias y
levaduras, es prometedor, pero

Tambin se han observado cepas comunes prometedoras como fbricas celulares para producir
frmacos moleculares recombinantes. Las demandas crecientes de drogas y las necesidades de
calidad se pueden cumplir con mejores resultados si estas fbricas celulares de microorganismos
se incorporan en procesos productivos de productos farmacuticos.

4. Aplicaciones de la tecnologa del ADN recombinante

4.1. Alimentacin y agricultura. La tecnologa de ADN recombinante tiene usos importantes que
hicieron posible la fabricacin de nuevas enzimas que son adecuadas en condiciones para el
procesamiento de alimentos especificado. Varias enzimas importantes, incluyendo lipasas y
amilasas, estn disponibles para las producciones especficas debido a sus papeles particulares y
aplicaciones en las industrias alimentarias. La produccin de cepas microbianas es otro gran logro
que se hizo posible con la ayuda de ADN recombinante. Se han desarrollado una serie de cepas
microbianas que producen enzima mediante ingeniera especfica para la produccin de proteasas.
Ciertas cepas de hongos se han modificado para que su capacidad de producir materiales txicos
podra reducirse [47]. Las lisozimas son los agentes eficaces para deshacerse de las bacterias en las
industrias alimentarias. Previenen la colonizacin de organismos microbianos. Es un agente
adecuado para los productos alimenticios incluyendo frutas, verduras, queso y carne para ser
almacenado, ya que aumenta su vida til. La inhibicin de microorganismos deteriorantes de los
alimentos puede llevarse a cabo a travs de lisozima inmovilizada en pelculas de poli (alcohol
vinlico) y celulosa. La impregnacin de lisozima de geles de gelatina de piel de pescado aumentar
la vida til de los productos alimenticios e inhibir diferentes alimentos estropear el crecimiento
bacteriano [48 - 50]. Exopolysaccharides de Staphylococcus y E. coli puede ser hidrolizado con el
uso de DspB que es ingeniera de T7.This capacidad de DspB provoca una declinacin en la
poblacin bacteriana [50]. Biofilms relacionados con las industrias alimentarias pueden eliminarse
por la actividad de combinacin de serinas proteasas y amilasas [51]. S. aureus, Salmonella
infantis, Clostridium perfringens, B. cereus, Campylobacter jejuni, L. monocytogenes, Yersinia
enterocolitica y algunos otros microorganismos deteriorantes de alimentos pueden ser inhibidos
por la glucosa oxidasa. Tambin se considera una de las enzimas ms importantes en la industria
alimentaria Para matar la amplia gama de patgenos transmitidos por los alimentos [50]. La
derivacin de las protenas recombinantes que se utilizan como productos farmacuticos entr en
prctica desde la primera planta recientemente y muchos otros son a travs de ser utilizado para
producir ms de protenas similares mdicamente importantes [52]. Amplia gama de protenas
recombinantes se han expresado en diferentes especies de plantas que se utilizan como enzimas
en las industrias, algunas de las protenas ms utilizadas en la investigacin son las protenas
presentes en la leche que juegan un papel en la nutricin y nuevas protenas polimricas se
utilizan en las industrias y el campo mdico [52]. Con la invencin de la produccin de vacunas de
HBV en plantas, el concepto de vacunacin oral con plantas comestibles ha ganado popularidad.
Las plantas se han utilizado para producir varios productos proteicos teraputicos, tales como
casena y lisozima para mejorar la salud del nio y los polmeros de protenas para el reemplazo de
tejidos y la ciruga. Adems, las plantas de tabaco pueden ser manipuladas genticamente para
producir colgeno humano. De alto rendimiento de las protenas moleculares es una de las
principales tareas en consideracin en el campo de la tecnologa del ADN recombinante [52]. El
anlisis tradicional de locus de cultivo y cuantitativo (QTL) ayud en la identificacin de una
variedad de arroz con protena quinasa conocida como PSTOL1 (tolerancia al hambre del fsforo1)
que ayuda a mejorar el crecimiento de las races en etapas tempranas y tolera la deficiencia de
fsforo. La sobreexpresin de esta enzima permite a la raz absorber los nutrientes en cantidad
suficiente en el suelo fsforo deficiente que en ltima instancia mejora el rendimiento de grano
[54]. Las secuencias del genoma del cloroplasto son importantes en la evolucin de las plantas y
en la filogenia. Se considera que Rpl22 se transfiere del cloroplasto al genoma nuclear. Este gen
contiene un pptido que desempea un papel en el suministro de la protena del citosol al
cloroplasto. Se ha observado que varios genes importantes eliminados del cloroplastos son
transferidos al ncleo, excepto ycf1 y ycf2, con el fin de evitar interrupciones en la fotosntesis y
otros procesos necesarios. La transgnesis en el cloroplasto se considera estable ya que las plantas
transgnicas nucleares se enfrentan a problemas de menor expresin y el escape del transgn a
travs del polen. Casi diez mil copias de transgenes se han incorporado en el genoma del
cloroplasto [55-57]. La expresin de transgenes depende de secuencias reguladoras heterlogas
pero independiente del control celular. T7gene10 ingeniera contra el estrs de la sal se ha
encontrado con xito, pero con menor tasa de expresin en tejidos nongreen. La insercin del gen
-tmt en el genoma del cloroplasto da lugar a la formacin de mltiples capas de la envuelta
interna de cloroplasto. Lycopene -ciclasa introduccin de genes en el plastidio genoma de tomate
aumenta la conversin de licopeno en provitamina A [57, 58].

Tiene un amplio espectro de aplicaciones en el tratamiento de enfermedades y la mejora de las

condiciones de salud. Las secciones siguientes describen los importantes avances de la tecnologa
del ADN recombinante para el mejoramiento de la salud humana: 4.2.1. Terapia de genes. La
terapia gentica es una tcnica avanzada con potencial teraputico en los servicios de salud. El
primer informe exitoso en el campo de la terapia gnica para tratar una enfermedad gentica
proporcion una direccin ms segura para curar las enfermedades genticas ms mortferas [62,
63]. Tratamiento para la deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA-SCID), que es una
inmunodeficiencia primaria. Al comienzo de esta tecnologa, varios de los retos, incluido el
mantenimiento de los pacientes con PEGylated ADA (PEG-ADA) durante la terapia gnica y la
orientacin de la transferencia de genes a los linfocitos T fueron las razones de resultados
infructuosos [64, 65]. Sin embargo, ms adelante se obtuvieron resultados exitosos dirigindose a
las clulas madre hematopoyticas (HSC) utilizando un protocolo de transferencia de genes
mejorado y un rgimen de acondicionamiento mieloablativo [66]. La adrenoleucodistrofia (X-ALD)
y el trastorno ligado al X son posibles a travs de la expresin de genes especficos transferidos por
el vector lentiviral, basado en el VIH-1 [67]. La expresin de la protena XALD indica que la
correccin gnica de los HSC verdaderos se consigui con xito. El uso del vector lentiviral se logr
por primera vez para tratar la enfermedad humana gentica [68]. El melanoma metastsico se
trat a travs de la inmunoterapia mediante el aumento de la expresin de protenas especficas
durante 2006. Este xito en el campo de las ciencias de la salud abri nuevas puertas para ampliar
la La investigacin para tratar la muerte grave causando enfermedades a travs de la
inmunoterapia [69]. Los niveles altamente sostenidos de clulas que se disearon para el
reconocimiento de tumores en sangre usando un retrovirus que codifica un receptor de clulas T
en dos pacientes hasta 1 ao despus de la infusin dieron como resultado la regresin de
lesiones de melanoma metasttico. Esta estrategia se utiliz ms tarde para tratar a los pacientes
con carcinoma de clulas sinoviales metastsicas [70]. Las clulas T autlogas se modificaron
genticamente para expresar un Receptores del Antgeno Quimrico (CAR) con especificidad para
el antgeno CD19 de clulas B para el tratamiento de la leucemia linfoctica crnica. Las clulas
modificadas genticamente experimentan expansin selectiva para enfermedades tales como
SCID-X1 y ADASCID como consecuencia de la seleccin in vivo conferida por la fisiopatologa de la
enfermedad a pesar de la correccin del nico nmero amodiaco de progenitores. La combinacin
del potencial del gen y de la farmacoterapia ha sido recientemente destacada en un ensayo que
busca conferir quimioproteccin a los HSC humanos durante la quimioterapia con agentes
alquilantes para el glioblastoma [71]. La transferencia gnica a un pequeo nmero de clulas en
sitios anatmicamente discretos es una estrategia dirigida que tiene el potencial de conferir
beneficio teraputico. Demostr resultados impresionantes para las distrofias autosmicas
recesivas incurables como la ceguera congnita y la amaurosis congnita de Leber (LCA). Suizo-
alemn de fase I / II terapia gentica ensayo clnico destinado a tratar la enfermedad
granulomatosa crnica en abril de 2006 que lleg con xito [72]. Las clulas CD34 + movilizadas
aisladas de sangre perifrica se transdujeron retroviralmente y se infundieron en el paciente,
donde dos tercios de los pacientes mostraron un claro beneficio de este tratamiento. Tras el
tratamiento de silenciamiento del transgn como resultado de la metilacin del promotor viral
caus la gravedad de la infeccin que llev a la muerte del paciente [73]. Muchos cnceres
diferentes, incluidos tumores pulmonares, ginecolgicos, cutneos, urolgicos, neurolgicos y
gastrointestinales, as como tumores malignos hematolgicos y tumores peditricos, han sido
objeto de terapia gnica. La insercin de los genes supresores de tumores a la inmunoterapia,
viroterapia oncoltica y la enzima dirigida a los genes de la terapia de profrmacos son diferentes
estrategias que se han utilizado para tratar diferentes tipos de cnceres. El p53, un gen supresor
de tumores comnmente transferido, es un actor clave en los esfuerzos de tratamiento del cncer.
En algunas de las estrategias, la transferencia de genes p53 se combina con quimioterapia o
radioterapia. Las estrategias ms importantes que se han empleado hasta ahora son la vacunacin
con clulas tumorales diseadas para expresar molculas inmunoestimuladoras, la vacunacin con
vectores virales recombinantes que codifican antgenos tumorales y la vacunacin con clulas
husped manipuladas Para expresar antgenos tumorales [19]. Los nuevos vectores de adenovirus
oncolticos quimricos quimricos (Ad5 / 35-EGFP) ofrecen un nuevo agente anticancergeno
afectivo para la mejor cura del carcinoma hepatocelular. Una demostracin de estos vectores
mediante un ensayo adecuado fue significativa para la mejora de la transduccin y se produjo ms
progenie del virus en CHC. Se medi un mayor nivel de expresin transgnica y se observ un
efecto antitumoral mejorado en clulas HCC in vitro manteniendo las clulas normales protegidas
contra la citotoxicidad. El crecimiento tumoral tambin se inhibi mediante la utilizacin de esta
tecnologa [74]. La terapia gentica con cncer se ha vuelto ms avanzada y su eficacia se ha
mejorado en los ltimos aos [75]

Ha mejorado en los ltimos aos [75]. El tratamiento de las enfermedades cardiovasculares

mediante la terapia gnica es una estrategia importante en la ciencia del cuidado de la salud. En el
campo cardiovascular, la terapia gnica proporcionar una nueva va para la angiognesis
teraputica, la proteccin miocrdica, la regeneracin y la reparacin, la prevencin de la
restenosis despus de la angioplastia, la prevencin del fracaso del injerto bypass y la gestin del
factor de riesgo. Citoesqueleto, causa el sndrome de Wiskott-Aldrich (inmunodeficiencia
hereditaria). Su tratamiento requiere el trasplante de clulas madre; En el caso de donantes
emparejados no estn disponibles el tratamiento se lleva a cabo a travs de la infusin de HSPCs
autlogos modificados ex vivo por terapia gnica [76]. El cncer metastsico se puede regresar a
travs de la inmunoterapia basada en la transferencia adoptiva de clulas T modificadas
genticamente. La focalizacin precisa de los antgenos expresados por los tumores y la
vasculatura asociada y el uso exitoso de la ingeniera gentica para reasignar las clulas T antes de
su transferencia al paciente se centran principalmente en esta terapia [77]. Las clulas cancerosas
a menudo se hacen casi "invisibles" al sistema inmunolgico y su microambiente suprime la
supervivencia y migracin de las clulas T, pero la ingeniera gentica de las clulas T es la solucin
a estos desafos. Las clulas T en pacientes con cncer pueden modificarse mediante la
recombinacin de los genes responsables del reconocimiento de antgenos especficos del cncer,
la resistencia a la inmunosupresin y la prolongacin de la supervivencia y facilitar la migracin a
tumores. Fusin entre los genes equinodermo microtbulos asociados a protenas como 4 (EML4)
y anaplastic linfoma quinasa (ALK) se genera por una inversin en el brazo corto del cromosoma
confiere sensibilidad a los inhibidores de ALK. La entrega mediada por vial del sistema CRISPR /
Cas9 a clulas somticas de animales adultos induce reordenamientos cromosmicos especficos
[79]. Wnt sealizacin es una de las principales vas oncognicas en mltiples cnceres. La
orientacin de la va Wnt en el cncer es un enfoque teraputico atractivo, donde LGK974 potente
inhibe la sealizacin Wnt, tiene una fuerte eficacia en los modelos de tumor de roedores, y es
bien tolerado. Lneas celulares de cncer de cabeza y cuello con mutaciones de prdida de funcin
en la va de sealizacin Notch tienen una alta tasa de respuesta a LGK974 [80]. El gen
codonoptimizado, sobre la base de la secuencia codificante del gen de la hemaglutinina del virus
de la gripe, se sintetiz y se clon en un virus de la vacuna recombinante modificado Ankara
(MVA). La inmunizacin con el vector viral MVA-H7-Sh2 en hurones demostr ser inmunognica,
ya que los animales no protegidos que fueron vacunados simuladamente desarrollaron neumona
intersticial y prdida de apetito y peso pero la vacunacin con MVAH7-Sh2 protegi a los animales
de una enfermedad grave. La terapia gnica viral es una de las terapias principales e importantes
para el cncer de cabeza y cuello. Los genes asociados a tumores son atacados por virus, y la
funcin del gen p53 fue dirigida a travs de tal terapia al principio. Las clulas cancerosas pueden
ser destruidas por los virus oncolticos a travs de la replicacin viral y armando con transgenes
teraputicos [82]. La mutacin del gen de la lipoprotena de alta densidad ABCA1 en las clulas
puede hacer que las clulas se diferencien en macrfagos. Gene knockouts en las clulas madre
embrionarias aumentar la capacidad de las clulas para ser diferenciados en macrfagos y
especficamente dirigidos a los patgenos deseados. El alelo reemplazos en este caso ayudar a
estudiar la codificacin de protenas cambios y variantes reguladoras implicados en la alteracin
de la transcripcin de mRNA y la estabilidad en los macrfagos [83]. 4.2.2. Produccin de
anticuerpos y sus derivados. Recientemente se han utilizado sistemas vegetales para la expresin y
desarrollo de diferentes anticuerpos y sus derivados. Ms importante an, de muchos anticuerpos
y derivados de anticuerpos, siete han alcanzado las etapas satisfactorias de los requisitos. Las
plantas de tabaco transgnicas pueden usarse para la produccin de IgA / G secretoras quimricas
conocidas como CaroRx, CaroRx. Patgeno oral responsable de la descomposicin de un diente
conocido como Streptococcus mutantes, puede ser reconocido por este anticuerpo. anticuerpo.
Un anticuerpo monoclonal llamado T84.66 puede funcionar afectivamente para reconocer el
antgeno carcinoembrionario, que todava se considera un marcador caracterizado afectivamente
en los cnceres de epitelios [84, 85]. Se ha expresado una IgG1 humanizada de longitud completa
conocida como anti-HSV y anti-RSV, que puede funcionar como el agente de reconocimiento del
virus del herpes simple (HSV) -2-glicoprotena B, en clulas de soja transgnica y ovario de hmster
chino (CHO) . Se ha demostrado que los anticuerpos de ambas fuentes previenen la transmisin
vaginal de HSV-2 en ratones despus de aplicar tpicamente; Si se trabaja de forma similar en los
seres humanos se considerara como una prevencin barata y afectiva contra las enfermedades
transmitidas a travs de las interacciones sexuales [86-88]. 38C13 es un anticuerpo scFv basado en
el idiotipo de linfocitos B malignos en la lnea celular 38C13 de linfoma de ratn bien
caracterizada. La administracin del anticuerpo a los ratones dio como resultado la produccin de
anticuerpos anti-idiotipo que son capaces de reconocer las clulas 38C13, que ayudan a proteger a
los ratones contra las clulas de linfoma inyectadas, es un desafo letal [89, 90]. Marcadores nicos
que reconocen las enzimas podran ser producidos a travs de este sistema, ms afectivamente los
marcadores de superficie de un maligno B-clulas para trabajar como una terapia eficaz para el
linfoma no Hodgkin como las enfermedades en humanos [61]. Un anticuerpo monoclonal
conocido como PIPP es especfico para el reconocimiento de la gonadotropina corinica humana.
La produccin de anticuerpos monoclonales de longitud completa y scFv y diacuerpo derivados se
hizo posible en las plantas a travs de transgnesis y agroinfiltracin en el tabaco transformado
transitoriamente [91]. La produccin de testosterona por hCG estimulada puede ser inhibida por
cada uno de estos anticuerpos en clulas cultivadas por LEYDIG y el aumento de peso uterino
podra retrasarse en ratones, a travs del cual se controla la hCGactividad. El diagnstico y la
terapia de tumores se pueden llevar a cabo con la ayuda de anticuerpos. ].

4.2.3. Investigacin del metabolismo de la droga. El sistema complejo de frmacos que

metabolizan las enzimas implicadas en el metabolismo del frmaco es crucial para ser investigado
para la eficacia y efectos adecuados de los frmacos. Los enfoques de ADN recombinante han
contribuido recientemente a su funcin a travs de la expresin heterloga, donde la informacin
gentica de la enzima se expresa in vitro o in vivo, a travs de la transferencia de genes [92, 93].

4.2.4. Desarrollo de Vacunas y Hormonas Recombinantes.

Las vacunas comparativamente convencionales tienen menor eficacia y especificidad que la

vacuna recombinante. Una tcnica libre de miedo y sin dolor para transferir vectores de
adenovirus que codifican antgenos patgenos es mediante transferencia nasal, que es tambin un
mtodo rpido y de proteccin contra los patgenos de la mucosa. Esto acta como una vacuna
de frmacos, donde un estado anti-influenza puede ser inducida a travs de una expresin
transgnica en la va area [74]. La produccin in vitro de hormona estimulante del folculo
humano (FSH) es ahora posible a travs de la tecnologa de ADN recombinante. La FSH es
considerablemente una protena heterodimrica compleja y se ha seleccionado la lnea celular
especificada de eucariotas para su expresin. El tratamiento de reproduccin asistida mediante el
desarrollo folicular estimulante es un logro de la tecnologa del ADN recombinante. Un gran
nmero de pacientes estn siendo tratados a travs de r-FSH. Lo ms interesante r-FSH y la
hormona luteinizante (LH) recombinacin se hizo exitosa para mejorar la ovulacin y el embarazo
[94, 95].

4.2.5. Medicinas Chinas. Como un componente importante de la medicina alternativa, las

medicinas de lechones tradicionales desempean un papel crucial en el diagnstico y la
teraputica. Estos medicamentos se asocian con teoras que son congruentes con el principio de
terapia gnica hasta cierto punto. Estos frmacos pueden ser las fuentes de un transporte de
genes teraputicos y como frmacos coadministrados. El sistema radicular transgnico tiene un
valioso potencial para la introduccin de genes adicionales junto con el plsmido Ri. Se transporta
principalmente con genes modificados en sistemas de A. rhizogenes vector para mejorar las
caractersticas de uso especfico. Los cultivos se convirtieron en una valiosa herramienta para
estudiar las propiedades bioqumicas y el perfil de expresin gnica de las vas metablicas. Los
intermediarios y enzimas clave que participan en la biosntesis de los metabolitos secundarios
pueden ser elucidados por los cultivos girados [96, 97]

4.2.6. Compuestos Importantes Mdicamente en Bayas. La mejora en los valores nutricionales de

las fresas se ha llevado a travs del gen rolC. Este gen aumenta el contenido de azcar y la
actividad antioxidante. La glicosilacin de las antocianinas requiere dos enzimas glicosil-
transferasa y transferasa. Algunos genes relacionados con la nutricin para diferentes
componentes en la fresa incluyendo proantocianidina, l-ascorbato, flavonoides, polifenoles y
flavonoides son importantes para mejorar el componente de inters a travs de la transformacin
gentica. En el caso de la frambuesa, los genes bHLH y FRUITE4 controlan los componentes de la
antocianina mientras que ERubLRSQ072H02 est relacionado con el flavonol. Por transformacin
especfica, estos genes pueden mejorar la produccin y mejorar la calidad. Todos estos
compuestos mencionados tienen valores mdicos [98]. 4.3. Ambiente. La liberacin de microbios
genticamente modificados, por ejemplo, la cepa de Pseudomonas fluorescens denominada HK44,
para propsitos de biorremediacin en el campo, fue practicada por primera vez por la
Universidad de Tennessee y el Laboratorio Nacional de Oak Ridge trabajando en colaboracin con
[ La cepa de ingeniera contena el plsmido catablico de naftaleno pUTK21 [101] y un gen lux de
produccin de bioluminiscencia basado en transposn fusionado dentro de un promotor que daba
como resultado una degradacin mejorada del naftaleno y una respuesta bioluminiscente
coincidente [102]. HK44 sirve como reportero Para la biodisponibilidad y biodegradacin del
naftaleno, mientras que su capacidad de sealizacin de bioluminiscencia hace que sea capaz de
ser utilizado como una herramienta en lnea para el monitoreo in situ de los procesos de
biorremediacin [102]. La produccin de seal bioluminiscente es detectable utilizando fibra
ptica y contadores de fotones mdulos [101]. 4.3.1. Fitorremediacin y desarrollo de la
resistencia de las plantas. La ingeniera gentica ha sido ampliamente utilizada para la deteccin y
absorcin de contaminantes en agua potable y otras muestras. Por ejemplo, la introduccin del
gen AtPHR1 en las plantas de jardn Torenia, Petunia y Verbena cambi su capacidad para la
absorcin de pi. Las plantas transgnicas AtPHR1 con mayor capacidad de absorcin de pi pueden
facilitar la fitorremediacin eficaz en entornos acuticos contaminados [103]. Se insert un
fragmento del gen AtPHR1 en el vector binario pBinPLUS, que contiene un promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor potenciado. Este plsmido se denomin pSPB1898 y se utiliz para la
transformacin [104] en Petunia y Verbena utilizando Agrobacterium tumefaciens [105]. AtPHR1
es eficaz en otras especies de plantas, tales como Torenia, Petunia y Verbena [103], pero
posttranscriptional modificacin de la endgena AtPHR1 homlogo podra ser inhibido por la
sobreexpresin de AtPHR1 [103]. Los procesos del metabolismo de las plantas identifican su
importancia para usar para remediar los contaminantes ambientales. Algunos de los productos
qumicos no son propensos a ser degradados o digeridos. El TNT slo se digiere parcialmente en el
que el nitrgeno reacciona adicionalmente con el oxgeno para formar un superxido txico. Para
superar esta cuestin, el gen responsable de la monodehidroascorbato reductasa es eliminado, lo
que aumenta la tolerancia de la planta contra TNT. El ajuste fino de la actividad enzimtica y la
ingeniera de eliminacin simultnea mejoran las respuestas de la planta a los metales txicos.
Phytochelatin sintasa, un metal pesado vinculante pptidos sntesis enzima, revel una manera de
mejorar la tolerancia a los metales pesados a travs de la actividad enzimtica atenuacin [106].
La tecnologa de ADN recombinante ha demostrado ser eficaz para eliminar las partculas de
arsnico que se consideran contaminantes graves en el suelo. PvACR3, un arsenito clave [As (III)]
antiporter se expres en Arabidopsis que mostr una mayor tolerancia al arsnico. Las semillas de
plantas modificadas genticamente con PvACR3 pueden germinar y crecer en presencia de una
cantidad mayor que la normal de arseniato [As (V)] que son generalmente letales para las semillas
silvestres. Arsnico (As) se reduce por As reductasa presente en A. thaliana. Las fitoquelatinas
restringen el movimiento del arsnico en las clulas de las races y las clulas compaeras del
floema. OsNramp5 y OsHMA3 representan a los transportistas a la captacin de cadmio (Cd) y su
retencin [107]. En las plantas, el brassino-esteroide (BR) participa en la regulacin de los procesos
fisiolgicos y de desarrollo. Su actividad se inicia con el desencadenamiento de fosforilacin o
desfosforilacin en cascada [108].

os enfoques biotecnolgicos recientes para la biorremediacin incluyen biosorcin,

fitostabilizacin, hiperacumulacin, dendroremediacin, bioestimulacin, mycoremediacin,
cianorremediacin y genoremediacin, que dependen principalmente de la mejora o prevencin
de actividades de genes especificados. Sin embargo, los retos en la adopcin de la tcnica exitosa
no puede ser ignorado [109]. 4.3.2. Aplicaciones de Energa. Varios microorganismos,
especficamente cianobacterias, median la produccin de hidrgeno, que es una fuente de energa
respetuosa con el medio ambiente. La produccin especfica se mantiene utilizando las enzimas
requeridas adecuadamente ya que estas enzimas juegan un papel clave en la formacin del
producto. Pero los enfoques avanzados como la ingeniera gentica, la alteracin de las
condiciones de nutrientes y el crecimiento, la combinacin de la cultura, la ingeniera metablica,
y la tecnologa libre de clulas [110-112] han demostrado resultados positivos para aumentar la
produccin de hidrgeno en las cianobacterias y otros biocombustibles [3, 4]. La comercializacin
de esta fuente de energa mantendr limpio el medio ambiente, lo que no es posible utilizando
fuentes de energa convencionales que liberen CO2 y otros productos qumicos peligrosos [113].
Tambin las cianobacterias pueden ser diseadas para hacerlas capaces de convertir el CO2 en
compuestos de combustible reducido. Esto har que las fuentes de energa de carbono sean
inofensivas para el medio ambiente. Este enfoque ha sido exitoso para una amplia gama de
productos qumicos bsicos, en su mayora portadores de energa, como los alcoholes de cadena
corta y media cadena [114].
Los biofilms conductores de Geobacter sulfurreducens son fuentes potenciales en el campo en
energa renovable, biorremediacin, y bioelectrnica. La delecin de los genes de PilZ que
codifican protenas en el genoma de G. sulfurreducens hizo el biofilm ms activo en comparacin
con el tipo salvaje. CL-1n se especifica para la cepa en la que se ha suprimido el gen GSU1240. La
produccin de biofilm se potenci junto con la produccin de pili y exopolysaccharide. El aceptor
de electrones CL-1 produjo biofilms que eran 6 veces ms conductores que los biofilms de tipo
salvaje cuando se cultivaron con electrodo. Esta alta conductividad del pliegue disminuy las
prdidas potenciales en las clulas de combustible microbianas, disminuyendo la resistencia a la
transferencia de carga en la superficie del biofilmanode y disminuyendo el potencial formal.
Potencial de energa se increment por menores prdidas [115].

. Desafos actuales y perspectivas futuras

El hecho de que las clulas microbianas son ms utilizadas en la produccin de frmacos

recombinantes indica que varios obstculos vienen en su camino restringindolos de producir
protenas funcionales eficientemente, pero stos se manejan con alteraciones en los sistemas
celulares. Los obstculos comunes que deben tratarse son las modificaciones postraduccionales, la
activacin de las respuestas de estrs celular, y la inestabilidad de las actividades proteolticas, la
baja solubilidad y la resistencia a la expresin de nuevos genes. Las mutaciones que ocurren en los
seres humanos a niveles genticos causan deficiencias en la produccin de protenas, que pueden
ser alteradas / tratadas mediante la incorporacin de genes externos para llenar los vacos y
alcanzar los niveles normales. El uso de Escherichia coli en la tecnologa de ADN recombinante
acta como un marco biolgico que permite a los productores trabajar de manera controlada para
producir tcnicamente las molculas necesarias a travs de procesos asequibles [41, 116]. La
investigacin de ADN recombinante muestra una gran promesa en la comprensin de la biologa
de la levadura, haciendo posible el anlisis y la manipulacin de los genes de levadura, no slo en
el tubo de ensayo, sino tambin en las clulas de levadura. Lo ms importante, ahora es posible
volver a la levadura por transformacin con ADN y clonar los genes usando una variedad de
sistemas marcadores seleccionables desarrollados para este propsito. Estos avances tecnolgicos
se han combinado para hacer posible la manipulacin gentica verdaderamente molecular y
clsica y el anlisis en levaduras. Los problemas biolgicos que han sido ms eficazmente
abordados por la tecnologa del ADN recombinante son aquellos que tienen la estructura y
organizacin de los genes individuales como su tema central [117, 118]. La tecnologa del ADN
recombinante est pasando recientemente a un desarrollo profundo que ha trado tremendo
cambios en las lneas de investigacin y abri las direcciones para avanzadas e interesantes formas
de investigacin de vas biosintticas a travs de la manipulacin gentica. Actinomicetos se
utilizan para producciones farmacuticas, por ejemplo, algunos compuestos tiles en ciencias de la
salud y la manipulacin de vas biosintticas para una generacin de nuevas drogas. Estos
contribuyen a la produccin de una parte importante de compuestos biosintticos y por lo tanto
han recibido consideraciones inmensas en el diseo de frmacos recombinantes . Sus compuestos
en los ensayos clnicos son ms aplicables, ya que han demostrado una actividad de alto nivel
contra diversos tipos de bacterias y otros microorganismos patgenos. Estos compuestos tambin
han mostrado actividad antitumoral y actividad inmunosupresora [119].
La tecnologa del ADN recombinante como una herramienta de terapia gnica es una fuente de
prevencin y curacin colectiva contra los trastornos genticos adquiridos. El desarrollo de
vacunas de ADN es un nuevo enfoque para proporcionar inmunidad contra varias enfermedades.
En este proceso, el ADN suministrado contiene genes que codifican protenas patgenas. La
terapia gnica humana se dirige principalmente a tratar el cncer en ensayos clnicos. La
investigacin se ha centrado principalmente en la alta eficacia de la transfeccin relacionada con
el diseo del sistema de administracin gnica. La transfeccin para la terapia gnica del cncer
con toxicidad mnima, como en el caso de cncer cerebral, cncer de mama, cncer de pulmn y
cncer de prstata, todava est bajo investigacin. Tambin el trasplante renal, la enfermedad de
Gaucher, la hemofilia, el sndrome de Alport, la fibrosis renal y algunas otras enfermedades estn
siendo consideradas para la terapia gnica [120].

6. Conclusiones

La tecnologa del ADN recombinante es un desarrollo importante en la ciencia que ha hecho la

vida humana ms fcil. En los ltimos aos, ha avanzado estrategias para aplicaciones biomdicas
como el tratamiento del cncer, enfermedades genticas, diabetes, y varios trastornos de las
plantas especialmente la resistencia viral y fngica. Se ha reconocido ampliamente el papel de la
tecnologa de ADN recombinante en el medio ambiente limpio (fitorremediacin y remediacin
microbiana) y la resistencia mejorada de las plantas a diferentes factores de accin adversa
(sequa, plagas y sal). Las mejoras que trajo no slo en seres humanos sino tambin en plantas y
microorganismos son muy significativas. Los retos en la mejora de los productos a nivel de genes a
veces se enfrentan a serias dificultades que se necesitan para ser tratadas para el mejoramiento
de la tecnologa de ADN recombinante futuro. En los productos farmacuticos, en especial, hay
problemas graves para producir productos de buena calidad, ya que el cambio introducido en un
gen no es aceptado por el cuerpo. Adems, en caso de aumentar el producto no siempre es
positivo porque pueden interferir diferentes factores para evitar que tenga xito. Teniendo en
cuenta los problemas de salud, la tecnologa recombinante est ayudando en el tratamiento de
varias enfermedades que no pueden ser tratadas en condiciones normales, aunque las respuestas
inmunes dificultan el logro de buenos resultados. Varias dificultades se encuentran en las
estrategias de ingeniera gentica que han de superarse mediante un aumento gentico ms
especfico de acuerdo con el genoma del organismo. La integracin de ADN monocatenario
entrante en el cromosoma bacteriano se llevara a cabo mediante un proceso RecA-dependiente.
Esto requiere homologa de secuencia entre ambas entidades, el cromosoma bacteriano y el ADN
entrante. El mantenimiento estable y la reconstitucin del plsmido podra hacerse fcil. La
introduccin de material gentico de una fuente a otra es un desastre para la seguridad y la
biodiversidad. Hay varias preocupaciones sobre el desarrollo de plantas genticamente
modificadas y otros productos. Por ejemplo, es obvio que las plantas genticamente modificadas
pueden cruzarse con plantas silvestres, extendiendo as sus genes "manipulados" al medio
ambiente, contaminando nuestra biodiversidad. Adems, existen preocupaciones de que la
ingeniera gentica tiene implicaciones peligrosas para la salud. Por lo tanto, se requiere una
investigacin ms amplia en este campo para superar estos problemas y resolver las
preocupaciones de la gente comn.

Medicamentos obtenidos por procesamiento biotecnolgico

La palabra biotecnologa fue utilizada por primera vez por Karl Ereky (ingeniero agrcola hngaro)
en 1919, con el uso de organismos vivos en una materia prima dada con el fin de obtener un
producto en particular e introducir el concepto de cambio gentico (Fri, Kralovnszky, 2006) . La
biotecnologa se basa en los conocimientos cientficos de las diferentes disciplinas como la
microbiologa, la bioqumica, la gentica, la qumica, la ingeniera y la informtica para los agentes
biolgicos como los microorganismos, las clulas o las molculas (enzimas, anticuerpos, ADN, etc.)
Bunders et al., 1996). Este enfoque multidisciplinario es la caracterstica ms importante de este
campo cientfico de estudio en constante evolucin. En los ltimos aos, la industria de la
biotecnologa ha sido notable, ya que est asociada con procesos de produccin de alta eficiencia,
baja mano de obra, bajos costos, una industria respetuosa con el medio ambiente, con bajo
consumo de energa y emisiones reducidas de gases de efecto invernadero (Tang, Zhao, 2009). La
industria farmacutica, en sus intentos de descubrir nuevas molculas, ha encontrado un aliado en
la industria biotecnolgica, con un crecimiento exponencial (Bingham, Ekins, 2009). As, las
mayores compaas farmacuticas globales estn comprando compaas vinculadas a la
investigacin y produccin biotecnolgica (Malik, 2009). El objetivo de este trabajo fue revisar los
productos biofarmacuticos ms importantes, tales como factores sanguneos, hormonas,
citocinas, enzimas, vacunas y anticuerpos monoclonales.

PROCESOS DE BIOTECNOLOGA

Los procesos biotecnolgicos actuales implican esencialmente cinco grupos diferentes de

organismos: bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Pseudomonas spp., Serratia mascescens,
Erwenia herbicola, Lactococcus lactis y Bacillus subtilis), hongos (por ejemplo Saccharomyces
cerevisiae, Pichia y Hansenula, Trichoderma y Aspergilli) (Por ejemplo, Spodoptra frugiperda) y
mamferos (por ejemplo, clulas de ovario de hmster chino (CHO), clulas de rin de hmster de
beb (BHK) y animales transgnicos) (Walsh, Gary,

2003).

La aplicacin de diferentes tcnicas permite realizar cambios en los microorganismos, con el fin de
destacar una caracterstica particular o aumentar su produccin y, en ltima instancia, la
produccin de nuevos productos. Para ello, las
Pueden utilizarse tcnicas genticas tales como mutagnesis, fermentacin, procesos sexuales y
parasexuales o tcnicas modernas tales como tcnicas de ADN recombinante o la tcnica del
hibridoma (Ferreira, Sousa, 1998).

Ejemplos de frmacos obtenidos por procesos biotecnolgicos

Las formas biofarmacuticas son potentes, reactivas, inestables y muy caras (Bruggemeier, 2006;
Rader, 2008). Tienen varias ventajas tales como la provisin de tratamientos eficaces en
enfermedades crnicas y poco frecuentes. Los frmacos recombinantes (Factor VIII para la
hemofilia), ofrecen efectos secundarios ms seguros y reducidos, mejoran las terapias existentes y
pueden producirse a gran escala mediante procesos biotecnolgicos. Segn el PhRMA, en 2008 se
desarrollaron alrededor de 633 productos teraputicos biotecnolgicos en ms de 100
enfermedades diferentes, incluyendo 254 neoplasias malignas, 162 para enfermedades
infecciosas, 59 para enfermedades autoinmunes y 34 para el VIH / SIDA o enfermedades
relacionadas (PhRMA, 2008). En 2008, la FDA aprob 31 nuevos frmacos biotecnolgicos y en
agosto de 2009 se aprobaron 12 nuevos frmacos biotecnolgicos (por ejemplo, vacuna intranasal
contra el virus de la gripe estacional, tratamiento en adultos de artritis reumatoide moderada y
grave, prevencin de la coagulacin sangunea en pacientes con antitrombina hereditaria
Deficiencia, etc.) (PhRMA, 2009).

Estos nuevos frmacos estn ahora en uso diario para el tratamiento de enfermedades crnicas y
raras, para las que hasta ahora no haba terapias teraputicas o convencionales eran ineficaces. En
el futuro, los productos biofarmacuticos se pueden utilizar contra el virus del SIDA, diferentes
tipos de cncer, asma, Parkinson y enfermedad de Alzheimer. Existen diferentes grupos de
productos biofarmacuticos, entre ellos: antibiticos, factores sanguneos, hormonas, factores de
crecimiento, citoquinas, enzimas, vacunas y anticuerpos monoclonales.

Antibiticos

Los antibiticos son el grupo ms grande en trminos de importancia econmica entre los
productos obtenidos por fermentacin. Algunos ejemplos de antibiticos cuya sntesis involucr
microorganismos incluyen la penicilina producida a partir de Penicillium notatum; Cefalosporinas
(usualmente proceso semisinttico) del gnero Streptomyces; Cloranfenicol de Streptomyces
venezuelae; Estreptomicina de Streptomyces griseus; Cicloserina de Streptomyces orchidaceus;
Clindamicina de Streptomyces lincolnensis; Vancomicina aislada de cultivos de Streptomyces
orientalis (Nocardia orientalis); Teicoplanina de Actinmoplanes teichomyceticus y mupirocina de
Pseudomonas fluoresces (Osswald, Guimares, 2001).

Factores de la sangre
Incluso con causas idnticas, se pueden distinguir dos tipos de hemofilia, a saber, la hemofilia A (el
elemento deficiente o anormal es el factor VIII o el factor antihemoflico A) y la hemofilia B (el
elemento deficiente o anormal es el factor IX o el factor antihemoflico B) , Raso, 1998a). Estos dos
factores de coagulacin sangunea son producidos por

Tcnicas recombinantes. El Factor VIII recombinante producido en clulas CHO, que contena 1438
a.a. Se utiliza en el tratamiento de la hemofilia A (una enfermedad hereditaria caracterizada por
coagulacin sangunea lenta y dificultad para controlar la prdida de sangre) (Bhopale, Nanda,
2005a). Otro ejemplo es el Factor IX producido en clulas CHO, que contiene 415 a.a. Utilizado en
el tratamiento de la hemofilia B (Bhopale, Nanda, 2005b). El gen que produce este factor fue
clonado en una oveja por un laboratorio escocs en 1997, y esta oveja

(Steinberg, Raso, 1998b). En 2009, la FDA aprob Atryn (antitrombina recombinante), la primera
medicina producida utilizando animales modificados genticamente. Esta protena con
propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias se produce en la leche de cabras que han sido
modificadas genticamente. Atryn se utiliza para la prevencin de eventos tromboemblicos
perioperatorios y periparto en pacientes hereditarios con deficiencia de antitrombina. La Agencia
Europea de Medicamentos (EMEA) tambin anunci la aprobacin de la primera droga producida
en un biorreactor animal: Atryn de GTC Biotherapeutics (EMEA, 2011).

Hormonas

En 1982, la FDA aprob la primera forma de dosificacin obtenida mediante procesos

biotecnolgicos, la insulina humana recombinante para el tratamiento de pacientes con diabetes,
utilizando tcnicas de ADN recombinante en las bacterias E. coli (Humulin, Novolin, Velosulin).
Hoy en da, la insulina humana recombinante est disponible en diferentes concentraciones bajo
diferentes formas de accin teraputica (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina -
respectivamente, muy rpido, rpido, de larga duracin) y para diferentes aplicaciones
(intramuscular, subcutnea, etc.) . La hormona recombinante del crecimiento humano mejor el
tratamiento a largo plazo de los nios cuyo cuerpo no produca suficiente hormona del
crecimiento. La somatropina es una hormona de crecimiento humano recombinante,
comercializada bajo diferentes marcas como Saizen, Nutropin, Humatrope y Serostin.

Factores de crecimiento

Muchos Factores de Crecimiento Hematopoyticos (HGFs) han sido aislados, y la comprensin de

su potencial clnico sigue creciendo. Los HGFs han tenido un impacto significativo en la prevencin
de infecciones asociadas con neutropenia inducida por quimioterapia, trombocitopenia inducida
por quimioterapia y anemia inducida por quimioterapia. Los pacientes con VIH / SIDA tambin
pueden ser ayudados por la administracin de HGF recombinantes (Foote, 2008). La
eritropoyetina, una hormona producida por los riones, estimula la mdula sea para producir
glbulos rojos. La eritropoyetina humana recombinante (Procrit, Epogen, Eprex,
NeoRecormon) puede aparecer en diferentes formas: alfa (producido en CHO), beta (producido
en CHO) y gamma (producido en BHK). Este factor de crecimiento recombinante se utiliza en el
tratamiento de la anemia asociada con insuficiencia renal, infecciones por el VIH, ciruga, etc. La
eritropoyetina alfa est dirigida al tratamiento de la anemia por insuficiencia renal crnica,
infeccin por VIH y cncer (Bhopale, Nanda, 2005c). Otro ejemplo es Mircera (beta
metoxipolietilenglicol-epoetina) utilizado para el tratamiento de la anemia asociada con
insuficiencia renal crnica (Fajardo et al., 2010). Por otro lado, Palifermin (Kepivance) es muy
similar a un factor de crecimiento natural que existe en el cuerpo humano, conocido como factor
de crecimiento de queratinocitos (KGF). Kepivance estimula el crecimiento de las clulas,
ayudando a reducir la incidencia, gravedad y duracin de la mucositis oral en pacientes con cncer
sometidos a cuidados intensivos (Hille et al., 2010).

Citocinas

Las citocinas son molculas que activan las clulas inmunitarias (por ejemplo, linfocitos y
macrfagos), regulan el crecimiento y la diferenciacin de las clulas inmunitarias, tambin
importantes mensajeros en las clulas, que influyen en la respuesta en la inflamacin, la respuesta
inmune y la reparacin tisular (Mahmoud, 2007). Las interleuquinas son molculas que actan
como mensajeros de leucocitos, por ejemplo la interleucina-2 estimula los linfocitos T. La
interleuquina recombinante de IL-2, aprobada por la FDA, producida por E. coli, que difiere de la
interleucina natural por la ausencia de alanina en el N-terminal y por el hecho de que la serina se
sustituye por cistena en 125 aminocidos 125, como se ejemplifica en Aldesleucina (Proleucina).
Este frmaco se utiliza en el tratamiento del cncer de clulas renales y su efecto es proporcional a
la cantidad de frmaco recombinante administrado (Bhopale, Nanda, 2005d). Hay otros frmacos
que bloquean la interleucina, por ejemplo, Arcalyst (rilonacept) utilizado para el tratamiento de
CAPS - Cryopyrin Associated Periodic Syndromes. Este frmaco bloquea a un mensajero qumico
llamado interleucina-1-beta e interleucina-1-alfa. Los interferones recombinantes (potentes
citoquinas que actan contra los virus y contra la proliferacin incontrolada de clulas) existen en
tres formas: alfa, beta y gamma, y presentan una amplia variedad de aplicaciones. El interfern
recombinante se utiliza en pacientes con sarcoma de Kaposi, hepatitis B, hepatitis C y cncer de
clulas renales. El interfern recombinante (producido por E. coli que contiene 165 aa) se utiliza
en pacientes con esclerosis progresiva secundaria, porque inhibe la produccin de citocinas Th1 y
activa los monocitos implicados en la respuesta inmune (McCoy et al., 2006) . Ejemplos de
interferones recombinantes son Intron-A, Roferon-A y Actimmume mientras que los
interferones recombinantes incluyen Avonex, Rebif y Betaseron. Por ltimo, el interfern
recombinante (producido por E. coli que contiene 139 a.a.) se utiliza en pacientes con infecciones
asociadas con la enfermedad granulomatosa crnica (Nasihi, 2000),

Enzimas
La dornasa alfa recombinante (formulada en forma de aerosol - Pulmozyme) es una enzima
producida por clulas CHO, utilizada en el tratamiento de pacientes con fibrosis qustica, un
trastorno gentico marcado por excesivas secreciones mucosas y frecuentes infecciones
pulmonares (Bryson, Sorkin, 1994). Otro ejemplo de una enzima recombinante es un activador de
plasmingeno, conocido como alteplasa (Activase), usado para disolver los cogulos de sangre
formados en el sistema circulatorio, que pueden causar ataques cardacos, embolias pulmonares y
derrames cerebrales (Steinberg, Raso, 1998c). Por otro lado, Naglazyme (Galsulfase) es una
forma de enzima recombinante utilizada para el tratamiento de pacientes con mucopolisacaridosis
VI (MPS VI o Maroteaux-Lamy). Esta enfermedad es causada por la falta de una enzima llamada B
arilsulfatasa, requerida en la degradacin de sustancias, conocidas como glicosaminoglicanos
(GAGs). Si la enzima no est presente, el GAG no puede ser degradado y se acumula en las clulas,
causando grandes dificultades de cabeza y movimiento.

Elaprase (idursulfase) es otra enzima producida por procesos biotecnolgicos utilizados en el

tratamiento de pacientes con sndrome de Hunter (los pacientes no son capaces de degradar los
glicosaminoglicanos, que gradualmente se acumulan en las clulas, afectando a la mayora de los
rganos, dificultando la respiracin y caminando) ., 2010). Otro caso de uso de la biotecnologa
para producir frmacos es la produccin de enzimas esenciales en pacientes con sndrome de
Gaucher tipo 1 y 3 (una enfermedad caracterizada por deficiencia de la enzima beta-glucosidasa)
(Kotulak, 1998). Esta enfermedad se caracteriza generalmente por un trastorno neurolgico que
incluye degeneracin mental y convulsiones. Existen algunas terapias eficaces para el tratamiento
incluyendo VPRIV (velaglucerase alfa - una terapia de reemplazo enzimtica derivada de la lnea
celular humana - para el tratamiento a largo plazo de la enfermedad de Gaucher tipo 1), el Protalix
Biotherapeutics (taliglucerase alfa - un recombinante expresado en clulas vegetales
Glucocerebrosidasa), Cerezyme (imiglucerasa - producida por tecnologa de ADN recombinante
utilizando cultivos de clulas de mamferos, CHO) y Zavesca (miglustat - reduce la acumulacin
peligrosa de sustancias grasas en todo el cuerpo mediante la reduccin de la cantidad de
glucosfingolpidos producidos por el cuerpo En pacientes que no pueden ser tratados con terapia
de reemplazo enzimtica) (NGF, 2011).

Una enzima diferente producida utilizando lneas celulares humanas es alfagalsidasa (Replagal).
Esta enzima es una copia de la enzima humana usada en la terapia de reemplazo enzimtico para
la enfermedad de Fabry (enfermedades genticas crnicas y progresivas causadas por la ausencia
o deficiencia de una enzima llamada alfa-galactosidasa A, responsable de la descomposicin de los
lpidos en el cuerpo, Se acumulan en los rganos vitales que causan problemas serios) (Ries et al.,
2006).

Vacunas

Actualmente, las vacunas no slo se desarrollan contra las enfermedades infecciosas, sino tambin
contra el abuso de drogas (nicotina, cocana) y contra las alergias, el cncer y la enfermedad de
Alzheimer. A pesar del xito de las vacunas convencionales, todava existen muchas enfermedades
infecciosas y otras enfermedades crnicas contra las que no existe una vacuna eficaz. Adems, la
creciente resistencia al arsenal existente de antibiticos aumenta la necesidad de desarrollar
vacunas contra infecciones bacterianas comunes. Se espera que se disponga de nuevas vacunas
contra varias enfermedades, y en este caso las tecnologas recombinantes son muy prometedoras
(Jiskoot et al., 2008). Aunque las vacunas producidas convencionalmente son generalmente
inofensivas, algunas de ellas pueden, rara vez, contener contaminantes infecciosos. Las vacunas
cuyos ingredientes activos son antgenos recombinantes no comportan este riesgo leve (Steinberg,
1998a). Las vacunas producidas por tcnicas de ADN recombinante se han utilizado para combatir
el virus de la influenza estacional (Fluarix, Istivac, Fluzone, FluMist, Agriflu, etc.) y la hepatitis
A y B. La primera vacuna contra la hepatitis B fue hecha de plasma derivado de Pacientes con
hepatitis B crnica y una vacuna recombinante cuyo nico ingrediente activo es un antgeno
recombinante la ha reemplazado ahora (Steinberg, 1998b).

Existen tambin otros tipos de vacunas producidas por ingeniera gentica, utilizando la levadura
Saccharomyces cerevisiae para la produccin de HBsAg o introduciendo el gen HBsAg en clulas de
mamferos (Recombivax HB, Engerix B) (Laurence, 1997). La vacuna Ambirix es otro ejemplo de
una vacuna bivalente utilizada para proteger contra la hepatitis A y la hepatitis B (enfermedades
que afectan al hgado) en nios de entre 1 y 15 aos de edad, que no tienen inmunidad a estas
enfermedades. Esta vacuna consiste en el virus de la hepatitis A inactivado (producido en clulas
diploides humanas, MRC-5) y antgeno de superficie de la hepatitis B (producido en clulas de
levadura de Saccharomyces cerevisiae por tecnologa de ADN recombinante). Otro ejemplo de una
vacuna utilizada para proteger contra la hepatitis A y B es Twinrix, que contiene virus de la
hepatitis A inactivados y partes del virus de la hepatitis B como sustancias activas (antgenos de
superficie obtenidos por tecnologa de ADN recombinante) (FDA, 2010). Por otra parte, la vacuna
Myobloc es una vacuna de la toxina botulnica tipo B para el tratamiento de la distona cervical,
producida por fermentacin mediante la bacteria Clostridium botulinum tipo B (Royal, 2003). La
toxina botulnica tipo A (Botox) est indicada para el tratamiento de la distona cervical. El Botox
Cosmetic se utiliza en adultos menores de 65 aos para elevar y fijar la firmeza de los tejidos.
Otro ejemplo de una vacuna producida por ingeniera gentica es Dukoral, utilizado en la
proteccin contra el clera (una enfermedad extremadamente grave causada por V. cholerae, que
se contrae de alimentos o agua contaminados y causa diarrea severa). Esta vacuna contiene
pequeas cantidades de bacterias de clera muertas y una parte de la toxina del clera llamada
"subunidad B" (producida por ADN recombinante) (Steinberg, 1998c). La vacuna Gardasil es
producida por levaduras que han recibido un gen que permite la produccin de la protena L1, y se
utiliza para la vacunacin contra lesiones precancerosas en el rea genital (cuello uterino, vulva y
vagina), cncer cervical y verrugas genitales secundarias a la infeccin causada por Tipos 6, 11, 16
y 18 del Papilomavirus Humano. Adems, la vacuna Cervarix (vacuna recombinante bivalente de
papilomavirus humano - tipos 16 y 18) se utiliza para la prevencin del cncer de cuello uterino y
la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) grado 1 y 2 (FDA, 2010). En marzo de 2009, la FDA aprob
una vacuna llamada Ixiaro (producida en clulas de mamferos, "clulas Vero") con el fin de
prevenir la encefalitis japonesa. Por primera vez en la historia mundial, una pandemia (la primera
pandemia del siglo XXI) tuvo una vacuna especfica producida en un tiempo rcord (Focetria,
Pandemrix, Celvapan). Con esta vacuna, los impactos de esta pandemia se redujeron
drsticamente. La produccin y comercializacin de una vacuna monovalente segura y eficaz para
combatir el virus H1N1, en pocos meses despus de que se considerara una pandemia, fue un hito
importante para la industria farmacutica y para la salud pblica mundial. Otro ejemplo de una
vacuna recombinante se est desarrollando contra el virus Ebola. Esta vacuna es muy importante
porque este virus mata del 50 al 90% de los que infecta (Hoenen et al., 2006). Tambin es
importante mencionar los esfuerzos internacionales para obtener vacunas combinadas contra la
difteria, el ttanos, Haemophilus influenzae tipo B, hepatitis B y polio. Un ejemplo de ello es la
vacuna Infanrix Penta, utilizada en la vacunacin de nios menores de tres aos contra la difteria,
el ttanos, la tos ferina, la hepatitis B y la poliomielitis (Eldred et al., 2006). En 2010, la vacuna
Menveo fue aprobada para inmunizacin activa para prevenir la enfermedad meningoccica
invasiva causada por Neisseria meningitidis (grupos A, C, Y y W-135). En el mismo ao se aprob la
vacuna Prevnar13 para la inmunizacin activa para prevenir la enfermedad meningoccica
invasiva causada por Streptococcus pneumoniae (serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F
y 23f) Nios de 6 semanas a 5 aos) y para la prevencin de la otitis media causada por
Streptococcus pneumoniae (serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) (FDA, 2011). La malaria, el
clera, el herpes, el lupus, la artritis reumatoide, la tuberculosis, el VIH / SIDA, el cncer y las
enfermedades gastrointestinales son enfermedades para las que se espera que se desarrollen
vacunas eficaces. En 1998, los investigadores estadounidenses anunciaron que haban elaborado
patatas genticamente modificadas para producir una "vacuna" contra el clera (Arakawa et al.,
1998). Tambin podemos destacar otras vacunas que estn en el horizonte como varicela, otitis y
enfermedades respiratorias crnicas infecciosas crnicas como la neumona causada por
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo B, virus parainfluenza, rotavirus, Shigella,
Vibrio cholerae y ciertos tipos de Escherichia coli (Marques, 1996).

Anticuerpos monoclonicos

Los anticuerpos monoclonales proporcionan una inmunosupresin dirigida que, cuando se usa
junto con inmunosupresores de mantenimiento especficos, puede permitir

Terapia y puede ser utilizado no slo para la terapia del tumor sino tambin en otras terapias o
diagnsticos. En los ltimos aos, este grupo de frmacos ha experimentado una investigacin
ms extensa, y ha mostrado un futuro muy prometedor, como lo demuestra la cantidad de
medicamentos que ya estn en el mercado. La Tabla II enumera ejemplos de anticuerpos
monoclonales en el mercado para el tratamiento de patologas diferentes (FDA, 2010).

Patentes caducadas

Otro problema que se plantea hoy es la expiracin de los primeros medicamentos patentados
producidos por procesos biotecnolgicos (ejemplos: Intron A, Humulin, Serostim, etc.). La
expiracin de estas patentes biofarmacuticas ha dado lugar a una nueva generacin de molculas
llamadas productos biosimilares (Rosset, 2007). La legislacin europea prev la Directiva 2004/27 /
CE de abril de 2004, segn la cual los productos similares se distinguen del genrico de bajo peso
molecular y deberan considerarse caso por caso (Ronco, 2005). Los productos biosimilares son
ms complejos y menos estables que el genrico de bajo peso molecular, y la eficacia y la
seguridad slo pueden considerarse sobre la base de los ensayos clnicos y preclnicos, incluidos
los datos postcomercializacin / farmacovigilancia (Mellstedt, 2007). Por lo tanto, el "Comit de
Productos Mdicos Humanos" de la EMEA desarroll y public, en 2005 y 2006, directrices
especficas para esta clase de productos que abarcan directrices globales, directrices de calidad,
ensayos no clnicos y clnicos y directrices especficas para clases de productos especficos ,
Necesario para demostrar que los productos biosimilares son seguros y efectivos. El primer
frmaco biosimilar aprobado por la FDA fue Omnitrope (hormona de crecimiento humano
recombinante).

CONCLUSIONES

A partir de procesos biotecnolgicos, se han desarrollado y producido en gran escala nuevas

sustancias con diferentes aplicaciones teraputicas, centradas en la calidad de vida y la salud
pblica. La aplicacin de estas tcnicas abarca una amplia gama de clases de frmacos tales como
antibiticos, factores sanguneos, hormonas, factores de crecimiento hematopoyticos citocinas,
enzimas, vacunas y anticuerpos monoclonales. A pesar de que los beneficios del uso de la
biotecnologa son claramente evidentes, sigue habiendo una serie de preocupaciones y crticas
sobre el uso de algunas tcnicas y procedimientos, aunque ticos, incluyendo la creacin de copias
completas de seres vivos (clonacin) o ambientales, especialmente en la produccin de
Variedades de organismos vivos modificados genticamente, cuyo impacto sobre los ecosistemas
naturales puede nunca ser determinado (Goldstein, Thomas, 2004). La expiracin de los primeros
medicamentos patentados obtenidos por procesos biotecnolgicos ha dado lugar a productos
biosimilares. Las directrices especficas para la aprobacin de estos productos han sido definidas
por las autoridades reguladoras

_________________________

Introduccin

Desde hace varios aos, la ciencia se ha acreditado con el desarrollo continuo de nuevos
medicamentos para tratar o manejar una amplia gama de condiciones mdicas. Las compaas
farmacuticas se han esforzado en producir frmacos con mayor eficacia y perfiles de seguridad
mejorados, al tiempo que mejoran el repertorio teraputico con agentes capaces de satisfacer
necesidades hasta ahora no satisfechas. Tradicionalmente, tales frmacos han consistido en gran
parte de molculas de bajo peso molecular que a menudo eran el resultado de la ingeniera
qumica de un producto encontrado naturalmente. Aos de investigacin han generado
metodologas por las que tales entidades qumicas pueden ser sintetizadas, estructuralmente
caracterizadas y cuantificadas analticamente, llevando, por ejemplo, al establecimiento de
protocolos definidos para predicciones de estabilidad en la vida til, clculos farmacocinticos y
estudios de bioequivalencia. En los ltimos aos, se ha visto la aparicin de una clase totalmente
nueva de agentes teraputicos, que son el resultado de grandes avances logrados en el campo de
la biotecnologa. Los frmacos biolgicos (o simplemente biolgicos), como se conocen estas
entidades, usualmente estn basados en biocompuestos endgenos y consisten en estructuras de
protenas de alto peso molecular o pptidos cortos. En lugar de ser sintetizados qumicamente, los
frmacos biolgicos se producen usualmente mediante tecnologas recombinantes y metodologas
de expresin gnica, es decir, se producen en laboratorios mediante un sistema vivo y son el
producto de vas biosintticas.

La Administracin de Alimentos y Medicamentos (FDA)

Adopta la definicin de la Ley del Servicio de Salud Pblica de los Estados Unidos (Seccin 351) que
establece que un producto biolgico es un "virus, suero teraputico, toxina, antitoxina, vacuna,
sangre, componente sanguneo o derivado, producto alergnico o producto anlogo ... aplicable a
la La prevencin, el tratamiento o la cura de una enfermedad o condicin de los seres humanos ".
1 La Agencia Europea de Medicamentos (EMEA) dirige su propio Grupo de Trabajo Biolgico
(BWP), que funciona bajo el Comit de Medicamentos de Uso Humano (CHMP). El papel principal
del BWP es proporcionar recomendaciones sobre todas las cuestiones relacionadas directa o
indirectamente con los aspectos de calidad y la seguridad en relacin con la calidad de los
medicamentos biolgicos y biotecnolgicos.2 Ms recientemente, el CHMP tambin ha
establecido un Grupo de Trabajo sobre Biosimilares de Medicamentos (BMWP ) Con el mandato
de proporcionar recomendaciones sobre las cuestiones no clnicas y clnicas relacionadas directa o
indirectamente con medicamentos biolgicos similares3. Esta necesidad se ha derivado del hecho
de que, a diferencia de los frmacos convencionales de molculas pequeas, los productos
biolgicos producidos por compaas farmacuticas genricas (biosimilares) pueden Tienen
ingredientes similares y poseen actividades similares al producto autorizado, pero pueden ser
unidnticas debido a diferencias en las metodologas de produccin, tcnicas de expresin gnica,
etc. La compleja estructura tridimensional y las propiedades fisiolgicas, qumicas y fsicas
altamente especficas de estos productos lo convierten en un gran desafo para los genricos
Productores para que proporcionen pruebas para el biosimilari De su producto a la del
originador.4

Acciones de drogas biolgicas

La produccin de biomolculas ha sido ampliamente desarrollada para tratar con contrapartes de

protenas disfuncionales, produccin sistmica deficiente de factores de crecimiento, actividad
desregulada de citoquinas y orientacin molecular. La tecnologa de alto rendimiento disponible
en la actualidad ha sido fundamental en la identificacin de mecanismos moleculares de la
enfermedad con el potencial de dirigirse especficamente a las molculas clave relacionadas con la
condicin. La Tabla 1 muestra una lista no exhaustiva de medicamentos biotecnolgicos que
actualmente estn aprobados por la Administracin de Alimentos y Drogas (FDA) para la terapia
dirigida. La produccin de insulina es el trabajo pionero en biotecnologa. Stanely Cohen y Herbert
Boyer produjeron insulina en 1973 para el tratamiento de la diabetes. El gen humano de la insulina
se aisl y se insert en bacterias para la sntesis de protenas a gran escala.5 Este fue el comienzo
del uso de tecnologa recombinante para la produccin de productos farmacuticos. Otra historia
de xito en el campo de la biotecnologa es la produccin de eritropoyetina (Epo). Epo es una
citoquina que estimula la produccin de eritrocitos en respuesta a una baja tensin de oxgeno.6
La produccin de eritropoyetina humana recombinante (rhEpo) para tratar anemias asociadas con
insuficiencia renal crnica ha demostrado ser altamente efectiva y segura, dando una notable
ventana teraputica. , 8 Las principales preocupaciones relacionadas con la administracin a largo
plazo de Eritropoyetina son la necesidad frecuente de administracin parenteral, el desarrollo de
anticuerpos anti-Epo y el coste del tratamiento. Se desarrollaron agentes estimulantes
eritropoyticos mejorados mediante modificaciones qumicas que aumentan la actividad biolgica.
El anlogo de la rhEPO hiperglicosilado, la darbepoetina alfa contiene cinco cadenas de
carbohidratos unidos a N, dando como resultado un peso molecular incrementado y una carga
negativa mayor. La semivida del suero es 3 veces ms larga que rhEpo y debido al aumento de la
potencia in vivo, la biomolcula puede administrarse con menor frecuencia9,10. Adems, el
pptido mimtico Epo, Hematide , se une al receptor de eritropoyetina y provoca la transduccin
de la seal Dando niveles de hemoglobina normalizados durante un perodo de al menos un mes
despus de una administracin intravenosa.11 Hematide , actualmente en una fase avanzada de
ensayos clnicos, puede ofrecer un cumplimiento mejorado y una mejor relacin riesgo-beneficio.

La hiperglicosilacin es slo un ejemplo de las modificaciones qumicas que se han

Desarrollado para la ventana teraputica mejorada de biotherapeutics. Colonia de granulocitos

Factor estimulante (G-CSF) es otro miembro de la familia de las citoquinas que incluye Epo. El G-
CSF ha sido diseado y producido como un frmaco de biotecnologa para el tratamiento de la
neutropenia y su uso ha aumentado sustancialmente debido a la neutropenia inducida por
frmacos, asociada con la administracin de los agentes quimioteraputicos. El aumento de la
retencin srica y la estabilidad del G-CSF recombinante se ha logrado por PEGilacin, la
conjugacin covalente con el resto polietilenglicol (PEG). Adems del uso teraputico sistmico de
factores y citoquinas, las biomolculas que dirigen clulas especficas y el entorno celular estn
ganando importancia . stos consisten principalmente en anticuerpos con diversas funciones
moleculares. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos Se producen anticuerpos
monoclonales no conjugados para dirigir antgenos / receptores especficos para provocar una
respuesta inmune. El trastuzumab, anticuerpo monoclonal humanizado recombinante, se dirige
especficamente a clulas que expresan el receptor 2 del factor de crecimiento epidrmico
humano (HER2) .13 Despus de la unin, se induce una citotoxicidad mediada por un anticuerpo
dependiente de anticuerpos. HER2 est sobreexpresado en muchos adenocarcinomas, y se
reportan resultados prometedores en adenocarcinomas de mama.14 Es importante clasificar a los
pacientes como HER2-positivos para asegurar respuestas beneficiosas. En linfoma no Hodgkin de
clulas B, el marcador de superficie CD20 est dirigido (Rituximab) iniciando un anticuerpo
dependiente y dependiente del complemento

Cytotoxicity mediada por clulas.

Inhibicin de la unin del ligando

Un anticuerpo monoclonal humano dirigido al receptor del factor de crecimiento epidrmico

(EGFR),

Panitumumab, se une al receptor con alta afinidad, bloqueando receptores mediados

Sealizacin mediante la competencia fuera del ligando natural. Panitumumab inhibe el

crecimiento

Y la supervivencia de las clulas tumorales que expresan EGFR16 y est aprobado por la FDA para
el tratamiento del cncer colorrectal metastsico. Los anticuerpos tambin pueden unirse a
ligandos y prevenir la unin del receptor de ligando. Infliximab se une y bloquea la accin del
factor de necrosis tumoral alfa (TNF). Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimrico
desarrollado en ratones y posteriormente modificado en un anticuerpo humano (humanizado). El
omalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado de IgG1 recombinante derivado del ADN
que se une selectivamente a la inmunoglobulina E (IgE) humana, inhibiendo as la unin de IgE a
receptores de alta afinidad en las superficies de clulas dendrticas, mastocitos y basfilos. Est
indicado para el manejo del asma, ya que reduce directamente la actividad de IgE en la activacin
de estas clulas proinflamatorias. Adems, las clulas portadoras de receptor de IgE generadas de
novo, son

Expuesto a concentraciones circulantes ms bajas de IgE libre, y esto se ha demostrado que da

como resultado una disminucin de la expresin de los receptores de IgE superficiales en estas
clulas. El frmaco se administra de forma subcutnea en dosis repetidas, a pacientes que
satisfacen criterios diagnsticos especficos, y los estudios clnicos han demostrado que esto
resulta en una reduccin significativa de las exacerbaciones del asma.

Los anticuerpos conjugados

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos genticamente manipulados tienen la capacidad de

dirigir las clulas tumorales o el entorno del tumor y facilitar una respuesta dirigiendo un frmaco
quimioteraputico o reclutando el sistema inmune, como se evidencia en estudios preclnicos. La
conjugacin de un agente citotxico a un anticuerpo recombinante da como resultado la unin
especfica del anticuerpo a las clulas diana, seguido por la internalizacin y la administracin del
agente. El frmaco quimioteraputico, Gemtuzumab ozogamicin consiste en un anticuerpo
monoclonal recombinante, humanizado, anti-CD33 unido al agente citotxico calichaemicina. El
anticuerpo se dirige a blastos leucmicos positivos para CD33, seguido por la administracin de
caliqueamicina que se une a la ranura secundaria del ADN causando una ruptura doble del
soporte.17 Las inmunocitoquinas son protenas de fusin que reclutan el sistema inmunitario a las
clulas tumorales como es el caso de las fusiones IL2 con EpCAM Y L19. La protena de fusin
(tucotuzumab celmoleucina) concentra la molcula de interleucina-2 (IL-2) activa en el tejido
tumoral que expresa la molcula de adhesin celular, EpCAM.18 La L19-IL2 es una protena de
fusin compuesta de un fragmento de anticuerpo contra una isoforma de fibronectina presente en
Neovascularizacin.19 Esto permite focalizar la angiognesis. En todos estos casos, la molcula de
IL-2 localizada estimula una respuesta inmunitaria antitumoral de las clulas T citotxicas. El
objetivo especfico de las clulas a travs de la tecnologa de anticuerpos conjugados se prev que
aparezca como un enfoque teraputico biolgico mayor.

Resistencia a agentes teraputicos biolgicos

El uso regular de frmacos convencionales es bien conocido para conducir a menudo al desarrollo
gradual de la tolerancia, y los mecanismos de esto a menudo implican acontecimientos que se
producen en el nivel del receptor. Una distribucin de las eficacias observadas en una poblacin
dada tambin es a menudo evidente, con una proporcin de individuos que a veces no responden
clnicamente a un agente teraputico especfico. Las terapias biolgicas tambin pueden presentar
efectos similares, aunque los mecanismos suelen ser ms complejos.

Los niveles de expresin de protenas

Los niveles de expresin de diversas protenas endgenas pueden ser alterados

En la enfermedad, y pueden influir en la eficacia de los agentes biolgicos teraputicos. La

sobreexpresin de la glicoprotena mucina-4 (MUC4) asociada a la membrana, por ejemplo, puede
enmascarar el receptor HER2 y evitar la unin del trastuzumab. Los experimentos basados en
cultivos celulares han demostrado que el aumento de la sealizacin de los complejos HER2 /
HER3 y HER2 / EGFR en las clulas HER2 + ve contribuyen al desarrollo de resistencia al
trastuzumab.20 La situacin con el interfern- (IFN), utilizado teraputicamente para atacar
varias neoplasias Como la leucemia mieloide crnica (LMC), es ms compleja. El trabajo in vitro
sobre lneas de clulas resistentes a IFN, ha mostrado que estas clulas muestran una expresin
alterada de 39 genes diferentes, que estn implicados en funciones tan diversas como
transduccin de seales, apoptosis, regulacin transcripcional y crecimiento celular.

Adems de su papel directo en la transferencia de varias molculas de frmaco a travs de las

membranas celulares, los transportadores de frmacos, tales como la P-glicoprotena (P-gp),
tambin pueden influir en agentes teraputicos biolgicos a travs de mecanismos indirectos. Las
terapias basadas en factor de necrosis tumoral alfa (TNF) se usan para inducir la muerte celular
(apoptosis) en terapias anticancergenas. Para que estas terapias puedan ejercer su funcin
apopttica, otra familia de protenas llamadas caspasas debe entrar en juego. Se ha reconocido
que la P-gp, que ocasionalmente se sobreexpresa en algunas leucemias y tumores slidos, inhibe
la activacin de la caspasa-3 y, por lo tanto, las vas apoptticas aguas abajo, causando un efecto
clnicamente observado como resistencia a las terapias basadas en TNF.

Variabilidad gentica
La resistencia a las terapias basadas en protenas o pptidos tambin puede surgir de la presencia
de variabilidad del ADN en genes especficos, y varios ejemplos de esto existen en la literatura. De
inters es la asociacin de mutaciones oncognicas en la ruta de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K)
y la resistencia al trastuzumab.23 Esto est en lnea con las observaciones de que la accin del
trastuzumab implica la inactivacin de la va PI3K.24 De ah la caracterizacin de la actividad de la
PI3K Pathway es un panel biomarcador predictivo potencial para la resistencia asociada con el uso
de trastuzumab.

Inmunogenicidad

Todos los agentes teraputicos biolgicos son potencialmente inmunognicos, y los anticuerpos
contra estos agentes pueden ser detectables en algunos pacientes. Por ejemplo, alrededor del 6%
de los pacientes con artritis reumatoide con adalimumab tienen niveles detectables de
anticuerpos contra el frmaco, mientras que en el caso del infliximab, se detectan anticuerpos en
aproximadamente el 11% de los pacientes con AR. El omalizumab, un anticuerpo monoclonal
humanizado recombinante contra la inmunoglobulina E (IgE), ha sido recientemente autorizado
para la terapia antiasmtica . Se han reportado reacciones de hipersensibilidad rara despus del
uso de este frmaco, que incluyen broncoespasmo, hipotensin, sncope, urticaria y angioedema
de la garganta o la lengua. Tales reacciones se han reportado que ocurren tan pronto como
despus de la primera dosis de omalizumab, pero tambin ms all de 1 ao despus de comenzar
el tratamiento administrado regularmente.26,27

Otros mecanismos

A menudo es difcil explicar adecuadamente las causas de la resistencia a los frmacos. Por
ejemplo, los estudios han demostrado que la eficacia de infliximab parece disminuir con el tiempo
con el uso continuo, y esta observacin clnica es evidente despus de 6 meses de tratamiento.

Sin embargo, esto no se ha reportado que ocurra con adalimumab - otro anticuerpo TNF, o
etanercept - un inhibidor de TNF que imita las acciones de los receptores TNF solubles
endgenos. Se ha sugerido que la linfotoxina (LT), un miembro de la familia TNF, que se ha
identificado en el lquido sinovial de los pacientes con AR infliximabresistente, puede tener un
papel en el desarrollo de esta resistencia, pero el mecanismo exacto sigue siendo Elucidated.28

Conclusin
En los ltimos aos se ha observado un rpido crecimiento en el desarrollo de nuevos frmacos
biolgicos, como modalidades teraputicas que ofrecen mejores resultados sobre los
medicamentos convencionales. Estos nuevos componentes de nuestro arsenal teraputico,
obligan a los profesionales de la salud a actualizar la forma en que miran los frmacos, y abre el
horizonte a nuevos potenciales para las metas de la enfermedad y los mecanismos de la accin de
la droga. Su costo relativamente alto en comparacin con los frmacos convencionales de
molculas pequeas an no se ha abordado. De particular relevancia es la baja accesibilidad de
estos frmacos por los pases pobres en recursos (RPCs). El editorial del Journal of Rheumatology
ha pedido que se aplique una estrategia de precios diferente para los productos biolgicos en los
RPCs, junto con la provisin de apoyo para el uso de estas terapias.29 La economa del uso de
medicamentos ms caros debe ser evaluada junto con la proyeccin.

Adems de su papel directo en la transferencia de varias molculas de frmaco a travs de las

membranas celulares, los transportadores de frmacos, tales como la P-glicoprotena (P-gp),
tambin pueden influir en agentes teraputicos biolgicos a travs de mecanismos indirectos. Las
terapias basadas en factor de necrosis tumoral alfa (TNF) se usan para inducir la muerte celular
(apoptosis) en terapias anticancergenas. Para que estas terapias puedan ejercer su funcin
apopttica, otra familia de protenas llamadas caspasas debe entrar en juego. Se ha reconocido
que la P-gp, que ocasionalmente se sobreexpresa en algunas leucemias y tumores slidos, inhibe
la activacin de la caspasa-3 y, por lo tanto, las vas apoptticas aguas abajo, causando un efecto
clnicamente observado como resistencia a las terapias basadas en TNF.

Variabilidad gentica

La resistencia a las terapias basadas en protenas o pptidos tambin puede surgir de la presencia
de variabilidad del ADN en genes especficos, y varios ejemplos de esto existen en la literatura. De
inters es la asociacin de mutaciones oncognicas en la ruta de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K)
y la resistencia al trastuzumab.23 Esto est en lnea con las observaciones de que la accin del
trastuzumab implica la inactivacin de la va PI3K.24 De ah la caracterizacin de la actividad de la
PI3K Pathway es un panel biomarcador predictivo potencial para la resistencia asociada con el uso
de trastuzumab.

Inmunogenicidad

Todos los agentes teraputicos biolgicos son potencialmente inmunognicos, y los anticuerpos
contra estos agentes pueden ser detectables en algunos pacientes. Por ejemplo, alrededor del 6%
de los pacientes con artritis reumatoide con adalimumab tienen niveles detectables de
anticuerpos contra el frmaco, mientras que en el caso del infliximab, se detectan anticuerpos en
aproximadamente el 11% de los pacientes con AR. El omalizumab, un anticuerpo monoclonal
humanizado recombinante contra la inmunoglobulina E (IgE), ha sido recientemente autorizado
para la terapia antiasmtica . Se han reportado reacciones de hipersensibilidad rara despus del
uso de este frmaco, que incluyen broncoespasmo, hipotensin, sncope, urticaria y angioedema
de la garganta o la lengua. Tales reacciones se han reportado que ocurren tan pronto como
despus de la primera dosis de omalizumab, pero tambin ms all de 1 ao despus de comenzar
el tratamiento administrado regularmente.26,27

Otros mecanismos

A menudo es difcil explicar adecuadamente las causas de la resistencia a los frmacos. Por
ejemplo, los estudios han demostrado que la eficacia de infliximab parece disminuir con el tiempo
con el uso continuo, y esta observacin clnica es evidente despus de 6 meses de tratamiento.

Sin embargo, esto no se ha reportado que ocurra con adalimumab - otro anticuerpo TNF, o
etanercept - un inhibidor de TNF que imita las acciones de los receptores TNF solubles
endgenos. Se ha sugerido que la linfotoxina (LT), un miembro de la familia TNF, que se ha
identificado en el lquido sinovial de los pacientes con AR infliximabresistente, puede tener un
papel en el desarrollo de esta resistencia, pero el mecanismo exacto sigue siendo Elucidated.28

Conclusin

En los ltimos aos se ha observado un rpido crecimiento en el desarrollo de nuevos frmacos

biolgicos, como modalidades teraputicas que ofrecen mejores resultados sobre los
medicamentos convencionales. Estos nuevos componentes de nuestro arsenal teraputico,
obligan a los profesionales de la salud a actualizar la forma en que miran los frmacos, y abre el
horizonte a nuevos potenciales para las metas de la enfermedad y los mecanismos de la accin de
la droga. Su costo relativamente alto en comparacin con los frmacos convencionales de
molculas pequeas an no se ha abordado. De particular relevancia es la baja accesibilidad de
estos frmacos por los pases pobres en recursos (RPCs). El editorial de la Revista de Reumatologa
ha pedido una estrategia de precios diferente para los productos biolgicos para ser aplicada en
RPC, junto con la prestacin de apoyo para el uso de estas terapias.29 La economa de la
utilizacin de medicamentos ms caros debe ser evaluado junto con el proyectado La disminucin
de los costos de personal mdico y de atencin mdica y el aumento de la productividad debido a
un menor uso de licencia por enfermedad, una mejor calidad de vida y menos eventos de
jubilacin anticipada por parte de los pacientes. Adems, los frmacos biolgicos se pueden
utilizar a menudo en combinacin con frmacos convencionales, con el fin de optimizar las
respectivas relaciones costo-beneficio.

Innovaciones Recientes en Protenas Teraputicas Recombinantes

Las protenas teraputicas pueden agruparse en tipos moleculares que incluyen: frmacos basados
en anticuerpos, anticoagulantes, factores sanguneos, protenas morfogenticas seas, andamios
de protenas de ingeniera, enzimas, protenas de fusin Fc, factores de crecimiento, hormonas,
interferones, interleucinas y trombolticos. Las protenas recombinantes se producen en bacterias,
levaduras, hongos filamentosos, clulas de insecto, clulas de mamfero, animales transgnicos y
plantas transgnicas. En general, el 39 por ciento de las protenas recombinantes se hacen por E.
coli, el 35 por ciento por las clulas CHO, el 15 por ciento por las levaduras, el 10 por ciento por
otros sistemas de mamferos. La primera protena teraputica humana derivada de la tecnologa
del ADN recombinante fue la insulina humana (Humulin) creada en Genentech, desarrollada por
Eli Lilly, y aprobada por la Administracin de Alimentos y Frmacos de los Estados Unidos (FDA) en
1982. La primera aplicacin teraputica de una protena r producida En clulas de mamfero fue
aprobado en 1986 (activador de plasmingeno tisular humano, tPA, Genentech). Los frmacos
recombinantes de protena han cambiado el paisaje para el tratamiento de muchas enfermedades,
incluyendo muchos tipos de cncer y condiciones reumticas. Adems, el mercado de protenas
recombinantes ha crecido a una tasa media anual del 35% desde 2001, lo que indica un futuro
financieramente slido para la industria biofarmacutica.

Los frmacos basados en anticuerpos son la clase ms grande y de ms rpido crecimiento de

terapias protenicas con 24 frmacos anticuerpos comercializados en los EE.UU. y ms de 240 en
desarrollo clnico. Los frmacos basados en anticuerpos contribuyeron con US $ 38.000 millones
en ventas mundiales de bioproductos protenicos en 2009. Adems, 5 de las 10 protenas
teraputicas ms vendidas en 2009 fueron anticuerpos, a saber, infliximab (Remicade),
bevacizumab (Avastin) , Rituximab (Rituxan y MabThera), adalimumab (Humira) y trastuzumab
(Herceptin). Las terapias de mAb existentes estn basadas en "ccteles" de molculas que
contienen fragmentos de unin de clulas sin o doble sitio que permiten la formacin de dmeros,
cadenas y ciclos. Actualmente, las tecnologas de desarrollo de clulas de mamferos utilizadas por
las industrias biofarmacuticas se basan en la tecnologa de amplificacin de metotrexato (MTX) o
en el sistema de glutamina sintetasa (GS).

Las principales estrategias que se han adoptado para la creacin de productos de segunda
generacin de protenas incluyen reformulacin, pegilacin y otras formas de modificacin, o la
creacin de anlogos con diferentes estructuras de aminocidos. La mayora de estos frmacos
estn destinados a ser ms duraderos en el cuerpo y tener una farmacocintica mejorada (PK),
mientras que todava tienen farmacodinmica similar (PD) como molculas de primera
generacin. El logro de este objetivo puede conducir a propiedades altamente ventajosas tales
como una menor frecuencia de administracin y un mejor cumplimiento por parte del paciente.
Ejemplos de productos altamente comercialmente exitosos incluyen Aranesp de Amgen (un
anlogo de EPO) y Pegasys de Roche (interfern pegilado alfa). Los principales desafos que
enfrenta la produccin de protenas recombinantes son reducir el coste de produccin, mejorar la
productividad tanto en aguas arriba como aguas abajo y obtener un alto ttulo mientras se
mantiene la calidad de los productos.
La industria biofarmacutica mundial tiene actualmente ms de 116 mil millones de dlares y
debera superar los 167 mil millones de dlares en 2015, segn el IMARC. Geogrficamente,
Amrica del Norte representa el mercado ms grande, ya que la mayora de los actores clave estn
domiciliados en Estados Unidos y, por lo tanto, muchos nuevos medicamentos primero se
introducen en estas regiones. En 2010, el Departamento de Productos Farmacuticos (DoP) de la
industria biofarmacutica del Gobierno de India (GOI) tiene como objetivo: convertirse en un
productor mundial lder de productos "biofarmacuticos" asequibles para 2020. Los expertos de la
industria estiman que podra Ser de US $ 319 mil millones en 2020.

Innovaciones Recientes

Los cientficos buscaron las protenas de 17 rganos corporales, incluyendo la corteza frontal del
cerebro, la retina en el ojo, los ovarios, los testculos y ms. Adems, los cientficos analizaron seis
tipos de clulas encontradas en la sangre y siete muestras tomadas de rganos en fetos humanos.
El equipo identific protenas hechas por 17.294 genes. 2.535 de esos genes hicieron protenas
que nunca antes haban sido descritas por la ciencia. 193 de esos genes no se predijo que antes de
la protena de fabricacin de genes en absoluto. Los esfuerzos incluyeron a 72 cientficos de seis
pases: Estados Unidos, India, Canad, Chile, Reino Unido y Hong Kong. El segundo equipo,
formado por 22 cientficos de diferentes institutos de Alemania, encontr nmeros similares,
aunque no exactamente iguales. El equipo alemn encontr protenas hechas a partir de 18.097
genes. Esos genes hicieron 86.771 protenas diferentes. Mapeado, crear una plataforma para la
comprensin de los vnculos genticos con las enfermedades humanas. La bioinformtica superar
la brecha en la evaluacin de los datos entre la funcin de la protena y la expresin en los estados
enfermos humanos. En un futuro prximo, la terapia de protenas para nuevas enfermedades se
crear mediante la combinacin de MAbs y genes. Segn Garca y Calantone, la esencia de la
innovacin puede describirse mejor como: "un proceso iterativo iniciado por la percepcin de una
nueva oportunidad de mercado para una invencin basada en la tecnologa que conduce al
desarrollo, la fabricacin y las tareas de marketing. invencin". As que la etapa se establece para
los cientficos de todo el mundo que ha iniciado el estudio para trabajar en los trastornos de
protenas mediante la alineacin de la funcin de la protena y la caracterizacin de diferentes
rganos y tejidos.En las clulas de mamferos, los medios de cultivo tiene un impacto importante
tanto en el rendimiento y Calidad de las protenas recombinantes. Las clulas de mamferos
requieren una combinacin de componentes nutritivos (por ejemplo, azcares y aminocidos) y no
nutritivos (por ejemplo, metales traza, vitaminas y cofactores) para apoyar el crecimiento celular y
la produccin de protenas. La alimentacin continua y la alimentacin intermitente de la fuente
de carbono en un intervalo especfico es fundamental para la sntesis de protenas. Adems, se ha
demostrado que el medio ambiente de los medios afecta a la glicosilacin de protenas, que es un
aspecto importante de la calidad de la protena e influye en su eficacia como teraputica. La
eficacia de las glicoprotenas recombinantes como teraputica humana depende fuertemente de
sus estructuras de carbohidratos, o glicosilacin. La glicosilacin se ha implicado en la bioactividad,
la unin al receptor y la susceptibilidad a la protelisis, la inmunogenicidad y la tasa de eliminacin
in vivo. Se sabe que dos lneas de clulas de mamfero no pueden considerarse similares, ya que
las protenas son prcticamente muy difciles de copiar. Modificaciones de protenas Los cambios
tales como acetilacin, metilacin, glicosilacin, hidroxilacin, fosforilacin y sulfatacin pueden
reducir la actividad biolgica y causar una heterogeneidad molecular intrnseca que es difcil de
controlar. Adems, la complejidad estructural de la protena concentra el producto final
influenciado por muchas variables, tales como el uso de un sistema de expresin tal como clulas
bacterianas, de levadura y de mamfero, condiciones de crecimiento, procesos de purificacin,
formulacin, almacenamiento y transporte. Las impurezas relacionadas con el procedimiento
pueden aumentar la gravedad de una respuesta inmune a un producto proteico. Bottom-Up
enfoque de modelado matemtico proporciona respuestas celulares a diferentes estmulos, pero
tiene limitaciones debido a la baja recuperacin de pptidos. La espectrometra de masas de
arriba hacia abajo se est convirtiendo en una poderosa tecnologa para el anlisis exhaustivo de
las modificaciones de protenas. El enfoque de arriba hacia abajo permite la identificacin y
anlisis de una red celular completa para la caracterizacin de los mutantes de protena
recombinante y se aplica junto con experimentos de evolucin y mutagnesis.

Para el cultivo de clulas de mamfero, la mejora del proceso requiere un enfoque integrado que
puede lograrse mediante la optimizacin del entorno fsico-qumico del biorreactor. La
optimizacin de las condiciones de cultivo necesita equilibrar el crecimiento celular con la
produccin de anticuerpos. El mtodo ms comn para desarrollar un medio de alimentacin
utiliza medios basales concentrados sin sales (para evitar una alta osmolalidad). Tambin se han
identificado ciertos componentes clave de alimentacin (por ejemplo, fosfato). Durante la
preparacin del medio, puede ser necesario ajustar el pH y la temperatura para disolver
completamente algunos componentes de baja solubilidad. Para optimizar una estrategia de
alimentacin, se debe considerar el consumo de nutrientes, la acumulacin de subproductos y el
equilibrio entre crecimiento y produccin. Los estudios indicaron que los subproductos, tales
como lactato y amonaco, podran ser minimizados manteniendo las bajas concentraciones de
glucosa y glutamina a travs de la alimentacin frecuente. En el avance que proporcion los
detalles del anlisis protemico a gran escala de 6164 protenas agrupadas complementadas por
los datos genmicos de las clulas CHO, el sesgo codn de las clulas CHO, distinto de los seres
humanos

Ha sido descifrado. La accesibilidad de los mtodos en el anlisis de metabolitos en clulas CHO

con datos combinados de genmica, transcriptmica, protemica y metabolmica ahora puede
identificar nuevos genes que afectan el crecimiento y la tasa de produccin de protenas de las
clulas CHO. El xito de la nueva protena proteoltica y el aumento de los anticuerpos basados en
drogas han conducido a la investigacin en andamios de la ingeniera de la protena que estn en
las primeras etapas del estudio y del desarrollo clnico. La alta fermentacin de la densidad celular
es una importante consideracin de la ingeniera del bio-proceso para mejorar el rendimiento
global de protenas recombinantes en E. coli. El desarrollo y diseo del proceso de fermentacin y
el fermentador en s desempean un papel clave para lograr productividad y robustez a escala. El
aumento de la velocidad de aireacin, la alimentacin de aire rico en O2, la disminucin de la
temperatura, el atrapamiento de gas en los medios, la velocidad de la punta, el aumento de la
presin parcial del recipiente de cultivo son algunos de los mtodos empleados para mantener la
condicin aerbica durante el crecimiento celular. Una de las tecnologas significativas
desarrolladas para el crecimiento microbiano y la expresin de protenas recombinantes es el uso
de Tender Coconut Water (TCW) como medio de crecimiento libre de origen animal (AOF) por C-
CAMP, DBT India. La dinmica de escala para cada produccin de protena diferir segn la
velocidad de la sntesis de protena en la clula, la disponibilidad de oxgeno, la estrategia de
alimentacin, la utilizacin de la fuente de carbono, los parmetros operacionales de
fermentacin y la carga metablica. Generalmente, las protenas que son mayores de 100 kD se
expresan en un sistema eucariota, mientras que las que son menores que 30 kD se expresan en un
sistema procariota. El futuro de los biorreactores de un solo uso para la produccin de protenas
recombinantes ser testigo de una revolucin completa con respecto al procesamiento y
aplicacin en una plataforma prodigiosa que implicar la produccin de alto volumen, productos
de alto valor con altos rendimientos en comparacin con los productos de bajo valor de volumen
alto. El reto principal en el biorreactor de un solo uso es el uso de polmeros grado Pharma que
necesita mtodos analticos validados para lixiviables y extrables. Es importante aportar la
flexibilidad en las operaciones de biopharma y analtica con las tecnologas de la plataforma. Las
tecnologas analticas de plataformas pueden simplificar la adquisicin y reproduccin oportuna de
tecnologa por parte de los clientes, que de otro modo pueden suponer un riesgo de retrasos
sustanciales en los proyectos. El coste es otro factor que deber optimizarse durante la produccin
de protenas recombinantes a partir del nivel de I + D. La configuracin de un gran nmero de
bibliotecas de clones a partir de bacterias, levaduras y clulas CHO estn en fase de desarrollo que
estar disponible para la produccin comercial de Protenas recombinantes. Hansenula
Polymorpha se considera como uno de los candidatos prometedores para la produccin de
insulina y la vacuna contra la hepatitis B. En las clulas de levadura, la formacin de los enlaces
disulfuro es eficiente; Sin embargo, la digestin proteoltica de la proinsulina no es posible. En este
caso, la proinsulina se produce y la proinsulina purificada se digiere in vitro con tripsina. El virus de
la hepatitis B no puede propagarse in vitro; Por lo tanto HBs-Ag se produce por expresin
heterloga en levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Hansenula anomala, Pichia pastoris). Segn su
secuencia genmica, se han identificado 8 genotipos (A-H). El genotipo G recin descrito se ha
aislado en los EE.UU. y Francia, mientras que el genotipo H se origina en el sur y Centroamrica. La
inmunizacin activa se basa generalmente en los antgenos HB. (SHBs, MHBs, LHBs, HBc-Ag, o
combinacin de antgenos HBs y HBc). Con la aprobacin de la FDA de la primera inhalacin de
insulina en polvo que estar disponible en 2015, el negocio de la insulina ha escalado nuevas
alturas con nuevas innovaciones que se introducen peridicamente.

Los cientficos estn trabajando para identificar el efecto de la protena de clula husped durante
la produccin de protenas recombinantes. La identificacin y eliminacin de molculas txicas
debido a la contaminacin y la ausencia de protenas de priones es otra rea de preocupacin que
se est abordando en una plataforma global. Los investigadores de Case Western Reserve
University publicaron hallazgos que apuntan a un descubrimiento prometedor para el tratamiento
y prevencin de enfermedades de priones, trastornos neurodegenerativos poco frecuentes que
son siempre fatales. Los investigadores descubrieron que la protena recombinante de priones
humanos detiene la propagacin de priones, los patgenos infecciosos que causan las
enfermedades. Cientficos de todo el mundo estn en el proceso de desarrollar marcadores de
protena de fusin recombinante y protenas de fagos para el diagnstico serolgico de
enfermedades infecciosas humanas y contaminantes. La tcnica de protena de fago recombinante
es una nueva tecnologa en Vidas ya que las protenas de fago se unen eficientemente al receptor
y exhiben una estabilidad extraordinaria. Se utiliza una protena de fago de fibra de cola para la
deteccin de contaminantes. Las nuevas bibliotecas de visualizacin de fagos de pptidos
permiten reunir toda la informacin relativa a los anticuerpos de un paciente para cartografiar la
respuesta humana a las enfermedades y alergias recientes en un solo paso. La tecnologa de la
protemica se est aplicando en el campo de la identificacin y la cuantificacin de la protena en
todas las etapas del desarrollo de la expresin de la lnea celular a la produccin de la protena. El
uso de Proteomics ha conducido al desarrollo de una optimizacin robusta del proceso para
alcanzar la protena recombinante para las fases clnicas de modo de obtener aclaraciones
reguladoras ms rpidas. Biosidus est involucrado en una innovadora iniciativa en el campo de la
biodiversidad conocida como White Genome Project, que tiene como objetivo el aislamiento,
identificacin y caracterizacin de cepas bacterianas antrticas para una posterior secuenciacin
del genoma completo. En colaboracin con la Direccin Nacional del Antrtico, se estn realizando
investigaciones en el aislamiento y caracterizacin de determinados microorganismos del
territorio antrtico especialmente adaptados a temperaturas extremas, que han aislado e
identificado una nueva especie Bizionia argentinesis y han secuenciado su genoma completo . La
investigacin actual se centra en la identificacin y caracterizacin de genes que codifican las
"enzimas activas en fro" para procesos industriales, particularmente en el campo del
procesamiento de alimentos. Frost & Sullivan reconoci MicroProtein Technologies for Technology
Innovation para el desarrollo de su tecnologa propietaria MPTxpress que proporciona un mtodo
de produccin rentable para protenas recombinantes farmacuticamente y diagnsticamente
relevantes, junto con el mayor porcentaje de rendimiento en la industria. MPTxpress ha alcanzado
estos objetivos y tiene el potencial de convertirse en el protocolo de produccin estndar para la
expresin bacteriana en este mercado de USD 2 mil millones. La plataforma utiliza un medio slido
para producir mayores rendimientos de la protena soluble total. Adems de reducir
significativamente los pasos procedimentales para obtener y extraer la protena purificada, la
plataforma de medios slidos es biodegradable. Esto lo convierte en el primer proceso de
produccin de biologics recombinante completamente verde en la industria y deja atrs una huella
de carbono considerablemente ms baja. Los CBD recombinantes (dominios de unin a celulosa)
producidos por E coli y Pichia Pastoris estn ganando importancia como marcadores de afinidad,
andamios y para purificacin de clulas madre hematopoyticas. Las clulas madre
hematopoyticas son el nico tipo de clulas madre que se han utilizado habitualmente para
tratar a los pacientes con cncer de la sangre y trastornos de la sangre y los sistemas
inmunolgicos por HSC transplante. La dificultad para el desarrollo de nuevos tratamientos
utilizando HSCs es la falta de fuente de HSC de suficiente pureza y rendimiento. Como resultado,
se ha dedicado esfuerzo a la purificacin de HSC usando CBD recombinante y expansin ex vivo
que crear biofrmacos de clulas madre para el tratamiento de enfermedades humanas. Los
polmeros de protena manipulados genticamente con secuencia de monmero y longitud de
polmero especficas han proporcionado oportunidades para la utilidad de Estos polmeros en la
administracin de frmacos. El desarrollo de los polmeros protenicos similares a la elastina,
similares a la seda y de seda-elastina ha conducido al estudio en sistemas de administracin gnica
e ingeniera de tejidos.

La primera protena recombinante factor de coagulacin IX que est especficamente indicado

para uso de rutina en la prevencin de episodios de sangrado (profilaxis) ha sido aprobado por
USFDA. Rixubis [Factor de coagulacin IX (Recombinant)] es para uso en personas con hemofilia B
mayores de 16 aos para el control y prevencin de episodios hemorrgicos perioperatorios
(perodo que va desde el momento de la hospitalizacin hasta la ciruga) De descarga), y el uso de
rutina para prevenir o reducir la frecuencia de episodios hemorrgicos (profilaxis). Un trastorno
hereditario de la coagulacin de la sangre que afecta principalmente a los hombres, la hemofilia B
es causada por mutaciones en el gen del factor IX y conduce a la deficiencia del factor IX. La
vacuna contra la tuberculosis asociada al VIH se encuentra en la fase intermedia de los ensayos
clnicos a medida que avanzamos en 2020. Existe una necesidad urgente de desarrollar una vacuna
innovadora contra la tuberculosis con inmunogenicidad que pueda administrarse a pacientes con
VIH. La biologa sinttica es un nuevo campo emergente que trae ingenieros y bilogos para
disear y construir vas de redes biomolculas para aplicaciones farmacuticas. El cido
artemisnico, como precursor hacia la biosntesis de artemisinina, un frmaco antimalrico
importante, se transfiri con xito a E. coli y S. cerevisiae. La planta derivada de kaempferol y
quercetina se sintetizaron heterlogamente en E. coli. La biologa sinttica se est aplicando para
crear varios sistemas biolgicos artificiales como la red gentica sinttica - el interruptor gentico
para producir medicamentos ms baratos. Los desafos son claros y van desde el diseo del
husped hasta la produccin de protenas recombinantes quimricas no naturales. Quality by
Design (QbD) es un nuevo sistema para el progreso de la protena teraputica recombinante que
sostiene una mejor comprensin del producto y su proceso de fabricacin. Las caractersticas de
calidad observadas en las protenas biofarmacuticas incluyen las impurezas y sustancias
relacionadas con el producto, las impurezas relacionadas con el proceso y los contaminantes se
evalan cada uno por su impacto en la actividad biolgica, la inmunogenicidad y la toxicidad. El
impacto de las caractersticas estructurales en las protenas teraputicas es reducir la
inmunogenicidad controlando los atributos crticos de calidad de las protenas. En todo el mundo,
hay ms de 500 productos biolgicos en varias etapas de ensayos clnicos y pre-registro. Pronto
surgirn nuevos grupos de biotecnologa capaces de aprovechar los beneficios que ofrece el
desarrollo de varios tipos de protenas recombinantes. El xito en futuros mercados de protenas
teraputicas requerir tractabilidad, visin y la capacidad de desarrollar productos biolgicos
asequibles para pacientes y mdicos.

Marco normativo
Los productos biolgicos similares se denominan productos bioteraputicos similares (PAS) por la
OMS, biosimilares de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) de la Unin Europea (UE),
productos biolgicos de seguimiento (FOB) (SEBs) por Health Canada. En algunos casos, el trmino
"biosimilar" se ha utilizado de manera inadecuada, por lo que es importante revisar las diferencias
en las definiciones de productos biosimilares en diferentes regiones. La OMS define la PAS como
un producto bio teraputico, que es similar en trminos de calidad, seguridad y eficacia a un
producto bio teraputico de referencia ya autorizado. La India est creando un marco para
introducir autorizaciones de ventanilla nica para proyectos y aprobaciones. Gobierno de la India
est en el camino para abreviar los procedimientos para la importacin y exportacin de
productos biolgicos. El Comit Regional de Manipulacin Gentica (RCGM) junto con el
Departamento de Biotecnologa (DBT) se rene una vez al mes para evaluar proyectos sobre
biolgicos que deben aprobar los proyectos dentro de un calendario especfico planeando reunirse
dos veces al mes. El RCGM y el DBT tienen normas preeminentes de bioseguridad y control de la
contaminacin que los sectores biotecnolgicos deben seguir estrictamente. En la India, las
Directrices sobre Productos Biolgicos Similares fueron preparadas por CDSCO y la DBT estableci
la va de regulacin para similar biolgico alegando ser similar a una referencia biolgica ya
autorizada. CDSCO es la autoridad reguladora nacional en la India que evala la seguridad, la
eficacia y la calidad de los medicamentos en el pas.

Asociacin entre la industria y la academia Un gran nmero de estudiantes trabajan hacia la

ciencia, la biotecnologa, la bioqumica y la ingeniera gentica en todo el mundo. Los avances
continuos se observan en revistas de investigacin, de las cuales menos del 1% se traduce en xito
comercial. La importancia econmica demuestra la importancia de las asociaciones universitarias
con la biotecnologa. Se ha observado que los cursos de Biotech enseados en la orientacin
acadmica son prcticamente diversos de los requerimientos industriales. Pocas industrias de
biotecnologa como Biocon han llegado a un acuerdo con las universidades para establecer un
curso con perspectivas industriales para aspirantes a candidatos. La Asociacin de Empresas
Lideradas en Biotecnologa (ABLE) facilita interacciones fuertes entre la industria y la academia
para explorar oportunidades de investigacin colaborativa y transferencia de tecnologa, as como
desarrollo de recursos humanos a travs de varias plataformas de compromiso. Las industrias
biotecnolgicas deberan tomar la iniciativa de establecer proyectos de investigacin en colegios
de todo el pas que puedan transferir la tecnologa de la escala de laboratorio a la escala de
fabricacin. La adicin de valor creada por la interaccin de la industria acadmica es
incomparable, ya que la industria se beneficiar de la evaluacin tangible creada a travs de
conocimientos y empleados de la industria.

Consejo de Asistencia (BIRAC) a Sector Pblico La Seccin 25 "Sociedad sin fines de lucro" del
Gobierno de la India, registrada bajo la Ley de Sociedades de la India de 1956, ha sido creada como
la agencia de interfaz del Departamento de Biotecnologa. Las industrias biotecnolgicas. Fue
incorporado el 20 de marzo de 2012. .BIRAC se ha creado como un organismo separado para
apoyar la innovacin de productos y proporcionar la infraestructura necesaria y servicios en
diferentes etapas de la cadena de valor para promover la innovacin y el desarrollo de productos.
Los empresarios estn buscando un error mgico que se iniciar la produccin del producto y
llegar al mercado al instante. Esto ha creado la brecha en la comprensin para la fabricacin de
productos biolgicos que necesita incubacin en diversas etapas para la investigacin, ensayos
clnicos, fabricacin y validacin. Adems, estos productos biolgicos deben ser asequibles para un
hombre comn. Los medicamentos se han convertido en una parte integral de la vida humana y
para combatir las enfermedades mortales, tanto existentes como los recin llegados, los
cientficos tendrn que desarrollar una hoja de ruta para los prximos 50 aos. Los fabricantes
farmacuticos tradicionales tendrn que centrarse e invertir ahora para estos futuros productos
biolgicos de gran xito. Ser un desafo para llevar la innovacin, en lugar de la renovacin, para
obtener pura, segura, de alta eficacia, rentable y de alto rendimiento recombinante protenas
teraputicas humanas con calidad al mercado. Como Charles Darwin justamente dijo "Survival of
the fittest" stem cells to treat many problems, from cardiovascular

INTRODUCCIN

La biotecnologa se asocia comnmente con avances histricos en nuevas terapias mdicas para
tratar la hepatitis B, hepatitis C, cnceres, artritis, hemofilia, fracturas seas, esclerosis mltiple y
trastornos cardiovasculares. 1, 2 Los frmacos biotecnolgicos tambin llamados biolgicos, se
fabrican mediante el uso de la vida, en comparacin con los medicamentos convencionales que se
basan en composiciones qumicas. Incluye una amplia gama de medicamentos como las vacunas,
sangre y componentes sanguneos, alrgenos, clulas somticas, terapia gnica , Tejidos y
protenas teraputicas recombinantes creadas por procesos biolgicos.3,4 La clonacin de
material gentico humano y el desarrollo de sistemas de produccin biolgica in vitro ha
permitido la produccin de virtualmente cualquier sustancia biolgica basada en ADN
recombinante para el desarrollo eventual de un frmaco.

Se han utilizado diversas tecnologas para la produccin de

Diversos medicamentos biotecnolgicos.

1.La tecnologa de anticuerpos monoclonales combinada con la tecnologa del ADN recombinante
ha allanado el camino para medicinas personalizadas y especficas.

2.La tecnologa basada en clulas y clulas se est convirtiendo en un nuevo enfoque y est a la
vanguardia de la investigacin biomdica, y puede utilizarse para tratar una variedad de
condiciones mdicas para las que no hay otros tratamientos disponibles.
3. La tecnologa de protenas teraputicas recombinantes es de naturaleza compleja, modifica los
aminocidos, haciendo varios derivados, y se pliega mediante mecanismos complejos. Estas
protenas se hacen en clulas vivas (bacterias, levaduras, lneas celulares animales o humanas).

BENEFICIOS DE LAS DROGAS BIOTECNICAS1, 2

1. La investigacin con clulas madre avanza rpidamente en una

base. Hay pruebas verdaderamente emocionantes del potencial de

UN ENTORNO EN FARMACUTICOS CLSICOS

TENDENCIA DEL MERCADO [FUTURO] 5, 6, 7

El orden mundial de los superproductos pronto podra estar encaminado a una gran agitacin con
los medicamentos biotec de derrocar a los actuales lderes del mercado, Pfizer Liptor y Sanofi
Plavix-ambas entidades qumicas. Con la tendencia emergente de los medicamentos de
biotecnologa acaparando las ranuras superiores contra las entidades qumicas, las compaas
farmacuticas nacionales ahora estn tratando de cobrar en la oportunidad de $ 60 billones de
ms. Un analista afirma que el Avastin de Roche, un anticuerpo monoclonal para el tratamiento
del cncer con ventas globales de casi 9.000 millones de dlares, aliviar el xito de la lucha contra
el colesterol de Pfizer, es decir, Lipitor- La droga ms grande de venta que las redes $ 12 mil
millones anualmente en el presente. De hecho, para el 2014, se estima que por lo menos seis de
los 10 medicamentos vendidos en todo el mundo se inclinan a ser inyectables medicamentos
biotecnolgicos, principalmente para el tratamiento del cncer y la artritis reumatoide como En
comparacin con slo cinco frmacos en 2008 y slo uno en el ao 2000. origen y muchos de ellos
ya estn fuera de patente y otros se espera que vayan fuera de patente en el prximo ao.
Aunque las empresas nacionales indias no pueden exportar a pases desarrollados como los EE.UU.
y el Reino Unido debido a complejas vas regulatorias, pero hay una gran oportunidad
direccionable de los productos de biotecnologa para la industria de la biotecnologa. En el
mercado interior, incluidas las vacunas que hasta ahora no son mil millones.

TENDENCIA DEL MERCADO GLOBAL 5, 6

Despus de completar el largo viaje de los ensayos clnicos de la era prometedora de la medicina
biotecnolgica es poco a poco, poco a poco acercndose a la fruicin. Docenas de nuevos y
excitantes medicamentos biotecnolgicos para el tratamiento de enfermedades como el cncer, el
SIDA, el Parkinson y el Alzheimer estn en el mercado o estn muy cerca de la aprobacin
reglamentaria. En algunos casos, los mdicos ahora estn comenzando a tomar decisiones de
tratamiento basadas en la composicin gentica de un paciente. La investigacin con clulas
madre avanza rpidamente en forma global. En Estados Unidos, el gobierno de Obama relaj las
limitaciones en la financiacin federal de la investigacin con clulas madre que fueron
establecidas por la administracin anterior. En 2009, los Institutos Nacionales de la Salud
establecer nuevas directrices para la financiacin que se ampliar dramticamente el nmero de
lneas de clulas madre que califican para fondos de investigacin de un 21 anterior a 700. Sin
embargo, la investigacin de ciertas clulas madre extremadamente polmicas, Los desarrollados
a travs de la clonacin, no sern financiados con dlares federales. La tendencia mundial del
mercado farmacutico se ha desviado hacia los medicamentos biotecnolgicos y los datos
muestran que para el ao 2010 la industria biotecnolgica ya ha producido ms de 250
medicamentos recetados, cientos de herramientas de diagnstico y pruebas y adems tiene ms
de 400 candidatos en proceso. A partir de los datos anteriores, el nmero de productos
biotecnolgicos aprobados aprobados por ao es variable y la tendencia es ascendente. Los
anticuerpos anticancergenos, en particular, parecen convertirse en la clase teraputica ms
valiosa, justificando una gran poblacin del movimiento de Roche para adquirir su filial
biotecnolgica estadounidense, Genentech. Durante los dos ltimos aos, ha habido varios
acuerdos por MNC para adquirir activos de biotecnologa para

SEGUIMIENTO DE LAS ACTUALES TENDENCIAS DEL MERCADO FARMACUTICO [TENDENCIA DEL

MERCADO INDIO]

Con la tendencia emergente de las drogas de la biotecnologa en el mercado farmacutico indio,

algunas compaas indias tales como Dr. Reddy, Pharmceuticals y Biocon han acelerado su
investigacin en biosimilares. El Dr. Reddy ya tiene un biosimilares en los mercados nacionales, y
uno de sus productos, Reditux utilizado en el tratamiento del linfoma no hodgkiniano, est entre
las 10 principales marcas de la compaa con ingresos anuales de ms de Rs. 24 crore. La
compaa tambin est trabajando en cuatro biosimilares, uno de ellos est en la ltima etapa de
los ensayos clnicos. Del mismo modo, el genrico principal Cipla estar pronto lanzando su primer
producto biosimilar para 2012-13. Planea invertir $ 65 millones en dos empresas biotecnolgicas
durante los prximos tres aos para fabricar anticuerpos monoclonales. Aproximadamente el 10-
15% del mercado farmacutico mundial est compuesto por frmacos de biotecnologa que
aumentan su cartera de productos biolgicos, como la adquisicin de Wyeth por parte de Pfizer y
el acuerdo del arado Merck Schering. Los expertos dicen que el creciente dominio comercial de los
productos biolgicos a nivel mundial representa una oportunidad para las empresas nacionales.
Glenmark tampoco se queda atrs. Ha establecido un centro de investigacin biolgica en Suiza y
tiene dos productos sometidos a ensayos. Mientras que GBR 500 est en fase de ensayo en los
EE.UU., es el segundo producto NBE GBR600 est aprobado para el ensayo de fase 1 en Europa.
Ambos tienen pico de oportunidad de ventas de alrededor de $ 2billion cada uno si se
comercializa. Es cuestin de tiempo antes de que ms empresas nacionales traten de cobrar
dinero en este creciente mercado, que ahora promete muchos tratamientos ms nuevos. A pesar
de los avances exponenciales en el conocimiento biofarmacutico y la tecnologa, las empresas de
biotecnologa que soportan la tarea de conseguir nuevos medicamentos al mercado siguen
enfrentando largos plazos, costos desalentadores e inmensos riesgos. Debido a esta razn, en los
EE.UU. el gobierno de Obama haba aprobado BPCI ACT: La Ley de Biologics Price Competition and
Innovation de 2009 (Ley BPCI) fue una enmienda a la Ley de Servicios de Salud Pblica (PHS Act)
para crear una va de aprobacin abreviada para biolgicos Productos.

FACTORES MUNDIALES PARA MEJORAR EL MERCADO BIOTECNOLGICO:

Diversas razones se pueden alistar para alzar las tendencias de la venta de los medicamentos de la
biotecnologa en el mercado farmacutico que son como sigue:

1. Principales empresas farmacuticas estarn fuera de patente en2014

: Su cambio esperado puede deberse al hecho de que muchos frmacos importantes, incluidos los
actuales vendedores ms vendidos Nexium, Lipitor, Plavix, Advair y Diovan, han
desaparecido recientemente de patente, o lo harn en un futuro prximo, que ser Un impulso
significativo a los fabricantes genricos que rpidamente emitirn sus propias versiones de bajo
precio. La asociacin PhRMA de la industria farmacutica estim recientemente que el 72% de las
ventas por volumen de sus miembros son medicamentos genricos. IMS Health estim que las
ventas de medicamentos genricos representaron casi dos tercios de todas las recetas vendidas en
Amrica en 2009, en volumen, pero los precios son tan bajos que representan slo una dcima
parte de los ingresos.

2. Boon para los pacientes mayores: Los pacientes mayores que reciben tratamiento biolgico
para enfermedades como la artritis reumatoide, la artritis psorisica o la espondilitis anquilosante
estn en mayor riesgo de infeccin potencialmente mortal, eventos cardiovasculares adversos y
malignidad. Sin embargo, debido a que otras terapias son a menudo ineficaces, la terapia biolgica
debe ser considerada para algunos de estos pacientes.

3. Amplias inversiones en investigacin de las principales firmas farmacuticas: Como se mencion

anteriormente, muchas de las principales firmas farmacuticas van a aumentar su cartera
biolgica y tienen un seguimiento rpido de su investigacin o actual lder del mercado para
beneficiarse de su asociacin (asociacin) o adquisicin de empresas biotecnolgicas , Como la
adquisicin de Wyeth por parte de Pfizer

4. Inversin agresiva en la investigacin biotecnolgica en Singapur, China e India: No slo los

pases occidentales, sino tambin los pases asiticos tambin estn tratando de aumentar la
investigacin biotecnolgica en su pas, a menudo con el patrocinio del gobierno como el gobierno
indio est demostrando fondos a muchos laboratorios CSIR y centro educativo como IIT.
Departamento de Biotecnologa es un organismo autnomo del Gobierno de la India que
principalmente se ocupan de la investigacin de la biotecnologa en la India.
5. Investigacin prometedora en biologa sinttica y progreso informtico continuo en reas de
biotecnologa: Muchos estudios de bioinformtica se llevan a cabo para la secuenciacin de genes,
el programa de descubrimiento de frmacos, para buscar nuevos receptores de frmacos,
produciendo frmacos adaptados que actan especficamente sobre el objetivo

CONCLUSIN

En el escenario cambiante del mercado de las ciencias de la vida, la teora de Darwin, es decir,
"supervivencia del ms apto", es exacta porque los datos muestran que en los prximos aos las
drogas son el claro ganador del mercado farmacutico y los grandes pistolas como Pfizer, Cipla,
Roche, Glenmark Que son los lderes en frmacos de la fraccin qumica, ahora estn comenzando
a aumentar su perfil biolgico ya sea por el rpido seguimiento de sus reas de investigacin o por
tomar los beneficios de su asociacin (asociacin) o la adquisicin de empresas de biotecnologa.
Despus de completar el largo viaje de los ensayos clnicos de la medicina biotecnolgica es
lentamente, poco a poco acercndose a la fruicin y este cambio se espera en el mercado
farmacutico, ya que estos medicamentos son alternativas a muchas enfermedades incurable.

____________________________-

1. Introduccin

Los productos biofarmacuticos son reactivos clnicos, vacunas y Frmacos producidos utilizando
la biotecnologa moderna para el diagnstico in vivo, Preventivos y teraputicos. El primer
recombinante aprobado Protena, insulina, se produjo a principios de 1980. Desde su xito Entrada
en el mercado, la Administracin de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA)

Ha aprobado ms de 100 nuevas terapias de protenas recombinantes, Incluyendo varios

anticuerpos monoclonales notables (Mabs) y ms De 300 productos biofarmacuticos no
recombinantes, como las vacunas Y productos sanguneos (www.fda.gov, Rader, 2010). El ADN
recombinante y las tecnologas de hibridoma se utilizan para Sistemas biolgicos para producir 1)
formas recombinantes de Protenas (incluyendo hormonas de crecimiento humano, citoquinas e
insulina),

2) derivados de protenas naturales y sistemas vivos (incluyendo protenas Mutenas, vacunas de

tipo viral, vacunas de clulas cancergenas, inmunotoxinas, Y protenas de fusin de IgG), 3)
vectores vricos, vectores plasmdicos,

Y pequeos ARN interferentes que llevan genes o informacin gentica Para la vacunacin o
terapia gnica, y 4) diagnstico in vivo y teraputico anticuerpos monoclonicos. La industria
biofarmacutica ha Se ha desarrollado rpidamente con aumentos anuales del 10-20% en los
ingresos En todo el mundo (Global, 2008, Huang, 2005, Junker, 2007, Mammalian,
Http://www.researchandmarkets.com, 2005; Matasci y col., 2009). De Los 27 ms recientes (enero
2008-junio 2011) aprobado por la FDA biofarmacutica Entidades (Tabla 1, www.fda.gov), 18 son
protenas recombinantes fabricadas Utilizando clulas, organismos o animales. Los otros 9 son
vacunas Y productos teraputicos fabricados a partir de fuentes de productos naturales tales
como Plasma humano, tejido, clulas cancerosas, virus atenuado y bacterias.

Entre los 18 productos recombinantes, 12 se producen usando mamferos Sistemas de expresin,

3 son producidos por Escherichia coli (E. coli), y Los 3 restantes son producidos por baculovirus,
levadura y transgnicos Cabras Esto indica que los sistemas de expresin de mamferos son los
dominantes Eleccin para la fabricacin biofarmacutica. Adems, con En relacin con el impacto
econmico de los productos biofarmacuticos Productos (Cuadro 2), dos tercios de los ingresos
Proceden de productos fabricados con sistemas de mamferos, Slo un tercio proviene de
microorganismos, como E. coli y levadura. Esto demuestra claramente la preeminencia de la
expresin mamfera Sistemas en la empresa de produccin biofarmacutica contempornea. Los
productos biofarmacuticos se fabrican con microorganismos (Shiloach y Rinas, 2010, Zhang y An,
2010), lneas celulares animales Criterios de identidad, pureza, potencia y seguridad segn se
requiera Por las agencias reguladoras farmacuticas (Pogue et al., 2010). Microbiano Sistemas,
especialmente E. coli, tienen la ventaja de un bajo costo para establecer Una cepa de produccin,
ciclo de produccin rpido, control fcil en proceso, Y alta productividad en comparacin con los
sistemas de expresin de mamferos. Sin embargo, existen varias limitaciones para los sistemas
procariotas como E coli. La expresin de una protena compleja grande que contiene subunidades
mltiples, Cofactores, enlaces disulfuro y modificaciones postraduccionales Es un desafo bastante
(Mahmoud, 2007), ya que el posttranslacional La maquinaria metablica slo est disponible en
clulas de mamferos (Butler, 2005; Zhang, 2010). Muchas protenas recombinantes, para el
instante, Tissue Activador de Plasmingeno (tPA) y Eritropoyetina (EPO), necesitan Modificacin
postraduccional tal como la glicosilacin para su (Sasaki et al., 1987). Asimismo, la glicosilacin de
Mab es importante Para la funcin biolgica ptima y la farmacocintica (Beck et al., 2008,
Jefferis, 2005).

Ms del 50% de las protenas teraputicas aprobadas y en el mercado se producen utilizando

clulas de mamferos, principalmente debido a la capacidad de las clulas de mamferos para
sintetizar protenas que son similares a los que se producen naturalmente en seres humanos con
respecto a las estructuras moleculares y propiedades bioqumicas. Recientemente, la
productividad de las clulas de mamfero cultivadas en biorreactores ha alcanzado 10-15 g / L en la
produccin de protenas de fusin Mab y Fc (Huang et al., 2010), que result principalmente de
mejoras en el desarrollo de la lnea celular mediante mtodos de seleccin eficaces, Optimizacin
de medios y control de procesos. Se han realizado muchas revisiones sobresalientes (Birch y
Racher, 2006, Geisse y Fux, 2009, Wurm, 2004, Zhang, 2010) que resumieron el desarrollo de la
expresin de protenas de clulas de mamferos para la produccin biofarmacutica. Adems,
Zhang proporcion una descripcin detallada del sistema de expresin de mamferos con
informacin sobre las lneas celulares, el medio y el desarrollo del proceso (Zhang, 2010). Los
sistemas de expresin de anticuerpos monoclonales incluyen tpicamente marcadores selectivos
de glutamina sintetasa (GS) y dihidrofolato reductasa (DHFR) usados comnmente para amplificar
clulas transfectadas como se resume (Birch y Racher, 2006). Cacciatore (Cacciatore et al., 2010)
revisaron la amplificacin gnica y la ingeniera de vectores para lograr una produccin
teraputica teraputica rpida y de alto nivel, con nfasis en el sistema de seleccin DHFR. La
glicosilacin de protenas fue revisada por Hossler (Hossler et al., 2009). Los avances tecnolgicos
en los sistemas de produccin de Mab fueron descritos por Rodrigues et al. (2010). Esta revisin se
enfocar en los ltimos avances en el campo, especialmente en reas activas tales como sistemas
de expresin, factores de impacto de glicosilacin y expresin transitoria de genes.

2. Expression system

Most marketed biopharmaceutical products have been produced in Chinese hamster ovary (CHO)
cells, murine myeloma lymphoblstoidlike (NS0 and Sp2/0-Ag14) cells, Human Embryonic Kidney
293 (HEK 293) cells, and baby hamster kidney cells (BHK-21) (Birch and Racher, 2006; Meyer et al.,
2008; Walsh, 2006; Zhang, 2010). Various expression systems have been investigated to enhance
the production in mammalian cells. Vast improvements have been made in the last two decades in
vector design and construction, codon optimization, gene amplification approaches, host cells,
transfection methods, and screening tools (Aldrrich et al., 2003; Birch and Racher, 2006; Jalah et
al., 2007; Wurm, 2004; Zhang, 2010). Of the many available systems, two have been commonly
used: CHO cell lines for recombinant proteins and Mabs and murine myeloma (NS0 and Sp2/0) cell
lines for Mabs (Zhang, 2010). Improvement of mammalian expression may be achieved through
proper vector design including using strong promoter, proper signal peptide, selected introns,
product gene codon optimization (Jalah et al., 2007) and use of transcription control regions (Deer
and Allison, 2004). Common approach used in generating cell lines for the production of
therapeutic proteins relies on gene amplification induced by a selective marker such as
dihydrofolate reductase (DHFR) (Solomon et al., 2003) or glutamine synthetase (GS) (Bebbington
et al., 1992; Birch and Racher, 2006). To achieve high levels of gene expression, vectors usually
have strong promoters such as cytomegalovirus (CMV) promoter to drive high level messenger
RNA transcription (Deer and Allison, 2004). Codon optimization for the target cell type, GC/AT
ratio balancing, and signal sequence optimization have been shown to accelerate mRNA
processing and improve secretion (Jalah et al., 2007). Besides, gene-targeting technology,
chromatin opening elements and attachment regions have been incorporated into vector
optimization to improve final product production (Cacciatore et al., 2010).

2.1. PER.C6 cell line

The retina-derived Per.C6 cell line, a human cell line with human glycosylation and other post-
translational modification machinery, has been quite attractive to the biopharmaceutical industry
for producing therapeutic proteins and Mabs. This cell line requires no gene amplification or
selection marker. High producing stable clones can be developed within a few months. A low copy
number is sufficient to retain stable and efficient protein expression. The cell line has
demonstrated its capacity of producing N2 g/L of recombinant protein in fed-batch culture (Zhang,
2010). A very high production titer of 25 g/L associated with a very high cell density (N150 million
cells/mL) has been achieved using the eXtrem-Density (XD) continuous process. In this process,
both cells and product are retained in a stirred-tank bioreactor using a suspension culture of
PER.C6 (Schirmer et al., 2010). Recently PER.C6 was used to express multiple antibodies in one cell
(Kruif et al., 2010). The cells were transfected with a combination of plasmids containing genes
encoding three different antibodies with identical light chains. Triple positive clones were
identified. Stable clones were selected through dilution cloning and stability testing. Volumetric
IgG productions up to 387 mg/L IgG and specific productions up to 24 pg/cell/day were reached,
which are compatible to a single IgG and IgMbatch production as reported (Yallop et al., 2008).

2.2. UCOE Expression System

Gene amplification methodologies are frequently employed for the generation of large quantities
of recombinant proteins in mammalian cells. Current expression systems rely on screening a large
number of clones. Due to substantial variation and unpredictable stability of expression amongst
transfected cells however, extensive clone screening is required to identify suitable high producers
(Nair et al., 2011; Pilbrough et al., 2009). Although these systems usually guarantee very high
yields, they are also very time-consuming. In addition, due to the large genomic rearrangements
that frequently occur with amplification, the resulting high-producing clones can be unstable. The
instability of a cell line may involve silencing of the exogenous gene resulting from modifications
such as methylation of CpG DNA sequences (Zhang et al., 2010), histone deacetylation and
chromatin condensation (Kim et al., 2011).

Se estableci el uso de fragmentos de isla CpG no metilada procedentes de genes de limpieza,

denominados elementos de apertura de cromatina omnipresentes (UCOE) en vectores de
plsmidos para aumentar la estabilidad de la expresin de transgenes (Benton et al., 2002; Nair et
al. Al., 2011, Zhang, 2010). Los vectores UCOE contienen elementos de revelado de cromatina no
especficos del tejido que permiten la expresin rpida de una protena de una manera
independiente de la integracin. Se puede derivar una expresin eficiente a partir de una nica
copia de un sitio de gen integrado que da como resultado un mayor porcentaje de clulas que
expresan el gen marcador en el grupo seleccionado en comparacin con los vectores que no
contienen UCOE estndar (Benton et al., 2002). La tecnologa UCOE es potencialmente una
herramienta til para la produccin rpida de protenas. Se inform inicialmente que en
combinacin con una lnea celular madre libre de suero y adaptada a la suspensin, se puede
conseguir una produccin rpida de ms de 300 mg de protenas de un anticuerpo recombinante
en menos de 1 mes a partir de las agrupaciones de transfeccin en matraces de agitacin (Benton
et al. 2002). Recientemente, cuando UCOE se incorpor en los vectores de expresin, se
encontraron muchos ms transfectantes con mayores niveles de expresin (Ye et al., 2010).
Usando una piscina de transfeccin de varios clones de una sola transfeccin para producir
grandes cantidades de protena teraputica, UCOE mejor el rendimiento 6 veces aumentando la
porcin de altos productores en la poblacin mixta. Otra optimizacin a travs de combinaciones
de promotores de UCOE puede dar como resultado una expresin ms alta que la del promotor de
CMV (Nair et al., 2011).

2.3. Segmentacin de genes

La integracin aleatoria que une la amplificacin genmica se usa ampliamente para generar
lneas celulares deseadas para una expresin estable de alto nivel de protenas recombinantes. El
nivel de expresin es impredecible debido a la ubicacin aleatoria de la integracin. Se ha
estudiado una secuencia de reconocimiento de recombinasas especfica de sitio, Flp / FRT, para la
orientacin de genes (Huang et al., 2007, Raymond y Soriano, 2007, Zhou et al., 2007, 2010). Se
ensayaron varias protenas, activador del plasmingeno tisular (tPA), fosfatasa alcalina secretada
(SEAP) y eritropoyetina (EPO) con el procedimiento de seleccin de genes y algunas de ellas
mostraron una alta expresin constante (Zhou et al., 2007, 2010). Una lnea celular estable
generada por la integracin especfica del sitio fue capaz de alcanzar productividades a 17,1 p / c /
d (Zhou et al., 2007). Utilizando un enfoque similar, se produjo anticuerpo anti-CD20 a 200 mg / L
(Huang et al., 2007). Otro sistema de recombinacin conocido como el sistema C31 tiene una
ventaja de dos sitios de integracin (Cacciatore et al., 2010) en los que la integracin es
irreversible. Un ejemplo exitoso fue que se encontr que la expresin de luciferasa era 60 veces
mayor usando este sistema de recombinacin en comparacin con la transfeccin aleatoria
(Thyagarajan y Calos, 2005). Para mejorar el proceso de transfeccin, se ha considerado el uso de
cromosomas manipulados. Se ha utilizado un sistema de expresin cromosmica artificial (ACE)
para la transfeccin dirigida de clulas que contienen cromosomas artificiales basados en
mamferos con mltiples sitios aceptores de recombinacin. Este sistema ACE permite la
transfeccin especfica de copias de un solo gen mltiple y elimina la necesidad de integracin
aleatoria en cromosomas de huspedes nativos. La utilidad de utilizar cromosomas artificiales de
mamferos, especficamente el Sistema ACE, se ha demostrado en varios estudios de casos que
cubren la generacin de lneas celulares CHO que expresan anticuerpos monoclonales (Kennard,
2011). Se ha demostrado que elementos transponibles tales como piggyback (PB) y belleza
durmiente apoyan la integracin de genes recombinantes en clulas de mamferos cultivadas
(Ding et al., 2005, Wu et al., 2006). Las lneas de clulas CHO recombinantes que expresan una
protena de fusin del receptor de factor de necrosis tumoral-Fc se generaron basndose en la
integracin de transgenes mediada por el transposn PiggyBac (Matasci et al., 2011) para
demostrar que los grupos de clulas transpuestas producan hasta cuatro veces ms protena
recombinante que los grupos generados por Transfeccin estndar. Estas lneas celulares
mostraron una expresin estable durante hasta 3 meses en ausencia de seleccin (Matasci et al.,
2011).

2.4. Otros avances

La expresin de alta eficiencia regulada a travs del fago lambda PL se ha utilizado comnmente
en el sistema de expresin de E. coli. La actividad promotora de PL es totalmente reprimida a baja
temperatura por un producto represor termolbil del gen cI1857, y puede activarse por induccin
de calor (Remaut et al., 1981). No se informaron promotores similares sensibles a la temperatura
con un sistema de expresin de mamfero hasta la publicacin reciente por Thaisuchat et al.
(2011). Un promotor gentico nuevo, endgeno y altamente activo obtenido a partir de clulas
CHO muestra una expresin gentica inducible condicionalmente a temperatura reducida
(Thaisuchat et al., 2011). Tras un cambio a 33 C, se logr un aumento de la productividad basal
de dos a tres veces mayor. La regin promotora S100a6 (calciclina) y sus regiones flanqueantes se
identificaron a partir de una genoteca de fago lambda CHO-K1 genmico. Se mostr superior a la
actividad del promotor SV40 con potencial aumentado an ms por la duplicacin de una
secuencia promotora de ncleo (222 pb) (Thaisuchat et al., 2011). Esta propiedad es
particularmente ventajosa para procesos con expresin reducida durante el crecimiento celular
inicial seguido de un refuerzo en la expresin durante la fase de produccin a baja temperatura
(Thaisuchat et al., 2011)

Un proceso simplificado para amplificar el sistema de expresin DHFR fue Informado como
optimizado a travs del acoplamiento de la adaptacin de codones Con amplificacin gnica
(Kotsopoulou et al., 2010). Como resultado, la expresin La saturacin se puede lograr
rpidamente, en tan slo 5 nM MTX, con un esfuerzo mnimo y sin comprometer los rendimientos
finales (Kotsopoulou et al., 2010).

Los vectores lentivirales (LVs) derivados de la inmunodeficiencia humana Virus de tipo 1 (VIH-1)
han sido ampliamente utilizados en aplicaciones de genes Debido a su transduccin eficiente
(Wiznerowicz y Trono, 2005). La transferencia de genes mediada por LV proporcion una
alternativa eficiente A la transfeccin del plsmido. Recientemente, un mtodo La rpida
generacin de lneas celulares CHO recombinantes de alta produccin (Oberbek et al., 2011).
Receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) La protena de fusin Fc se expres a un nivel de 50
- 250 mg / l en Una cultura de 4 das.

La tecnologa de interferencia de ARN (RNAi) se ha convertido en una novedosa herramienta para

silenciar la expresin gnica en clulas (Maliyekkel et al., 2006; Tiscornia et al., 2004; Wu, 2009).
La DHFR se enfoc en el silenciamiento, resultando en clones de mayor produccin con una
expresin ms estable en ausencia de MTX (Hong y Wu, 2007). Para reducir la formacin de
lactato, la lactato deshidrogenasa-A (LDH-A), una enzima que cataliza la conversin de piruvato
derved de glucosa a lactato, fue regulada negativamente por un vector de expresin de RNAS
interferente pequeo (siRNA) en clulas CHO que producen trombopoyetina humana HTPO). Las
actividades de LDH-A se redujeron en un 75-89% en comparacin con las de las clulas CHO de
control (Kim y Lee, 2007). El efecto del siRNA es ms significativo que el de otros mtodos como la
recombinacin homloga y el mRNA antisentido (Kim y Lee, 2007). Potencialmente, los enfoques
pueden ser aplicados en cuanto a la expresin de genes asociados a la apoptosis en silencio, la
expresin de genes asociados a la glicosilacin de protenas, el gen del metabolismo celular que
involucra la lactato deshidrogenasa y otros genes usados para la amplificacin gnica. Sin
embargo, todos ellos pertenecen al enfoque de focalizacin nica y dependen en gran medida de
la identificacin del gen diana crtico para regular a la baja. Slo entonces se puede utilizar el
silenciamiento para influir de forma estable en las funciones celulares a travs de la regulacin a la
baja de la expresin de la protena diana en clulas de mamferos (Wu, 2009). Los futuros
enfoques de RNAi se pueden extender para silenciar mltiples objetivos involucrados en
diferentes vas celulares para cambiar la regulacin gentica global en las clulas, as como los
objetivos relacionados con las tomicroRNAmoguculas para la autorregulacin celular (Wu, 2009).
Las clulas CHO deficientes en DHFR han sido las clulas husped ms comnmente y con xito
utilizadas en la industria biofarmacutica durante los aos. Se ha observado una reciente
observacin de que diferentes clulas CHO deficientes en DHFR (CHO-DG44 y CHO-DuxB11)
muestran un crecimiento deficiente en cultivos discontinuos alimentados incluso en medio
suplementado con HT, mientras que las clulas productoras de anticuerpos derivadas de estos
huspedes lograron menos 2- 3 veces ms alta densidad de clulas pico. Puede estar asociado con
una consecuencia directa de la deficiencia de DHFR (Florin et al., 2011). El monitoreo temprano de
la calidad del producto debe ser una parte esencial del desarrollo de la lnea celular de produccin.
Muchos factores, particularmente la eleccin de la lnea de clulas husped, tuvieron un efecto
significativo sobre la calidad global del producto. Los resultados de la expresin de CNTO736, un
pptido similar al glucagn-1-MIMETIBODY mostraron que el producto expresado en las lneas
celulares del husped del mieloma de ratn tena un menor grado de degradacin proteoltica y
variabilidad en la glicosilacin ligada a O comparada con la expresada en las lneas celulares CHO.
La eleccin de un clon especfico derivado de CHOK1SV tambin tuvo un efecto sobre la calidad
del producto. En general, las molculas que presentaban un recorte N-terminal mnimo tenan un
nivel aumentado de glicosilacin unida a O en la regin de unin, dando crdito a la hiptesis de
que la glicosilacin ligada a O acta para proteger contra la degradacin proteoltica. Adems, los
productos con un potencial reducido para el recorte N-terminal tenan una semivida srica in vivo
ms larga (Dorai et al., 2009a).

2.5. Un estudio de caso para el diseo y la optimizacin de la construccin

La optimizacin de la expresin de protenas puede ser un proyecto integral

Que implica la seleccin de un sistema de expresin, la eleccin de un

Expresin de lnea celular y diseo de construccin incluyendo promotor,

Secuencia de seal de plomo, optimizacin de codones y regiones no traducidas.

Se puede diseccionar un ejemplo de expresin de citocina interleucina-15

Para ilustrar el diseo constructivo y la optimizacin de la expresin.

El proceso de diseo de este caso es aplicable a otra expresin

Sistemas.

La interleucina-15 humana recombinante (rhIL-15) tiene una funcin biolgica notable en la

promocin de la activacin y proliferacin de clulas NK y T, as como en el aumento de la
inmunidad antitumoral de clulas T CD8 + en modelos preclnicos (Klebanoff et al., 2004; 'Mac'
Cheever, 2008, Teague et al., 2006). Un ensayo clnico de fase I para evaluar la seguridad,
dosificacin y eficacia antitumoral de la IL-15 en pacientes ha comenzado en el NIH. Aunque la
expresin de rhIL-15 en clulas de mamfero se intent, el material para ensayos clnicos se hizo a
partir de E. Coli. La expresin mamfera de rhIL-15 es altamente deseable, ya que puede
representar la forma natural de la citoquina y poseer una vida media ms larga en el sistema de
circulacin y / o menos inmunognica. Los vectores de expresin transitorios eficaces para IL-15 se
desarrollaron combinando la optimizacin de ARN / codn y la modificacin del pptido seal
largo nativo de IL-15. Estos cambios dieron como resultado niveles elevados de citoplasma del
ARNm optimizado y ms de 100 veces la produccin mejorada de protena IL-15 humana
secretada (Jalah et al., 2007). Aunque los resultados todava se limitan al uso en laboratorio y no
son factibles para la fabricacin clnica, el principio de diseo de la construccin, incluyendo la
optimizacin de la codificacin mediante el aumento del contenido de GC, la remocin de
potenciales sitios de empalme y la optimizacin de la secuencia lder se aplica a todos los sistemas
con expresin de mamferos. Los componentes bsicos de los vectores utilizados son el promotor
CMV, el sitio de poliadenilacin de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y el gen de resistencia
a la kanamicina (Jalah et al., 2007). Un marco de lectura abierto de IL - 15 humana de tipo salvaje y
un pptido seal largo nativo de lder se insertaron en aguas abajo del promotor de CMV (Tabla 3).
Mediante la insercin de un elemento de transporte constitutivo de 173 pb (CTE) entre la
secuencia codificadora de IL-15 y la seal BGH, se duplic la expresin (Tabla 3). La optimizacin
de codones adicionales incluyendo la eliminacin de secuencias de seales de inestabilidad (tales
como AUUUA y variante), eliminacin de sitios potenciales de empalme, y un aumento del
contenido de GC del 35% (tipo salvaje) al 57% (ptimo) aument la expresin 11 veces en
comparacin con el no -optimizado construir. A continuacin, se examinaron las seales de
secrecin sobre IL-15 y una construccin con el lder de tPA mostr una expresin aumentada de
75 veces de IL-15. El enlazador entre el promotor tPA y la secuencia codificadora de IL-15 se
optimiz y una secuencia con aminocidos GAR 3 mostr la expresin ms alta (Tabla 3). Sin
embargo, incluso con el constructo optimizado, todava no era factible proceder como una lnea
celular de produccin para suministrar material clnico para ensayos en seres humanos. La baja
expresin de rhIL-15 en clulas de mamfero es al menos parcialmente debida a la inestabilidad
del producto expresado en las clulas. La IL-15 expresada en clulas HEK 293 se degrad
inmediatamente (Bergamaschi et al., 2008). La co-expresin de IL-15 de IL-15 e IL-15 receptor alfa
en la misma clula dio como resultado un aumento significativo de los niveles de expresin con
mayor estabilidad y secrecin de ambas molculas como un complejo (Bergamaschi et al., 2009).
La fusin de IL-15 con su receptor alfa mostr actividad biolgica aumentada (Mortier et al., 2006).
yields (Chiang and Sisk, 2005; Dorai et al., 2010; Majors et al., 2008; Nivitchanyong et al., 2007;
Rossi et al., 2011). Anti-apoptotic genes Aven and E1B-19K enhanced baby hamster kidney cell line
to produce recombinant factor VIII in 12-L perfusion bioreactor studies (Nivitchanyong et al.,
2007). A set of Bcl family members, Bcl-XL, Bcl-2, combining with E1B-19K, were over-expressed
in CHO cells, resulting in 80% increased productivity of a Mab as compared with an optimum clone
from the control cell line (Dorai et al., 2010), as well as lactate consumed and culture longevity
extended (Dorai et al., 2009b). A new cell line was engineered for extended cell survival, i.e.,
myeloma Sp2/0 transfected with Bcl2-EEE, the constitutetively active phosphomimetic mutant of
Bcl-2 (Rossi et al., 2011). The clone referred as SpESFX-10 exhibited robust growth and resisted
apoptosis induced by sodium butyrate or glutamine starvation (Rossi et al., 2011). The advantage
of SpESFX-10 as a host for generating Mab-production cell lines was demonstrated by its increased
transfection efficiency, culture longevity, as well as terminal Mab titer increased from 500 to 1300
mg/L at 3 L fed-batch bioreactor (Rossi et al., 2011).
2.6. Ingeniera de lneas celulares

Existen alrededor de 200 productos biofarmacuticos recombinantes Actualmente en el mercado

y varios cientos estn en desarrollo clnico (Rader, 2010). Ms de la mitad de ellos son protenas
glicosiladas. Desarrollo de un sistema de expresin que permita La fabricacin de glucoprotena de
calidad es altamente deseable. La sialilacin de glicoprotenas para uso teraputico es importante
En mantener un largo tiempo de permanencia en circulacin. El grado de

La sialilacin es variable dependiendo del producto, de la lnea celular husped y del cultivo
Condiciones. Las etapas limitantes de la sialilacin incluyen la biosntesis Del cido silico, la
disponibilidad de los nucletidos-azcares, y el CMPsialic Transportador cido y sialil-transferasa
(Durocher y Butler, 2009). La sobreexpresin de sialil-transferasa en clulas CHO proporcionUna
mejora moderada (Bork et al., 2009, Wong et al., 2006). Adems De sialilacin, la expresin de IgG
en clulas CHO conduce normalmente a una Fucosilada, biantenario estructura de glicano.
Encuadernacin del La IgG no fucosilada a FcRIII humano se mejor 50 veces (Shields Et al., 2002)
en comparacin con la IgG fucosilada. Nonfucosylated Anti-CD20 mostr marcadamente mayor
(ms de 100 veces basado en EC50) Ex vivo actividad de la clula B deplecin que su fucosylated
contrapartida en La presencia de IgG plasmtica (Lida et al., 2006). Por lo tanto, no fucosilado La
IgG1 exhibe un fuerte potencial teraputico a travs de ADCC a bajas dosis en seres humanos in
vivo (Lida et al., 2006). En Para producir anticuerpos afucosilados utilizando transfeccin
transitoria, Se gener una lnea de clulas FUT8 (FUT8KO) en un husped CHO (Wong et al., 2010).
La transfeccin de la clula usando el catinico Liposoma, DMRIE-C, dio como resultado ttulos de
produccin de IgG humana comparables Al tipo salvaje. La lnea celular tambin puede co-
transfectarse con la

Exostina-1 (EXT1) gen para aumentar el contenido de sulfato de heparina en orden Para alcanzar
niveles de expresin similares (40-50 mg / L) como el tipo salvaje (Wong et al., 2010). La
produccin de EPO recombinante y la sialilacin en clulas CHO se mejoraron A travs de la
expresin transitoria del Bombyx mori 30Kc19, Que puede representar un nuevo enfoque para
mejorar la produccin Y sialilacin de glicoprotenas recombinantes en clulas CHO (Wang Et al.,
2011). Se encontr que la protena 30Kc19 inhibe la fragmentacin nuclear Y formacin de clulas
apoptticas en clulas Sf9 (Rhee et al., 2009). Cuando se estableci una lnea celular estable que
contena 30Kc19, su expresin Produccin de EPO significativamente mejorada y sialilacin 102,6%
y 87,1% respectivamente. La mayor productividad Se cree que la expresin de 30Kc19 ocurre
porque la protena 30Kc19 Suprime la prdida de potencial de la membrana mitocondrial y
consecuentemente Mejora la generacin de ATP intracelular. En adicin, El efecto positivo de la
expresin de 30Kc19 sobre sialilacin se cree Debido a su capacidad para mantener la actividad
sialiltransferasa (Wang Et al., 2011). Condiciones de cultivo tales como inanicin de nutrientes,
limitacin de oxgeno, Acumulacin de subproductos txicos y una alta osmolalidad pueden
Apoptosis, que tiene un impacto negativo en la productividad de un Protena en clulas de
mamferos (Krampe y Al-Rubeai, 2010). La co-transfeccin y el exceso excesivo de un gen anti-
apoptosis en un La lnea celular de produccin puede extender la viabilidad celular y aumentar la
expresin
3. Desarrollo de procesos

La optimizacin del medio de cultivo y las estrategias de alimentacin son Factores que
contribuyeron a aumentar la produccin por debajo de 100 mg / L A 13 g / l (Huang et al., 2010,
Wurm, 2004). Varios mtodos han Han sido investigados para aumentar el rendimiento de
produccin, (Seth et al., 2006) y vectores de expresin (Aldrrich et al., 2003), la optimizacin de los
medios de cultivo (Altamirano et al., 2004, Huang Et al., 2010) con aditivos (Allen et al., 2008, Bai
et al., 2011), varios Estrategias de alimentacin y mejora del control de procesos tales como
temperatura, PH y osmolalidad (Gagnon et al., 2011; Rodriguez et al., 2005; Trummer et al., 2006;
Yoon et al., 2005). Para minimizar el impacto negativo del lactato, un mtodo simple Control de la
acumulacin de lactato en cultivos en suspensin de CHO Se desarroll basndose en el pH del
cultivo (Gagnon et al., 2011). Cuando la glucosa baj a un nivel bajo (generalmente por debajo de
1 mM), las clulas Comienzan a tomar cido lctico del medio de cultivo resultante En un aumento
del pH. Basado en el control del pH, un mtodo de alimentacin de nutrientes fue Desarrollado
para suministrar una solucin concentrada de glucosa. Fue demostrado Que el suministro de
glucosa de pH controlado de alta gama puede Reducir o eliminar la acumulacin de lactato
durante la Fase de crecimiento de un cultivo de clulas CHO alimentadas en lotes. El mtodo fue
escalado Desde la escala del banco hasta una escala grande de 2500 L (Gagnon et al., 2011).
Adems, Este mtodo ha demostrado ser aplicable a la mayora de los Lneas celulares CHO que
producen anticuerpos monoclonales y otras Protenas con resultados que mostraron duplicacin
de los ttulos finales de ocho (Gagnon et al., 2011). Se utiliz un proceso de alimentacin por lotes
qumicamente Desarrollado recientemente para maximizar la produccin de protena de fusin
Mab y Fc De 10-13 g / l. La densidad celular alcanz los 20 millones / ml y la Las viabilidades se
mantuvieron por encima del 80% el da 18 sin el uso de Genes antiapoptticos o cambio de
temperatura. El proceso fue escalado hasta A 100 L (Huang et al., 2010). En este estudio, un
hidrolizado de plantas Se utiliz para mejorar la productividad de 44 p / c / d a 54 p / c / d.
Volumtrico Productividad fue superior a 500 mg / L / da, que es uno de los ms altos Informado
para cultivo de clulas de mamfero usando medio definido (Huang Et al., 2010). Componentes
complejos de medios de cultivo de clulas usados para mamferos industriales El cultivo celular
puede analizarse mediante espectroscopia Raman para su identificacin, Caracterizacin y
evaluacin de la calidad (Li et al., 2010). Puede ser potencialmente til en la produccin a gran
escala para asegurar Consistencia lote a lote en la produccin biofarmacutica. Para reducir el
tiempo desde la acumulacin de semillas hasta los inculos listos para la produccin, Se desarroll
un gran procedimiento de banca de criobesa de 100 mL (Heidemann et al., 2010). No hay
diferencia significativa en la tasa de recuperacin Y la productividad se observ (Heidemann et al.,
2010).

3.1. Desarrollo de medios

Los valores umbral inhibitorios de amonaco, lactato, osmolalidad y dixido de carbono para el
crecimiento celular y la calidad de la protena se examinaron en un cultivo de clulas CHO en
biorreactores de 5000 L (Xing et al., 2008). El lactato a 60 mM inhibi el crecimiento celular en un
25%, pero aument la produccin especfica de protena en un 10% (Lao y Toth, 1997). En el
cultivo de clulas de mamferos, la secrecin de cido lctico durante el crecimiento celular y la
produccin de terapias proteicas ha sido problemtica debido a los aumentos resultantes en la
concentracin de lactato y osmolalidad, los cuales pueden afectar negativamente al crecimiento y
la productividad de las clulas (Yoon et al. El tensioactivo no inico sinttico Pluronic F-68 (PF-68)
se usa ampliamente para proteger las clulas de mamferos de las lesiones relacionadas con el
roco y la agitacin en un biorreactor de tanque agitado (Clincke et al., Murhammer y Goochee,
1990). Bajo condiciones suaves (baja o sin agitacin), la adicin de PF-68 a un nivel de 0-0,1%
puede aumentar el crecimiento de clulas CHO y la produccin de protenas recombinantes
(Clincke et al., 2011). El aumento del ttulo de produccin puede deberse parcialmente a la
contribucin de la disminucin de la adherencia del producto sobre las clulas CHO (Clincke et al.,
2011, Tharmalingam et al., 2008) en una disminucin de la hidrofobicidad de la membrana celular
despus de la adsorcin de PF-68 Murhammer y Goochee, 1990). Para la glicosilacin de la
glicoprotena recombinante, no se observaron diferencias significativas entre la presencia y la
ausencia de PF-68 (Clincke et al., 2011; Kochanowski et al., 2008). El hierro juega un papel crtico
en el apoyo al crecimiento de clulas sanas. La deficiencia de hierro causa un crecimiento celular
deficiente y, finalmente, la muerte celular. Se encontr que el uso de hierro 0,25 mM con citrato
de sodio 0,5 mM efectivamente mejor el ttulo de produccin de Mab en un 30-40% (Bai et al.,
2011). La selenita se estudi por su funcin adicional como soporte de hierro para el crecimiento
de clulas CHO y la produccin de Mab (Zhang et al., 2006). Se obtuvieron densidades celulares
tan altas como 10 millones de clulas viables / ml y ~ 3 g / L de ttulos de producto en cultivos de
carga alimentada de 14 das en matraces de agitacin, seguido por ampliacin exitosa a
biorreactores agitados (Zhang et al., 2006) .

3.2. Control de procesos para mejorar la calidad del producto

Se ha descrito una mala incorporacin de serina para asparagina durante la produccin de un Mab
recombinante usando clulas CHO (Khetan et al., 2010, Wen et al., 2009). Se descubri como
resultado de las modernas tecnologas analticas, incluyendo la medicin de masa intacta, la
cartografa de pptidos y la secuenciacin en espectroscopa de masas en tndem (Wen et al.,
2009). La mala incorporacin se produjo durante los procesos alimentados por lotes bajo el
hambre de asparagina. El mantenimiento de la asparagina a niveles bajos mediante la
suplementacin controlada de alimentos que contienen asparagina elimin la ocurrencia de una
mala incorporacin (Khetan et al., 2010). Esta estrategia se implement en un proceso de
fabricacin clnico y se ampli hasta 2000 L (Khetan et al., 2010). Tambin se observaron cambios
en la secuencia de aminocidos no deseados en Mab recombinante expresado en clulas CHO y se
inform por Guo et al. (2010). Dado que el metotrexato (MTX) se utiliza a menudo para generar
lneas celulares de alta produccin, las tasas de mutacin genmica del gen hipoxantina-guanina
fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT) utilizando un ensayo de 6-tioguanina (6-TG) bajo diversas
concentraciones de seleccin MTX en CHO Clulas. Los resultados mostraron que la resistencia a
6-TG aumentaba a medida que la concentracin de MTX aumentaba durante el desarrollo de la
lnea celular estable. Los datos de Guo mostraron que dos sustituciones de serina, una en la
posicin 167 por la arginina (S167R) en la cadena ligera y la otra en la posicin 63 por la asparagina
(S63N) en la cadena pesada se debieron a un cambio de secuencia de nucletidos genmicos y una
incorporacin errnea de traslacin. Esta mala traduccin es codn especfico ya que la traduccin
errnea de S63N no es detectable cuando el codn AGC S63 se cambia a un codn TCT o TCC. Los
resultados de Guo demuestran que tanto un cambio de nucletidos genmicos como una
trascendencia de traslacin pueden conducir a niveles bajos de variantes de secuencia y una
traduccin errnea de serina a asparagina. Ms importante an, la mala incorporacin puede ser
eliminada sustituyendo el codn TCC o TCT por el codn S63 AGC sin afectar la productividad del
anticuerpo.

Problemas que requieren una considerable cantidad de esfuerzo tanto en el proceso como en el
desarrollo analtico. Las condiciones ambientales del proceso de produccin tales como
temperatura, concentracin de protena, pH, oxgeno, fuerza de cizallamiento y fuerza inica
pueden afectar la cantidad de agregado observada. La presencia de ciertos ligandos, incluyendo
iones especficos, puede aumentar la agregacin. Los estreses a la protena, tales como la
congelacin, la exposicin al aire o la interaccin con superficies metlicas, pueden dar lugar a una
modificacin de la molcula postraduccional indeseada incluso desplegndose, lo que conduce a la
formacin de agregados (Vazquez-Rey y Lang, 2011). Durante el cultivo celular, la agregacin de
protenas es un fenmeno comn en el Mab, Fc-fusin y cierta produccin de citoquinas debido a
la alta concentracin de protena acumulada. La seleccin de una lnea celular ptima y la
optimizacin de las condiciones de cultivo celular son clave para minimizar la agregacin. Alta
temperatura y pH cercano al producto PI favorecer la agregacin (Franco et al., 1999). La
modificacin del medio de cultivo en pH y la adicin de cloruro sdico al medio para lograr cierto
valor de osmolaridad (350 mOsm / kg) resultaron en una disminucin significativa de los
agregados de anticuerpos monoclonales en el ciclo de produccin (Franco et al., 1999). La
aplicacin de tratamientos con disolventes y detergentes para inactivar el virus como alternativa a
la inactiva- cin de pH reducir el nivel de agregaciones en el producto (Vazquez-Rey y Lang,
2011). Las estrategias para la remocin y minimizacin de agregados durante los procesos de
fabricacin de Mab fueron bien resumidas por Vzquez Rey. Durante la fabricacin aguas abajo, la
cromatografa es tpicamente la etapa que ms contribuye a la eliminacin de agregados. Una
nueva clase de resina de intercambio inico basada en agarosa injertada con dextrano ha ganado
popularidad para las bioseparaciones a escala de proceso (Suda et al., 2009; Vazquez-Rey y Lang,
2011). Adems de utilizar la cromatografa de exclusin de tamao (SEC) para reducir los niveles
de agregados en la solucin final (Wang et al., 2006), alternativamente, Lu et al. (2009) resumieron
el avance reciente en la aplicacin de la cromatografa de interaccin hidrfoba para agregados de
anticuerpos e impurezas tales como la eliminacin de protenas de la clula husped en el proceso
de purificacin industrial (Lu et al., 2009).

4. Factores de impacto de la glicosilacin

La glicosilacin es un atributo crucial de la calidad de la protena que puede afectar la eficacia y la

farmacocintica. Muchos factores, incluyendo el bioreactor / plataforma tecnolgica, el tipo de
clula, el medio, los nutrientes y las condiciones de cultivo han afectado la glicosilacin de
protenas teraputicas y anticuerpos expresados en clulas de mamferos (Gawlitzek et al., 1995;
Hossler et al., 2009). La sobreexpresin de glicosiltransferasas apropiadas puede mejorar la calidad
de glicanos (Andersen y Krummen, 2002), por ejemplo, la sobreexpresin de una
galactosiltransferasa y una sialiltransferasa en clulas CHO condujo a aumentos correspondientes
en el contenido de galactosa (Gal) y cido silico de protenas teraputicas recombinantes
expresadas (Andersen Y Krummen, 2002, Weikert et al., 1999). Se ha investigado ampliamente el
efecto de diferentes condiciones de cultivo (temperatura, pH, perfil metablico y oxgeno
disuelto), biorreactor, procesos, medio y nutrientes sobre las estructuras de glicanos enlazados a
N unidos a un anticuerpo oa una protena teraputica. Sin embargo, debido a la complejidad de la
estructura de glicano y al proceso de glicosilacin, no hay consenso sobre el sistema de cultivo que
puede tener un perfil de glicol deseable para un producto. Para cada sistema de expresin
individual, lnea celular y producto, una investigacin sistemtica sera la solucin para entender el
impacto de cada factor en el producto final (Hossler et al., 2009). El ltimo desarrollo de ensayos
de determinacin de perfil de glicano (Primack et al., 2011), un ensayo particular de cribado de
alto rendimiento para cuantificar las especies de glicanos principales en las muestras de cultivo de
clulas de mamfero en bruto para anticuerpos monoclonales, Y optimizacin de procesos de
cultivo celular. Los niveles relativos de manzanilla alta (HM), glicosilado fucosilado y glicosilado en
el dominio Fc se pueden determinar para cientos de muestras de cultivo de clulas crudas en
pocas horas. (Primack et al., 2011).

4.1. Bioreactor y lnea celular

Los estudios de comparacin detallada se llevaron a cabo por Nahrgang et al. (1999) para abordar
el impacto de los biorreactores y el tipo celular sobre la glicosilacin del producto. Las clulas
adherentes se cultivaron en botellas rodantes y en suspensin en un tanque agitado (STR). No se
observaron diferencias importantes en la glicosilacin. SP2 / 0 galactosil la IgG en mayor medida
si se cultivaba en un STR que en un reactor de fibra hueca (Nahrgang et al., 1999) con un
desplazamiento de G0 / G1 / G2 de 65% / 31% / 4% en biorreactor de fibra hueca A 24% / 56% /
20% en STR. El cultivo de CHO se llev a cabo generalmente en medio libre de suero, mientras que
SP2 / 0 a menudo requiere suero para el crecimiento. SP2 / 0 contena cantidades menores de
producto sialilado (Nahrgang et al., 1999). Los productos de CHO contienen menos G2 y ms G0 en
CHO MDJ8S que otras dos lneas celulares, es decir, HEK 293 y Sp2 / 0 (Nahrgang et al., 1999).
Entre las dos clulas CHO (CHO MDJ8S y CHO MDS) probadas, haba pocas diferencias en el perfil
de glicol (Kunkel et al., 1998).

4.2. Tasa de crecimiento Hahn y Goochee observaron que la transferencia de glicoprotenas,

segregada por cultivos confluentes y subconfluentes, contiene diferentes proporciones de
oligosacridos biantenarios. La glicoprotena biantenaria era ms biolgicamente activa. Las
clulas confluentes producen transferrina ms activa que las culturas subconfluentes. Hahn y
Goochee (1992) concluyeron que la sntesis de oligosacridos es dependiente del crecimiento. As,
en el cultivo en lotes estndar en el que la velocidad de crecimiento vara a lo largo de la
fermentacin, el patrn de glicosilacin variar (Hahn y Goochee, 1992). Se investigaron las
velocidades de sntesis de protenas y la glicosilacin de protenas resultante. La reduccin de la
velocidad de sntesis de protenas con cicloheximida mejor la ocupacin del sitio de glicosilacin
de la protena recombinante producida por clulas murinas C127 (Shelikoff et al., 1994). Sin
embargo, los estudios sobre la sntesis de tPA en clulas CHO sugirieron que la tasa de sntesis de
protenas tiene poco efecto sobre la glicosilacin de protenas (Bulleid et al., 1992). La sialilacin
global aument en los cultivos de perfusin en comparacin con la alimentacin por lotes (Kunkel
et al., 2000). Las clulas de crecimiento ms lento en el modo de perfusin facilitaron una protena
ms completamente glicosilada en comparacin con el modo alimentado por lotes donde las
clulas crecieron ms rpido (Kunkel et al., 2000).

4.3. Medio y nutrientes

El medio de cultivo celular determina el entorno de crecimiento celular y las condiciones fsicas
que tienen un impacto crucial en el crecimiento celular, la productividad, as como la calidad del
producto incluyendo la glicosilacin. Los suplementos de nutrientes incluyen la alimentacin de
azcar, alimentacin de nucletidos, burbujeo de oxgeno, adiciones de aminocidos y
componentes de suero.

4.3.1. Suero

El suero bovino ha sido utilizado en cultivos de clulas de mamferos como suplemento

nutricional, as como para proteger las clulas de las fluctuaciones del pH o de las fuerzas de
cizallamiento durante varias dcadas. El suero contiene factores de crecimiento que mejoran el
crecimiento celular, y lpidos que mejoran la resistencia al cizallamiento. Sin embargo, el suero
tambin contiene productos de desecho y proteasas, que pueden ser perjudiciales para la clula y
los productos de glicoprotena (Harcum, 2006). Una IgG1 monoclonal producida por hibridoma de
ratn en medios libres de suero tena niveles ms altos de cido N-acetilneuramnico terminal
(NANA) y Gal comparados con cultivos con suero, mientras que Galwas terminal era ms alto a
partir de clulas CHO cultivadas en medio con suero (Heller et al., 2009; Al., 1992).

4.3.2. Glucosa

Los quimiostatos limitados con glucosa se analizaron para demostrar si la glucosilacin era
dependiente de los componentes de los medios (Gawlitzek et al., 2000, Hayter et al., 1993). Hayter
et al. (1993) examinaron el patrn de glicosilacin del interfern (IFN) -gamma producido por
clulas CHO a una velocidad de dilucin constante y con dos concentraciones diferentes de
glucosa

Concentraciones. Ellos fueron capaces de demostrar que totalmente glicosilado IFN-gamma

ocurri ms fcilmente cuando la glucosa no estaba limitada.
Se concluy que este efecto se debi al estado fisiolgico De las clulas. La galactosilacin podra
mejorarse ligeramente por adicin De glucosa al medio de cultivo (Nahrgang et al., 1999). El uso
De los diferentes medios de produccin tambin dio lugar a pequeas variaciones En la relacin
entre estructuras galactosiladas (Nahrgang et al., 1999). La alimentacin de galactosa puede
ayudar a facilitar una reaccin galactosilada ms completa N-glycan perfil (Hossler et al., 2009).
Estudios de CHO fed-batch Culturas que producen IFN-gamma revel que la glutamina y la glucosa
Niveles inferiores a o.1 mM y 0,7 mM, respectivamente, condujeron a una disminucin Perfiles de
sialilacin y un aumento en los niveles de manosa hbrida y alta Tipo glicanos (Wong et al., 2005).
Por el contrario, los cultivos Clulas BHK-21 que expresan una protena de fusin IgG-IL-2 humana
bajo Concentraciones de glucosa y glutamina, no mostraron diferencias Oligosacrido comparado
con un cultivo limitado sin nutrientes (Cruz et al., 2000).

4.3.3. Amonio

La cantidad de residuos de Gal y NANA en TNFR-IgG se correlacion de una manera dependiente

de la dosis con la concentracin de amonio bajo la cual se sintetizaron los oligosacridos unidos a
N. A medida que el amonio aument de 1 a 15 mM, se observ una disminucin concomitante del
40% en galactosilacin terminal y sialilacin de la molcula. El amonio parece alterar la biosntesis
de carbohidratos de TNFR-IgG por un efecto mediado por el pH sobre la actividad de la
glicosiltransferasa (Gawlitzek et al., 2000). El efecto principal de ammounia en la glicosilacin es
una disminucin en la sialilacin terminal. Se inform que incluso un nivel bajo de amonaco (2
mM) podra afectar a la sialilacin de O-glicanos (Andersen y Goochee, 1994).

4.3.4. Otros

Se ha demostrado que los suplementos de lpidos y los portadores (dolicol) mejoran la ocupacin
del sitio de N-glicano del IFN-gamma (Castro et al., 1995; Jenkins et al., 1994). Se aadi
manganeso al medio de cultivo celular dando lugar a una mayor glicosilacin tanto en glicanos
unidos a O y N (Crowell et al., 2007).

4.4. Condiciones de cultivo

El control del nivel de oxgeno disuelto (DO) es importante para mantener el metabolismo ptimo
y el crecimiento de las clulas productoras en bioprocesos. El efecto del oxgeno disuelto sobre la
glicosilacin de una protena recombinante a partir de clulas CHO se observ mediante un perfil
de glicoforma cambiante. Controlando los puntos de ajuste de DO entre un rango de 1 a 100% de
saturacin de aire, la galactosilacin terminal de una IgG cambi significativamente con una
disminucin gradual de los glicanos digalactosilados (G2) del 30% al nivel de oxgeno ms alto a
alrededor del 12% Bajo condiciones de oxgeno (Kunkel et al., 1998). Se demostr que el pH del
medio tiene algn efecto sobre la distribucin de glicoformas de IgG secretadas por un hibridoma
murino (Muthing et al., 2003; Rothman et al., 1989). A medida que el pH aumentaba de 6,9 a 7,4,
el contenido de G2 se increment de 16% a 32% (Muthing et al., 2003). Durante la fase de muerte
celular, el anticuerpo producido a partir de clulas CHO mostr una disminucin en G2 y un
aumento en G0 (Kaneko et al., 2010).

5. Produccin de protenas recombinantes mediante la expresin de genes transitorios

La expresin transitoria de genes (TGE) se ha seguido activamente durante la ltima dcada. El

enfoque ofrece las ventajas de un corto tiempo de desarrollo (produccin de producto dentro de
varias semanas), lo que lleva a costes de desarrollo mucho ms bajos en comparacin con el
desarrollo estable de la lnea celular (Tabla 4). Adems, la calidad de los productos obtenidos de
TGE es adecuada para la evaluacin preclnica, acelerando as la fase de "Prueba de Principal", en
la cual las grandes empresas biofarmacuticas seleccionan mltiples candidatos a frmacos antes
de avanzar hacia la tubera de desarrollo formal. Tcnicamente, todas las estrategias utilizadas
para optimizar la expresin en un desarrollo de lnea celular estable pueden ser utilizadas y
evaluadas en TGE para evaluar su potencial antes de comprometer recursos significativos para
crear una lnea celular estable. Debido a la rpida rotacin y bajo costo, TGE se utiliza como el
primer paso para la estrategia de expresin de pantalla en trminos de diseo de construccin y
candidatos moleculares (Zhang et al., 2009).

La transfeccin de ADN en una clula de mamfero implica forzar deliberadamente cidos

nucleicos en las clulas usando electroporacin de choque elctrico de alto voltaje (Potter et al.,
1984), o usando mediadores qumicos tales como fosfato de calcio o lipofeccin (Sambrook y
Russell, 2001). El fosfato de calcio es un vehculo de entrega de ADN bien establecido, barato y de
alta eficiencia. Desafortunadamente, no funciona bien con las clulas CHO (Batard et al., 2001) y la
naturaleza sensible al tiempo del protocolo de transfeccin hace que la implementacin a gran
escala sea un reto (Baldi et al., 2007; Majors et al., 2008) . Estos mtodos y protocolos
establecidos utilizando lipofectamina demostraron una alta eficiencia de transfeccin en la
introduccin de ADN plasmdico en CHO y otras clulas (Matin-Montanez et al., 2010). Sin
embargo, el coste de los reactivos de transfeccin de lipofeccin es usualmente alto. Por lo tanto,
no es econmicamente viable fabricar cantidades a escala de gramo de producto usando estos
reactivos durante la fabricacin a escala piloto. Asimismo, los dispositivos de electroporacin son
excelentes para transferir ADN en mililitros de cultivo celular, hacindolos eficientes slo para
operaciones a pequea escala. Por lo tanto, los reactivos de transfeccin y la electroporacin
estn limitados al uso en laboratorio y no son prcticos para la produccin a gran escala.

Se descubri que la polietilenimina (PEI) haba tenido una alta actividad de transferencia gnica en
muchas lneas celulares con un grado aceptable de citotoxicidad (Boussif, 1995; Godhud et al.,
1999). Ms importante an, PEI permiti la transferencia rentable y prctica de ADN en muchas
lneas celulares diferentes con tasas de transfeccin en el intervalo de 40-90% (Ehrhardt et al.,
2006). Para un protocolo de transfeccin de 10 L, 293Fectin cost $ 4000; XtremeGENE cuesta
$ 5000; Mientras que el costo de PEI fue menos de un dlar (Morrow, 2008). Dado que sus
rendimientos son aproximadamente equivalentes, PEI se selecciona preferentemente para uso de
fabricacin a gran escala (Morrow, 2008). PEI condensa efectivamente el ADN en partculas
cargadas positivamente que se unen a los residuos aninicos de la superficie celular y entran en
las clulas a travs de la endocitosis. Una vez dentro de la clula, la protonacin de las aminas da
lugar a una afluencia de contra-iones y una disminucin del potencial osmtico transmembrana.
Los resultados de hinchazn osmtica y las rfagas de vesculas que liberan el polmero-complejo
de ADN (polyplex) en el citoplasma. Si el polmero descomprime, el ADN es entonces libre de
difundirse en el ncleo (Akinc et al., 2004; Rudolph et al., 2000). Dado que el vehculo de
transferencia de genes era eficaz para la transfeccin a gran escala de clulas de mamfero
cultivadas en cultivo en suspensin, el uso de PEI como reactivo de transfeccin fue uno de los
avances ms importantes para la produccin rpida de cantidades gramo de Mabs y protenas
recombinantes. Adems, se optimiz cuidadosamente la relacin polmero / ADN y se desarroll
un sistema robusto de expresin transitoria simple utilizando el PEI con CHO (Derouazi et al., 2004,
Tait et al., 2004), HEK293 y otras clulas (Ehrhardt et al. 2006). Posteriormente, PEI ha sido
ampliamente utilizado para la expresin de genes transitorios, y se ha convertido en un reactivo
de transfeccin estndar para la produccin de protenas recombinantes en muchos tipos de
clulas diferentes (Boussif, 1995, Godabad et al., 1999) Y en escalas de produccin de hasta 100 L-
150 L (Derouazi et al., 2004; Muller, 2005). Adems del bajo costo y la posibilidad de producir
cantidades gramas de producto final, la plataforma de tecnologa TGE basada en PEI ha tenido
xito para la expresin con altos ttulos de anticuerpos y protenas recombinantes (Tabla 5). Han
aparecido informes repetidos de un aumento significativo de los niveles de expresin. Para
protenas recombinantes, se han obtenido niveles de expresin de 50-100 mg / l. Esto permite la
recuperacin a escala de gramos a partir de un pequeo nmero de corridas de biorreactor de 20
L, facilitando la evaluacin biofarmacutica temprana de terapias prometedoras en animales y
permitiendo la determinacin de los intervalos de dosificacin necesarios para la toxicologa y la
eficacia testing.HEK293E y CHO lneas celulares son predominantemente utilizados en tecnologa
TGE para Produccin a escala grande relativa con niveles de expresin de hasta 1 g / l para Mabs.
La lnea celular HKB-11, un hbrido de clulas de rin y lneas de clulas B, tambin se us para
expresar varias protenas recombinantes incluyendo IL-2SA (una mutena de interleucina 2) en un
biorreactor de onda de 10 L. Los ttulos alcanzaron 40 mg / L, lo que indica la escalabilidad
potencial de la lnea celular para la produccin. Adems, se han utilizado muchas otras lneas
celulares, tales como clulas de rin de hmster de beb BHK-21, clulas de fibroblastos de rin
de mono verde africano (cos-7) y clulas de mieloma de ratn Sp2 / 0 para la expresin transitoria
(HY Kim et al. , 2011). Las clulas HEK293E que expresan el antgeno nuclear 1 (EBVNA1) del virus
de Epstein-Barr (EBVNA) permiten la amplificacin episomal de plsmidos portadores de los
orgenes de replicacin del EBV viral. Por lo tanto, se espera que aumenten los niveles de
expresin recombinante permitiendo que persistan ms copias de plsmido en las clulas
transfectadas a lo largo de la fase de produccin (Van Craenenbroeck et al., 2000). Un historial
detallado de clulas HEK 293E fue resumido por Baldi (Baldi et al., 2007). Se utiliz HEK293E para
una produccin de Mab con rendimientos superiores a 1 g / l con TGE, lo que es un avance de hito
registrado por el grupo de Wurm (Backliwal et al., 2008a, 2008b, Tabla 5). Se utiliz una estrategia
de expresin que incorpora modulacin de mltiples vas en clulas HEK 293E para producir ttulos
de alta produccin. La incorporacin de un intrn personalizado junto con el Elemento de
Regulacin Post-transcripcional del Virus de la Hepatitis de la Woodchuck (WPRE) y la optimizacin
del promotor aumentaron la expresin desde un valor inicial de 4 mg / L hasta la expresin
optimizada

De 40 mg / l. Despus de estudios de comparacin sistemtica con protenas reguladoras del ciclo

celular humano, factores de crecimiento, adicin de inhibidores de la histona desacetilasa e
inhibidores de ADN metiltransferasa, y una combinacin optimizada de 37,5% de cadena pesada,
10% de cadena ligera, 10% de hp18, 10% de Hp21 y 5% del gen del factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF), las clulas HEK293E transfectadas transitoriamente produjeron un nivel de
expresin de 1 g / l. Con este sistema, se expresaron varias protenas de fusin no IgG y Fc con
ttulos de 250 a 940 mg / L, los niveles de expresin transitorios ms elevados publicados hasta la
fecha. Esta estrategia de coexpresar el ciclo celular, la antiapoptosis y los genes del factor de
crecimiento es extremadamente valiosa para disear futuros sistemas de expresin optimizados
para protenas recombinantes o anticuerpos monoclonales. El notable progreso en TGE hace que
este enfoque sea atractivo. Existe un inters creciente en el posible uso de esta tecnologa ms all
de la fase preclnica. Este uso depender de convencer a las agencias reguladoras de que los
productos obtenidos de TGE tienen suficiente calidad para los ensayos clnicos de primera en
humanos. La lnea celular HEK 293 ha sido un husped de la glicoprotena licenciada Xigris
(Drotrecogin alfa activada, una forma recombinante de protena C activada humana), desarrollada
por Eli Lilly (www.fda.gov, Eichacker et al., 2006). La estrategia de infectar clulas para producir
productos biofarmacuticos se ha utilizado comnmente en la fabricacin de vacunas. Por
ejemplo, se produce una vacuna de partculas similares a virus de la gripe utilizando baculovirus
para infectar clulas sf9 y el producto est en ensayos clnicos en seres humanos
(www.novavax.com). Desde una perspectiva reguladora, una pregunta clave que debe ser
respondida es si se puede demostrar la consistencia de lotes y la seguridad de los productos
producidos por las lneas celulares que contienen antgenos nucleares de componente viral. Desde
el punto de vista de la seguridad, y similares a las lneas celulares estables, la cualificacin del
banco de clulas husped y el ADN del plsmido, la validacin del aclaramiento viral para un
proceso que usa TGE tambin son expectativas crticas. Adems, se requerira la caracterizacin
del producto mediante la determinacin del patrn de glicosilacin, ensayos de unin de
anticuerpo / antgeno especficos, deteccin por PCR del ADN plasmdico residual y otros ensayos
analticos modernos, tales como anlisis de espectro de masas de alta resolucin para garantizar la
calidad y consistencia del Productos. Desde el punto de vista del proceso de produccin, se
requiere una gran cantidad de ADN plasmdico para la transfeccin, lo que aumenta el coste global
de la operacin de fabricacin para producir una gran cantidad de plsmido. La preparacin del
plsmido requiere la fermentacin de E. coli, seguida por la lisis celular y la purificacin del ADN.
Se describieron muchos procesos de fermentacin de plsmidos alimentados de alto rendimiento
(500-2600 mg / L) (Carnes et al., 2011; Singer et al., 2009, Williams et al., 2009). Sin embargo,
muchos de esos estudios se basaron en medios patentados de alimentacin por lotes y origen
vectorial inducible por calor. Una publicacin reciente inform de una preparacin de ADN de
plsmido simple a gran escala para el uso de TGE (Cheng et al., 2011). El crecimiento de E. coli en
lote alimentado se llev a cabo en un biorreactor de 5 l manteniendo la concentracin de glucosa
por debajo de 1 g / l despus de que se inici la alimentacin. Se obtuvieron rendimientos
plasmdicos de 490 y 580 mg / l con clulas Top 10 de E. coli que portaban dos plsmidos
diferentes respectivamente (Cheng et al., 2011). Adems, la pasta celular se lis en condiciones
alcalinas como mtodo estndar (Sambrook y Russell, 2001) y se us una etapa de precipitacin
con alcohol para purificar los plsmidos para TGE. Si bien el procedimiento es simple y el ADN de
plsmido producido muestra una excelente calidad para TGE, es necesario demostrar la
reproducibilidad del proceso global particularmente el proceso de aguas abajo. No obstante,
todava es discutible que el plsmido con alto nivel de endotoxina producido usando el mtodo
descrito dio como resultado la expresin ms alta cuando transfect clulas CHO (Cheng et al.,
2011).

Adems del PEI, el medio de transfeccin es otro componente crtico en una transfeccin a gran
escala exitosa. Una lista de los medios utilizados en TGE se recopil en una revisin (Geisse et al.,
2005). En muchos casos, se utiliz un mediador optimizado para el crecimiento celular y otro
medio ptimo para la transfeccin; Sin embargo, ambos pueden no ser necesariamente
compatibles. El desarrollo o la adaptacin de las clulas husped a un solo medio que es ptimo
tanto para el crecimiento celular como para la transfeccin es altamente deseable, ya que esto
eliminara las etapas del proceso necesarias para el intercambio de medios antes y despus de la
transfeccin. Alternativamente, la transfeccin realizada a una alta densidad celular (20 x 10 ^ {6}
clulas / ml) puede ser posible utilizar los medios ms utilizados y no estar restringida a un medio
especfico (Backliwal et al., 2008a, 2008b). La mayor parte de los protocolos para la transfeccin
transitoria de clulas HEK-293 adaptadas a la suspensin todava requieren una formacin
compleja a priori de PEI con ADN plasmdico para rendimientos ptimos y limitan la eleccin de los
medios de transfeccin y produccin. Sin embargo, a alta densidad celular y mayores
concentraciones de PEI y ADN (100 y 50 mg / mL, respectivamente), la formacin de complejos in
situ supera la formacin de complejos a priori (Backliwal et al., 2008a, 2008b). Priori (Backliwal et
al., 2008a, 2008b). Los aditivos medios tambin pueden desempear papeles importantes. El cido
valproico (VPA) mejora los niveles de ARNm y protena recombinante en clulas CHO DG44
transitoriamente transfectadas (Wulhfard et al., 2010). Los niveles de estado estacionario de los
ARNm de la cadena ligera y de la cadena pesada de IgG eran casi 10 veces ms altos que en la
transfeccin de control sin tratar aunque el nivel de ADN plasmdico transfectado era el mismo en
presencia o ausencia de VPA (Wulhfard et al., 2010) . Adems de las mejoras logradas a travs de
componentes medios y aditivos, los niveles de expresin se incrementaron ms de 3 veces a baja
temperatura de 31C en comparacin con 37C (Wulhfard et al., 2008). Adicionalmente, el
procedimiento se simplific adicionalmente mediante la eliminacin de una etapa de dilucin
despus de la transfeccin (Rajendra et al., 2011). La productividad de la fabricacin
biofarmacutica tambin puede mejorarse mediante la transfeccin transitoria de una lnea
celular de produccin estable con un gen inhibidor de la apoptosis (Majors et al., 2008; Wang et
al., 2011). Como se mencion en la seccin anterior (Ingeniera de Lneas Celulares del SISTEMA DE
EXPRESIN), la produccin de EPO recombinante y la sialilacin en CHO se mejoraron mediante la
expresin transitoria del gen de B. mori 30Kc19, que puede representar un nuevo enfoque para
mejorar la produccin y sialilacin de glicoprotenas recombinantes En clulas CHO (Wang et al.,
2011). En un mtodo alternativo, usando una lnea celular (por ejemplo, CHO DG44) transfectada
establemente con un gen anti-apoptosis de la familia de genes Bcl-2 tal como Bcl-xL aument una
expresin transitoria de protena de fusin en un 70-270%, indicando anti-apoptosis La ingeniera
es una de las muchas estrategias posibles que afectan el estado fisiolgico de las clulas con
beneficios significativos para los rendimientos de TGE (Majors et al., 2008, Stettler et al., 2007).
Para mejorar la productividad especfica de anticuerpos en clulas CHO, se mejoraron las
modificaciones postraduccionales en el retculo endoplsmico durante la produccin de
anticuerpos mediante la sobreexpresin transitoria de la protena disulfuro isomerasa (Mohan et
al., 2007), resultando en un aumento del 27-37% en la productividad.

Adems, utilizando una expresin transitoria inducible para co-sobreexpresar redox

endoplasmtico oxidorreductasa con disulfuro isomerasa, la productividad se increment en un
55% (Mohan y Lee, 2010). Por el contrario, bajo condiciones de coexposicin inducible estable, la
productividad no se vio afectada. Habiendo enumerado los avances en el desarrollo de TGE para la
produccin de protenas, todava hay algunas preguntas con respecto a la produccin de gran
cantidad debido en parte a un nivel de expresin relativamente bajo (Morrow, 2008). Se inform
que una estrategia alternativa utilizando la tecnologa estable de la piscina de transfeccin
produca cantidades gramo de Mab para el desarrollo preclnico (Ye et al., 2010). Los niveles de
expresin para Mabs se pueden alcanzar en un rango de 100-1000 mg / L a la escala de 200 L (Ye
et al., 2010). Adems, existen preocupaciones con respecto a los complejos ADN-catinicos o
lipoplexos en trminos de estructuras y teterogeneous, mientras que mucha investigacin
fundamental est dirigida a adquirir una mejor comprensin de sus molculas (Morrow, 2008).
Afortunadamente, una serie de tcnicas analticas se estn aplicando en los laboratorios de ciencia
bsica a la investigacin lipoplex, incluyendo la dispersin dinmica de la luz, ultracentrifugacin
analtica, electroforesis en gel, dicrosmo circular y espectroscopia de fluorescencia. Estos pueden
resultar en la generacin de un protocolo con reproducibilidad y consistencia durante la
fabricacin (Morrow, 2008). Progresos recientes en muchos aspectos del desarrollo de la
tecnologa de TGE: ingeniera de lneas celulares (Majors et al., 2008, Wang et al., 2011),
preparacin de plsmidos (Carnes et al., 2011; Cheng et al., 2011; , 2009), el desarrollo de medios
y aditivos (Wulhfard et al., 2010), la simplificacin de procedimientos (Rajendra et al., 2011) y la
automatizacin de procesos (Zhao et al., 2011) probablemente contribuirn a Realizacin de
fabricacin biofarmacutica a gran escala utilizando plataformas TGE para el desarrollo clnico
preclnico y temprano en un futuro prximo.

6. Conclusin

En las ltimas dos dcadas, la expresin de la protena de clulas de mamfero se ha convertido en

el sistema dominante de produccin de protenas recombinantes para aplicaciones clnicas,
produciendo ms de la mitad de los productos biofarmacuticos en el mercado y varios cientos de
candidatos en desarrollo clnico. Se han logrado avances significativos en el desarrollo y la
ingeniera de nuevas lneas celulares, la introduccin de nuevos mecanismos genticos en la
expresin, el silenciamiento de genes y la orientacin de genes. La comprensin de la glicosilacin
se ha convertido en uno de los enfoques y transitorios de expresin gnica plataforma de la
tecnologa juega un papel ms importante en la fabricacin biofarmacutica. Esta revisin ha
resumido los ltimos avances en el campo de la expresin de protenas recombinantes de
mamferos para el desarrollo biofarmacutico, especialmente en reas activas tales como sistemas
de expresin, factores de impacto de glicosilacin y expresin transitoria de genes.