Mutacin

Raymond Devoret, Instituto Curie, Pars, Francia

Una mutacin es un cambio de ADN que se registra de forma duradera y se transmite a la

descendencia. Una serie de mutaciones en las clulas germinales tienen efectos perjudiciales ya que
a menudo causan enfermedades hereditarias. Del mismo modo, las mutaciones que se acumulan
en las clulas del cuerpo pueden generar cnceres. Sin embargo, un gran nmero de mutaciones
son neutrales en su entorno normal. Las pocas mutaciones ventajosas que se producen se
mantienen generalmente. Las mutaciones que surgen al azar son constantemente atravesadas por
un entorno selectivo. Este proceso dual funciona como la fuerza impulsora de la evolucin.

Introduccin

El cido desoxirribonucleico (ADN) es el componente esencial de los cromosomas en todas las

clulas conocidas. Cada cromosoma est hecho de una molcula de ADN extremadamente larga con
dos cadenas complementarias entrelazadas (una doble hlice). Cada hebra consiste en una columna
vertebral de poli (fosfato-azcar), a partir de la cual se proyectan bases de adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T) en cada azcar. Las dos hebras forman un dplex mantenido por enlaces de
hidrgeno entre bases complementarias: A se une a T y G a C. La sucesin lineal de combinaciones
de bases A, C, G y T constituye una secuencia gentica (Figura 1). El ADN de todo el conjunto de
cromosomas en una clula se llama genoma. Una bacteria como Escherichia coli, un residente
natural del tracto intestinal de los mamferos, tiene un cromosoma, mientras que las clulas
humanas llevan 23 pares de cromosomas. En general, las clulas de organismos complejos como los
mamferos tienen ms cromosomas por clula que los organismos inferiores como los microbios. La
principal propiedad del ADN es codificar los rasgos hereditarios que se pasan de los padres a la
progenie. Recientemente, se ha identificado la larga cadena de bases que constituye el genoma de
muchos organismos, incluyendo humanos. Este logro ha establecido el posicionamiento
cromosmico preciso de muchos genes que controlan los rasgos hereditarios. Se descubri que los
genes que codifican las protenas que realizan la replicacin del ADN son similares en todos los
organismos vivos. Esto enfatiza la fuerte conservacin del mecanismo primario de la divisin celular.
Adems, los genes que controlan la mutagnesis (el proceso que conduce a la produccin de
mutaciones) son muy similares en diferentes organismos. El ADN es capaz de mutar para que los
organismos vivos puedan adaptarse a nuevos ambientes.
Figura 1 Tipos de mutacin. (A) Secuencia original de tipo salvaje; (B) transicin de C a T; (C)
transversin de G a C; (D) supresin (Del) de la secuencia ACCTA, el signo _ indica de donde se ha
eliminado; (E) insercin (Ins) de la secuencia AAAGC, los dos signos indican donde se ha insertado
la secuencia.

Naturaleza de las mutaciones

Cuando una mutacin ocurre dentro de un gen, la protena codificada por el gen es a menudo
alterada (Figuras 1b, c y 2c); Esta alteracin puede producir un cambio visible en las caractersticas
mostradas (fenotipo) del organismo estudiado. La mutacin propiamente dicha (genotipo) es
invisible a simple vista. Puesto que una mutacin es un cambio de ADN, debe definirse en relacin
con una secuencia de ADN parental precedente (Figura 1a). Obsrvese, sin embargo, que la
secuencia del genoma parental puede llevar ya mutaciones; Por lo tanto, los genetistas han
acordado definir una secuencia gentica estndar para cada organismo estudiado. Se han definido
tres amplias clases de mutaciones para caracterizar sus efectos sobre los organismos en los que se
originan: deletreo, neutro y ventajoso. Estas cualificaciones son vlidas slo en relacin con un
entorno especfico. Por ejemplo, un recin nacido humano tiene una probabilidad de 1/1600 de
sufrir de fibrosis qustica, una enfermedad que impide, en particular, la fluidez de las secreciones
pulmonares. Esto ocurre si el nio ha recibido las dos copias mutadas del gen de la fibrosis qustica
de sus padres. Significa que 1/40 personas lleva una copia del gen mutado; El individuo afligido tiene
un fenotipo "normal" pero exhibe resistencia a la diarrea infecciosa aguda. La alta frecuencia de esa
mutacin en la poblacin puede explicarse por su ventaja selectiva. La gente muere de clera
porque una diarrea de 20 litros por da los mata. Las personas que tienen un alelo mutado del gen
de la fibrosis qustica sobreviven porque pierden mucho menos agua cuando se infectan con el
germen del clera. En pases donde el clera ha sido endmico durante mucho tiempo, un alelo de
fibrosis qustica mutado puede proteger a un individuo contra la muerte por el clera.

La mayora de los mutgenos son agentes que daan el ADN

Mutaciones naturales ocurren a baja frecuencia. Para obtener ms mutaciones, el genetista Herman
Muller irradi clulas germinales de Drosophila con rayos X y descubri que la radiacin aumenta la
frecuencia de las mutaciones. Pronto, se encontr que los productos qumicos como el gas mostaza
(yperita) tambin producen mutaciones a alta frecuencia. Las radiaciones y algunas sustancias
qumicas producen mutaciones: se llaman mutgenos. Tanto los rayos X como el yperito rompen los
cromosomas. Esta propiedad ha sido explotada en radioterapia y quimioterapia para destruir
tumores. Del mismo modo, la luz ultravioleta y muchos qumicos alteran el ADN de muchas maneras;
Estas alteraciones se llaman lesiones de ADN.

Lesiones y mutaciones del ADN

Cmo pueden los agentes dainos del ADN producir mutaciones? En otras palabras, cmo puede
una lesin de ADN dar lugar a una mutacin? Las lesiones de ADN muestran ms de un centenar de
tipos de formas y formas, pero el 85% de las mutaciones resultantes son slo un cambio en una de
las cuatro bases de ADN conocidas; Por ejemplo, la adenina puede transformarse en citosina,
guanina o timina. La mayora de los productos qumicos, por ejemplo, el benzopireno que se
encuentra en el humo del tabaco, cuando se absorben se metabolizan en compuestos que se
adhieren al ADN para formar aductos (injertos). Las lesiones de ADN se representan con el
vocabulario de la qumica, mientras que las mutaciones se describen con un alfabeto simple de
cuatro caracteres A, T, C y G, que constituyen el cdigo primario de la vida. Es incorrecto considerar
las lesiones de ADN como mutaciones. Todo un conjunto de reacciones bioqumicas debe proceder
en el ADN daado para restaurar una secuencia de ADN adecuada. Obsrvese que las mutaciones
slo se observan en clulas que han sobrevivido al dao del ADN: las clulas muertas portan
numerosas lesiones que no han podido ser reparadas.

Reparacin de lesiones de ADN

La mayora de las lesiones de ADN bloquean la replicacin del ADN. Para que una clula pueda
sobrevivir, las lesiones de ADN deben ser removidas de los cromosomas por procesos de reparacin
o ser anuladas por ADN polimerasas especficas. Las polimerasas generan una cadena simple
complementaria adecuada que servir como plantilla para restaurar una doble hlice en una
segunda ronda de replicacin. Los organismos vivos utilizan al menos 12 procesos de reparacin
principales para eliminar las lesiones de ADN o para evitarlas. Las enzimas de reparacin funcionan
con una eficiencia ptima cuando el nmero de lesiones es bajo. Curiosamente, tan pronto como se
producen lesiones en el ADN, provocan la respuesta SOS, lo que induce una cascada de procesos de
reparacin. Como la reparacin falla en algunas lesiones de ADN, una ADN polimerasa mutagnica
inserta una base a travs de la lesin, incluso si su valor de codificacin es incorrecto. La restauracin
estructural de una doble hlice de ADN es primordial para permitir la replicacin y la divisin celular.

Tipos de mutacin, reversiones y ubicacin

Dado que el ADN es universal, se encuentra el mismo alfabeto de cuatro bases que forman el
aparato gentico de todas las especies. Los tipos de mutacin son similares dondequiera que se
presenten.

Mutaciones puntuales

Las ms frecuentes son las sustituciones de bases. Las sustituciones entre purinas, adenina (A) y
guanina (G), o entre pirimidinas, citosina (C) y timina (T) (Figura 1b) se denominan transiciones. Un
par de bases AT puede dar lugar a un GC (AT -} GC) y, a la inversa, un par de bases GC a un AT (GC -
} AT); Las reacciones de dos vas se representan como AT {-} GC.

Tipos de mutacin, reversiones y ubicacin

Dado que el ADN es universal, se encuentra el mismo alfabeto de cuatro bases que forman el
aparato gentico de todas las especies. Los tipos de mutacin son similares dondequiera que se
presenten.

Mutaciones puntuales

Las ms frecuentes son las sustituciones de bases. Las sustituciones entre purinas, adenina (A) y
guanina (G), o entre pirimidinas, citosina (C) y timina (T) (Figura 1b) se denominan transiciones. Un
par de bases AT puede dar lugar a un GC (AT -} GC) y, a la inversa, un par de bases GC a un AT (GC -
} AT); Las reacciones de dos vas se representan como AT {-} GC.

Las transversiones son sustituciones de una purina por una pirimidina y viceversa (Figura 1c). Hay
cuatro cambios de pares de bases recprocos: AT {-}CG, AT {-} TA, GC {-} TA y GC {-} CG. Las
sustituciones de bases que ocurren en regiones codificadoras de protenas afectan a la protena
expresada excepto cuando el cambio est en la tercera base de un codn (vase mutacin neutra o
sinnima, Figura 2a). Una mutacin en un gen que no puede causar ningn cambio de aminocidos
en la protena expresada se llama silenciosa o sinnima, ya que no induce ningn cambio en la
protena codificada. En la Figura 2a, el aminocido de valina se conserva en la secuencia de
protenas, mientras que las tcnicas moleculares revelan un cambio de ADN.

Una mutacin no sinnima altera un aminocido, dando como resultado una mutacin errnea o
sin sentido. Una mutacin missense modifica el codn afectado, especificando un aminocido
diferente al codificado previamente, por ejemplo, la valina (Val) se convierte en fenilalanina (Phe)
(Figura 2b). Una mutacin sin sentido cambia un codn en uno de los tres codones de terminacin
TAG, TAA o TGA. Entonces, se produce una protena truncada que rara vez tiene actividad, por
ejemplo, la lisina (Lys) se convierte en un condn de parada (Figura 2c).

Eliminaciones e inserciones

Ejemplos de deleciones e inserciones se ven en la Figura 1d, e. Adems, un cruce desigual entre dos
cromosomas da como resultado la delecin de un segmento de ADN en un cromosoma y una adicin
en el otro.

Cambio de cuadros

Una pequea delecin o insercin dentro de un gen, cada una de las cuales implica un nmero de
bases que no es un mltiplo de tres, provoca un cambio en el marco de lectura, denominado
desplazamiento de marco (Figura 3a). En este caso, la secuencia de codificacin corriente abajo se
lee en una fase "errnea". Este nuevo cambio de fase cambia los aminocidos codificados o bien un
nuevo codn de terminacin puede ser llevado corriente arriba en fase, produciendo as una
protena acortada. La Figura 3a muestra una protena que puede no tener actividad normal. La
Figura 3b tambin muestra que la adicin de una base produce un cambio de marco de +1,
eliminando una seal de parada preexistente y dando lugar a una protena alargada.

Reordenamientos del ADN

Las supresiones de segmentos de genes o conjuntos de genes reducen o eliminan las funciones
proteicas (Figura 3). Adems, tambin pueden ocurrir inserciones de segmentos de ADN grandes, al
igual que duplicaciones,

Inversiones y otros reordenamientos de ADN ms complejos. Todos estos procesos son los
resultados de la recombinacin entre las secuencias de ADN que comparten cierta similitud. Los
agentes que rompen los cromosomas, como los rayos X y el yperito, facilitan los reordenamientos
del ADN. Por ejemplo, cuando una parte del cromosoma 14 humano que lleva el gen Bcl2, que
previene la muerte celular, se transloca al cromosoma 18, entonces el gen Bcl2 se expresa
continuamente. Por lo tanto, las clulas producirn inmunoglobulinas mutadas, que normalmente
son eliminadas del cuerpo por la muerte celular, pero se mantienen vivas aqu debido a la
translocacin de Bcl2. Por lo tanto, un grupo de clulas no saludables se desarrolla gradualmente;
Las mutaciones puntuales se acumulan en aquellas clulas insalubres, que eventualmente darn
lugar a clulas cancerosas.
Figura 2 Tipos de sustituciones en una regin codificadora de protenas: (a) sinnimo, (b) sentido
errneo, y (c) absurdo. En cada caso, la secuencia superior es de tipo salvaje y la secuencia inferior
es mutada.

Figura 3 Ejemplos cambios de trama causados por delecin o insercin. (A) Una delecin de un G
provoca la terminacin prematura. (B) Una insercin de un G oblitera un codn de parada. Los
codones de terminacin estn subrayados. En cada caso, la secuencia superior es de tipo salvaje
y la secuencia inferior es mutada.
Insercin de elementos genticos transponibles

Elementos genticos transponibles, tambin designados transposones o genes saltantes, se

encuentran en casi todos los organismos. Su comportamiento ms obvio es su movilidad alrededor
de los cromosomas. Si un transposn se inserta en un gen que codifica una protena, el gen se divide
en dos partes y toda la protena ya no se expresa. Este es el aspecto negativo de la insercin del
transposn. Por el contrario, hay un lado positivo cuando, en una regin reguladora de genes, un
transposn insertado proporciona fuertes promotores que aumentarn la expresin de genes
posteriores.

Reversiones de la mutacin: verdadera o pseudoreversin de una mutacin

A veces, despus de unas generaciones, un organismo mutante vuelve al tipo salvaje. Se ha

revertido la mutacin al tipo parental original? No siempre, porque la mutacin todava puede
permanecer en el ADN, mientras que una mutacin secundaria ha ocurrido en otro lugar, la
restauracin de un fenotipo de tipo salvaje.

Hotspots de mutacin y mutaciones en secuencias reguladoras

Hotspots de la mutacin

Las mutaciones se producen, en promedio, al azar a lo largo del genoma, pero ms a menudo que
no, que surgen en algunos sitios llamados hotspots. Existe un hotspot en el cromosoma Escherichia
coli: el dinucletido CpG, en el que la citosina es frecuentemente metilada y replicada, con
introduccin de un error, cambia a TpG. Otro mecanismo es la desaminacin de la metilcitosina, que
produce timina en ausencia de replicacin. El dinucletido TpT es un hotspot de mutacin en
procariotas (pero no en eucariotas). Hotspots puede ser explicado por la forma tridimensional del
ADN que genera algunos objetivos para enzimas especficas como las metilasas. En las bacterias, las
regiones dentro del ADN que contienen palndromos cortos, es decir secuencias que leen el mismo
en la cadena complementaria, tales como 5'GCCGGC3 ', 5'GGCGCC3' y 5'GGGCCC3 ', son propensas
a mutar ms frecuentemente que otras regiones.

En los genomas eucariotas, repeticiones en tndem corto son a menudo hotspots, que resultan de
mispairing de hebra deslizado (Figura 4].

Mutaciones en secuencias reguladoras

El ADN codifica secuencias que controlan la expresin de protenas, tales como promotores y
operadores. Estas secuencias, al experimentar una mutacin, pueden alterar la concentracin
celular de protenas codificadas aguas abajo de la secuencia reguladora. La sobreexpresin o
subexpresin de protenas puede modificar bruscamente la funcin de un gen en un organismo.
Dado que muchas protenas funcionan de manera concertada, un fuerte aumento o disminucin de
la concentracin celular de una protena puede alterar el organismo.

Las mutaciones tambin son neutrales

En una secuencia de ADN que codifica una protena, cada uno de los codones de sentido puede
mutar a otros nueve codones por medio de una sustitucin de una sola base. Por ejemplo, CCU, que
codifica para proline (Pro), puede dar lugar a tres sustituciones sinnimas CCC, CCA o CCG, que
tambin codifican para Pro. En un orden diferente, el triplete puede dar lugar a seis sustituciones
no sinnimos, que codifican diferentes aminocidos, UCU para serina (Ser), ACU para treonina (Thr),
GCU para alanina (Ala), CUU para leucina (Leu) CAU para histidina (His), o CGU para arginina (Arg).
Puesto que el cdigo gentico define 61 codones de sentido, las posibles sustituciones de codones
pueden calcularse como 61 X 9 5 549. Si asumimos que las sustituciones de bases pueden ocurrir al
azar y que todos los codones son igualmente frecuentes en las regiones que codifican protenas,
podemos calcular La proporcin esperada de los diferentes tipos de sustituciones de bases. Debido
a la estructura del cdigo gentico, las sustituciones sinnimas ocurren principalmente en la tercera
posicin de los codones. De hecho, el 69% de todos los posibles cambios en un codn se encuentran
en la posicin de la tercera base. Por el contrario, las sustituciones en la segunda posicin de los
codones no son sinnimos, as como la gran mayora de los cambios de base en la primera posicin
(96%). Los reemplazos de aminocidos tampoco alteran ni la estructura ni la funcin de la protena.
Desde un punto de vista evolutivo, se dice que estas mutaciones son neutrales, ya que no parecen
afectar la aptitud del organismo mutado. Estas mutaciones tambin se acumulan con el tiempo, ya
que no se contraeleccionan. De hecho, tambin las mutaciones generan cambios en el nivel de ADN,
que se ha visualizado mediante el uso de enzimas de restriccin y tcnicas de secuenciacin. A largo
plazo, la acumulacin con el tiempo de las mutaciones sinnimas aumenta la divergencia del ADN
entre los individuos dentro de una especie. Una nueva especie puede entonces emerger por
segregacin. Los chimpancs y los seres humanos tienen algunas protenas que muestran una
similitud del 99%, pero las secuencias de ADN en las dos especies han divergido fuertemente,
impidiendo la formacin de especies hbridas por recombinacin. Una especie se define por la
propiedad de los individuos dentro de un grupo de aparearse y dar lugar a la progenie. A nivel
molecular, significa que los dos ADN parental son idnticos, por lo que pueden recombinarse. Si el
ADN genmico acumula cambios en la tercera base con el tiempo, el ADN del par de apareamiento
se vuelve demasiado divergente con respecto a su antepasado comn. Los individuos divergentes
resultantes pueden tratar de aparearse pero no pueden dar lugar a una progenie frtil.

El apareamiento es siempre seguido por la recombinacin del ADN, que es exitosa slo si surge entre
dos ADNs homlogos. El apareamiento est condenado al fracaso si se obliga a ocurrir entre dos
ADN heterlogos. El primer paso en la recombinacin es el apareamiento de dos cadenas de ADN.
Cuando dos hilos de ADN heterlogos intentan emparejarse, se producen desajustes de base a base
entre las bases que deben complementarse. Los desajustes se eliminan por la induccin de un
proceso de reparacin muy eficiente llamado reparacin de la falta de concordancia. Se ha
demostrado que la recombinacin entre dos ADN heterlogos es abortada por la reparacin de la
falta de concordancia.
Figura 4 Generacin de duplicaciones o deleciones por desviacin de hebras deslizadas entre
repeticiones contiguas (rojo en negrita). Las pequeas flechas indican la direccin de la sntesis del
ADN. Los puntos indican el emparejamiento de la base. (A) Un deslizamiento de dos bases en una
repeticin TA durante la replicacin del ADN. El deslizamiento en la direccin 3 '} 5' da como
resultado la insercin de una unidad TA (panel izquierdo). El deslizamiento en la otra direccin da
lugar a la supresin de una unidad de repeticin (panel derecho). La delecin mostrada en el panel
derecho resulta de la escisin de la unidad de repeticin no apareada (asteriscos) en el extremo 3
'de las hebras de crecimiento, presumiblemente por la actividad exonucleasa 3'} 5 'de la ADN
polimerasa. (B) Un deslizamiento de dos bases en una repeticin TA en ADN no replicante. Las
regiones desajustadas forman bucles de cadena sencilla, que pueden ser blancos de reparacin de
escisin o desajuste. El resultado (una delecin o una insercin) depender de qu hebra se extiende
o se repara y qu hebra se usa como molde en el proceso de reparacin del ADN.
Mecanismos Generadores de Mutaciones

Mutagnesis espontnea

Mutaciones de origen natural pueden surgir en cualquier clula sin causa aparente. Resultan de
cuatro mecanismos principales: (1) errores de polimerizacin del ADN; (2) dao oxidativo
espontneo del ADN; (3) prdida de una base de purina, o menos frecuentemente, prdida de una
base de pirimidina; Y (4) desaminacin de citosina y adenina.

Errores de polimerizacin

Mutaciones puntuales, generalmente transiciones, surgen como resultado de dos sucesivos

procesos defectuosos: (1) un error en la replicacin del ADN; (2) una reparacin ineficiente de los
desajustes generados. La ADN polimerasa incorpora una base incorrecta a una frecuencia de
aproximadamente 10 ^ {2} 6 a 10 ^ {7} 7 por par de bases por clula por generacin. Normalmente,
la base incorrecta se elimina mediante la reparacin de la falta de concordancia, lo que reduce la
tasa global de errores de replicacin y postreplicacin hasta 10 2 9 a 10 2 10 por par de bases por
celda por generacin (frecuencias observadas en E. coli). El deslizamiento de replicacin, tambin
llamado deslizado de la cadena de mispairing, es uno de los principales mecanismos que explica las
mutaciones frameshift que ocurren en las repeticiones cortas contiguas (Figura 4].

Incorporacin de una base oxidada

Exposido al oxgeno, la guanina est sometida a oxidacin, produciendo 8-oxo-G. Esta base anormal
se desliza en el ADN, generando transversiones. Afortunadamente, existe un elaborado sistema de
reparacin que elimina 8-oxo-G o disminuye las consecuencias de su incorporacin. Tal sistema de
reparacin es omnipresente, protegiendo el ADN de las lesiones debidas al oxgeno. En resumen, el
oxgeno que respiramos no es inofensivo. El oxgeno es un agente daino del ADN y puede
desempear un papel en el proceso de envejecimiento. El nmero de impactos oxidativos al ADN
se ha correlacionado con la cantidad de productos de descomposicin de ADN liberados en orina
humana y de rata. El nmero de impactos oxidativos al ADN por clula por da es de alrededor de
100.000 en la rata y alrededor de 10.000 en el humano. La diferencia de 10 veces puede resultar en
parte de la mayor tasa metablica de roedores, que es al menos cinco veces mayor que la de los
mamferos. La accin mutagnica de 8-oxo-G sugiere que no hay fronteras claras entre los agentes
de DN "naturales" y "artificiales". La diferencia entre mutaciones espontneas e inducidas es
tambin borrosa cuando el aire que respiramos induce la insercin de xidos en el ADN.

Prdida de una base nucleica

Esta es la lesin espontnea ms frecuente. El enlace entre el azcar y la base puede ser cortado,
liberando una base libre y dejando un hueco en la secuencia de bases, generando as un sitio absico
(apurnico o apyrimidinic). La prdida de una base de purina es ms frecuente que la prdida de una
base de pirimidina. La replicacin sobre un sitio absico puede producir una mutacin puntual, ya
que la polimerasa no tiene forma de determinar la identidad de la base que falta que tiene que
copiar. Por un truco afortunado de la naturaleza, la adenina se coloca a menudo enfrente de la base
que falta. Cuando la base que falta es timina, la colocacin de adenina restaura el cdigo de ADN.

Deslaminacin
Este proceso puede convertir la citosina en uracilo y adenina en hipoxantina. La conversin de
citosina en uracilo es la principal causa de la hipermutacin de la inmunoglobina, lo que explica
cmo se producen medio milln de anticuerpos que constituyen nuestro repertorio inmunolgico.

Mutaciones inducidas

Pueden resultar de tres mecanismos diferentes: (1) una base en el ADN es reemplazada por un
anlogo de base que confunde la polimerasa; (2) una base se altera qumicamente de manera que
se equivoca con otra base durante la replicacin; (3) una base se reemplaza por una brecha de una
hebra de ADN para que no transmita ninguna informacin de codificacin. En el ltimo caso, se
induce un mecanismo replicativo de baja fidelidad (reparacin mutagnica SOS) que evita la lesin.

Sustitucin de la base por un anlogo de base

2-Aminopurina es un anlogo de base porque imita una base normal. Cuando se incorpora al ADN,
provoca frecuentes mispairing.

Desajuste por alquilacin de bases

Los agentes alquilantes tales como el etil-metanosulfonato y el MNNG (N-metil-N'-nitro-N-

nitrosoguanidina) producen un error de asociacin. Aunque estos agentes modifican diferentes
bases en varias posiciones, las alquilaciones en la posicin O6 de la guanina y en la posicin O4 de
la timina causan un mal funcionamiento especfico con T y con G, lo que lleva a transiciones GC $ AT
y AT $ GC. In vivo, las mutaciones son producidas principalmente por O6-alquilguanina o O4-
alquiltimina.

Lesiones no codificantes

Se producen lesiones especficas de ADN en el ADN irradiado con luz ultravioleta: dmeros de
pirimidina y compuestos de 6-4 pirimidina-pirimidona. Tales lesiones agudizan bruscamente el ADN,
impidiendo as el apareamiento preciso de bases durante la replicacin.

La mayora de los mutgenos son carcingenos. La prueba de Ames

Los genetistas consideran que las mutaciones espontneas son relativamente raras. Para aumentar
la apariencia de las mutaciones, han utilizado varios mutgenos. Sabemos que la mayora de los
mutgenos daan el ADN. Bruce Ames hizo una pregunta interesante: Los mutagnicos causan
cncer? Ames y sus colaboradores desarrollaron una prueba de mutagenicidad utilizando cepas de
prueba de Salmonella (su 2) que requieren histidina para su prueba de bacterias. crecimiento. Las
bacterias testigo tratadas con un potencial carcingeno fueron verificadas para la produccin de sus
mutaciones +, permitiendo a las bacterias crecer sin histidina. Para ser eficientes, las cepas de
ensayo bacterianas fueron diseadas de manera que: (1) no se eliminaran las lesiones de ADN
producidas por el producto qumico ensayado; (2) para aumentar la velocidad de mutacin
mediante un plsmido mutante; Y (3) hacer que las cepas del testador sean permeables a
compuestos qumicos. El producto qumico se mezcla con enzimas hepticas de rata para simular la
metabolizacin del compuesto por un hgado humano. En resumen, la prueba utiliza una quimera
fisiolgica transitoria hecha de enzimas de rata ms bacterias permeables. Se observ que, a pesar
de que las bacterias estn evolutivamente distantes de los roedores y los seres humanos, que
proporcionan una excelente herramienta para medir la mutagenicidad y, por tanto, potencial
carcinogenicidad. Los resultados de las pruebas han demostrado que el 65% de los compuestos
qumicos probados, que son carcingenos en roedores, son mutgenos en bacterias. Lo contrario
tambin es cierto: la mayora de los mutgenos son carcingenos activos. El uso de la prueba de
Salmonella para detectar posibles carcingenos ha ahorrado tiempo, dinero y sufrimiento para los
animales. Debido a que la prueba de mutagenicidad de Ames es rpida, precisa y relativamente
simple, muchas agencias y laboratorios de todo el mundo han probado los productos qumicos
recientemente producidos por su mutagenicidad y potencial carcinogenicidad. En la Unin Europea,
la prueba de Ames se ha convertido en obligatoria.

Carcingenos No Dejan Firmas Mutacionales Definidas

En las clulas humanas, un gen llamado p53 expresa una protena que previene la aparicin de
cnceres. La protena p53 est implicada en el control de la divisin celular y, por lo tanto, es un
antioncogn. Sorprendentemente, se encuentra una mutacin p53 en ms de la mitad de todos los
tipos de cncer tomados en conjunto, el 90% de los cuales son mutaciones puntuales y dos tercios
de ellos son transiciones GC! A. En contraste, en los cnceres bronquiales se encuentra que el 45%
son GC! TA transversiones. El benzopireno, el principal mutgeno presente en el humo del tabaco,
produce GC! TA transversiones a baja frecuencia. Ms generalmente, el hallazgo en las clulas
cancerosas de un GC? TA transversin en p53 probar que el benzopireno ha causado la mutacin?
Dado que una gran variedad de carcingenos, incluyendo muchos contaminantes, causan GC! TA
transversiones, la respuesta es negativa. Una mutacin puntual es un cambio de ADN frecuente y
tan pequeo que no puede tomarse solo como una marca dejada por un carcingeno. Para
proporcionar pruebas legales, una secuencia de ADN mutada debe ser larga y variada lo suficiente
como para ser exclusiva. La probabilidad de encontrar otra copia idntica de una determinada huella
digital de ADN es inferior a 10 2 8. Los microsatlites de ADN, cuyas longitudes se encuentran entre
1000 y 20 000 bases, proporcionan una prueba legal vlida de identificacin. Slo unos pocos
productos qumicos son reconocidos legalmente como cancergenos. Por ejemplo, el amianto, un
mineral oxidante, causa un tipo nico de tumor. El yodo radioactivo ingerido por los nios despus
del accidente nuclear de Chernobyl se ha encontrado para romper un cromosoma especfico en las
clulas de cncer de tiroides. Aparte de algunas excepciones, todava existe una relacin causal
discutible entre los tipos de mutacin inducidos por carcingenos y tumores especficos. Esta
realidad socava el concepto de que los carcingenos podran dejar una "firma mutacional" en el
ADN.
MUTSGENESIS

Las mutaciones tienen un potencial para efectos positivos o negativos sobre un organismo. Para
combatir los efectos deletreos de la mutagnesis excesiva, los sistemas elaborados de enzimas han
evolucionado para corregir los errores que surgen espontneamente en las clulas o inducidos tras
el dao del ADN. Sin embargo, el ADN debe necesariamente cambiar a medida que los organismos
evolucionan, por lo que se tolera un bajo nivel de mutagnesis, tal vez incluso se promueva para
asegurar niveles normales y saludables de variacin gentica de las poblaciones.

Introduccin

Las cuestiones fundamentales relativas a la naturaleza de las mutaciones, los mecanismos de

mutagnesis y los factores que controlan las tasas de mutagnesis han estado en el centro de un
intenso estudio en las ltimas dcadas. Los investigadores en mutagnesis han hecho grandes
progresos en la comprensin de los orgenes de las mutaciones y sus efectos en amplios procesos
biolgicos, como la carcinognesis y la evolucin. En este artculo se examinan una serie de mtodos
y estrategias que permiten la deteccin de eventos mutagnicos raros en sistemas procariotas y
eucariotas. Mecanismos moleculares para la mutagnesis se describen, con especial nfasis en el
mecanismo de aumento de las tasas de mutacin asociada con SOS induccin en sistemas
bacterianos.

Mutaciones y definiciones mutantes

Los investigadores de varias disciplinas (por ejemplo, la gentica, la fsica, la bioqumica, la biologa
molecular y la biologa de la radiacin) han hecho valiosas contribuciones a nuestra comprensin
actual de la mutagnesis, al mismo tiempo desarrollando un vocabulario extenso y "rico" para
describir la reparacin y la mutagnesis. Debido a que estos trminos pueden ser desconocidos o
incluso confusos, se intentar mantenerlos al mnimo y ofrecer definiciones a medida que se
encuentren. El trmino mutacin se refiere a cualquier cambio en el material gentico (ADN) que
sea heredable. La secuencia normal antes de la introduccin de una mutacin se denomina tipo
salvaje, la forma que se encuentra en la naturaleza o en el 'salvaje'. Sin embargo, el 'tipo salvaje' no
se define fcilmente, ya que en la naturaleza hay muchos individuos dentro de poblaciones de la
misma especie con variacin gentica significativa. Por lo tanto, la designacin de tipo salvaje es
usualmente un linaje arbitrariamente elegido que puede usarse como referencia. Las mutaciones
pueden agruparse mediante una serie de criterios que van desde descripciones de las consecuencias
fisiolgicas de una mutacin (es decir, fenotipo) hasta notas moleculares sistemticas. Aunque las
descripciones de los fenotipos (por ejemplo, dominantes, albinos, sensibles a la temperatura, etc.)
pueden ser informativas, tambin pueden ser engorrosas. Las listas extensas de cambios en la
secuencia de nucletidos (por ejemplo, la transicin de C102 a T en el gen 'X') son designaciones
precisas, pero tambin pueden llegar a ser tediosas y sin sentido a menos que se describan en el
contexto gentico molecular apropiado. Para el propsito de este artculo, es muy til agrupar
mutaciones sobre la base de alteraciones de la secuencia de ADN, pero limitar esta discusin a
conceptos generales y clases de mutaciones. Este artculo tambin comparar las clases mutantes
prominentes con respecto a los cambios en la secuencia, los mecanismos mutacionales y relacionar
el significado evolutivo de cada clase. Las mutaciones se pueden clasificar convenientemente en dos
grupos amplios: (1) mutaciones puntuales, que a menudo son alteraciones relativamente sutiles que
implican uno o pocos cambios de nucletidos y (2) reordenamientos, que son alteraciones
cromosmicas ms extensas o "severas" que involucran segmentos de cientos o incluso Millones de
nucletidos.

Mutaciones puntuales

Las mutaciones puntuales ms simples son sustituciones de una sola base, que surgen cuando se ha
insertado una base incorrecta en el lugar del correcto; Se subcategorizan como transiciones y
transversiones. Las transiciones son la forma ms simple de mutacin, que implica la sustitucin de
una pirimidina por otra o una purina por otra purina. Las trans- versiones son tambin relativamente
sencillas, pero implican conmutadores de un tipo de base para otro tipo (por ejemplo, una pirimidina
a una purina) Tabla 1). El efecto de una sustitucin dada depende del contexto informativo de esa
mutacin. Por ejemplo, una sustitucin de la base "fuera" de un gen puede no producir un fenotipo
mutante y puede denominarse mutacin silenciosa. Tambin se pueden observar mutaciones
silenciosas dentro de los genes. Algunas sustituciones de nucletidos dentro de un codn de tres
bases no cambian su codificacin. Por ejemplo, una sustitucin en un codn de AGA a AGG sera
una mutacin silenciosa ya que ambos tripletas de nucletidos codifican para el mismo aminocido,
la arginina. Aunque las mutaciones silenciosas pueden ocurrir tanto dentro como fuera de los genes,
la probabilidad de una sustitucin de nucletidos que produce una mutacin con consecuencias
fenotpicas aumenta mucho dentro de los genes. Una sustitucin de bases dentro de la regin
codificante de la protena de un gen a menudo resultar en una codificacin errnea de un residuo
de aminocido produciendo de este modo una protena mutante. Algunas sustituciones producirn
protenas mutantes totalmente defectuosas y se denominarn mutaciones nulas. Sin embargo, el
efecto de una sustitucin de aminocidos puede ser ms sutil, produciendo una protena mutante
con una prdida parcial de actividad, o ocasionalmente un aumento en la actividad. Por ejemplo, se
cree que las mutaciones de una sola base son esenciales en el desarrollo de nuevas especies; Los
cambios de mutantes pueden ser lo suficientemente sutiles para afinar un proceso, posiblemente
hacindolo ms eficiente en una situacin dada (Friedberg et al., 1995; Snyder y Champness, 1997).
Las mutaciones de desplazamiento de cuadros se producen dentro de una regin codificadora de
protenas de un gen; Estas mutaciones surgen de adiciones o deleciones de una o pocas bases que
no son mltiplos de tres (ms comnmente + 1, +2, +4 o + 5 bases). Mutaciones de cambio de marco
son caractersticamente la forma ms grave de mutacin puntual porque casi siempre producen
mutaciones nulas. Todos los codones que estn hacia abajo (es decir, distal) de la mutacin de
desplazamiento de marcos estarn fuera de registro y, por tanto, sern mal codificados Tabla 1). La
regin codificada errneamente es tpicamente tan diferente de la secuencia gnica normal que las
mutaciones de cambio de marco generalmente hacen que las protenas mutantes no funcionen por
completo. Las mutaciones que inactivan genes tambin pueden ser cambiadas de nuevo (o
revertidas) para restaurar la funcin completa. La probabilidad de una mutacin de reversin suele
estar relacionada con la complejidad de una mutacin. Por ejemplo, las clases ms simples de
cambios de secuencia, tales como mutaciones de transicin, tienen ms probabilidades de
revertirse que otras alteraciones cromosmicas ms extensas, tales como deleciones (vase ms
adelante).
a Se muestran cuatro codones de tipo salvaje de un gen y se indica a continuacin el aminocido codificado por cada uno. La eliminacin de una base
(subrayada) da como resultado un cambio en la codificacin de secuencias adyacentes, produciendo una protena altamente alterada.

Reordenamientos de Secuencia

Los reordenamientos son alteraciones de secuencia ms drsticas que las mutaciones puntuales.
Los reordenamientos pueden involucrar slo unas pocas bases (\ Delta 10) o grandes segmentos de
cromosomas que implican millones de pares de bases. Estos dramticos reordenamientos se
clasifican en cuatro subclases generales: deleciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones
(Tabla 2). Se cree que muchos de estos reordenamientos se producen por el funcionamiento
aberrante de las enzimas de recombinacin, reparacin o replicacin de la clula y tambin se
pueden producir en respuesta al dao del ADN. Las supresiones eliminan segmentos de ADN. Estos
pueden dar lugar a la prdida de segmentos sustanciales de los cromosomas incluyendo uno o
muchos genes. Un gen eliminado no slo sera una mutacin nula, pero como este ADN no puede
ser recuperado por un evento mutacional subsiguiente, no puede ser revertido. Las deleciones
ocurren a frecuencias sorprendentemente altas en una serie de organismos. Debido a esta
abundancia relativa, se ha sugerido que las supresiones pueden jugar un papel significativo en la
creacin de la diversidad gentica (Mahan y Roth, 1991, Miller, 1992, Snyder y Champness, 1997).
Inversiones y translocaciones son dos clases adicionales de reordenamientos cromosmicos, pero
no necesariamente producen una prdida o ganancia neta de ADN. Las inversiones resultan de
'voltear' el orden de un segmento cromosmico y, como resultado, todos los genes en ese segmento
se colocan en la orientacin opuesta con respecto al resto del cromosoma. Las translocaciones son
mutaciones en las que un fragmento de ADN se ha movido de una localizacin cromosmica a otra.
Los eventos mutagnicos que producen inversiones o translocaciones parecen ser relativamente
raros en comparacin con deleciones (Mahan y Roth, 1991). Las duplicaciones son reordenamientos
que producen una ganancia neta de ADN. Se definen como la formacin de copias adicionales de
segmentos cromosmicos. Las duplicaciones ocurren a una tasa moderadamente alta y se cree que
desempean un papel especialmente importante en la evolucin (Mahan y Roth, 1991; Miller,
1992). La presencia de mltiples copias de un gen a travs de la duplicacin permite la aparicin de
mutaciones en la copia 'extra' sin consecuencias perjudiciales porque la copia 'primaria' puede
permanecer sin cambios y por lo tanto seguir codificando un producto gnico completamente
funcional (Snyder y Champness, 1997). ). La acumulacin de mltiples mutaciones puntuales en
copias duplicadas podra eventualmente producir un producto (s) gentico (s) divergente (s),
permitiendo a los organismos generar nuevas funciones diversas. Se cree ampliamente que el
proceso de duplicacin de genes y luego de divergencia es esencial en la evolucin de especies con
mayor complejidad. Una clase especial de reordenamientos son causados por elementos genticos
transponibles, o transposones. Estos "genes saltadores" son segmentos de ADN que usualmente
codifican enzimas que promueven su propio movimiento. Elementos transponibles han sido
identificados en numerosos organismos, incluyendo bacterias, eucariotas inferiores, insectos y
muchos mamferos. Aunque por lo general son raros, el movimiento de elementos transponibles
puede promover una variedad de reordenamientos cromosmicos y se considera que son una
fuerza motriz para el cambio evolutivo.

a
Las letras indican intervalos de genes en el ADN bicatenario.
b
Las letras maysculas representan un segmento de ADN que se ha insertado en una nueva
ubicacin. Cada reordenacin produce una "nueva unin" (-) que conecta dos segmentos de ADN
que no estn normalmente unidos. La colocacin de un segmento junto a un segmento diferente
puede tener consecuencias fenotpicas, como la alteracin de la expresin gnica.

Mutagnesis Espontnea

La mutagnesis natural o espontnea se refiere a alteraciones genticas que ocurren sin exposicin
aparente a agentes que daan el ADN. Se cree que la mayora de las mutaciones espontneas se
producen a partir de una combinacin de errores de replicacin y dao espontneo al ADN. Los
nucletidos ocasionalmente son mal incorporados por una polimerasa de ADN (ADN pol)
produciendo desajustes en la hebra de ADN recin sintetizada (es decir, hebra naciente). Un nmero
de ADN polimerasas celulares, tales como la polimerasa replicativa mayor de Escherichia coli (ADN
pol III) tienen la capacidad de detener la sntesis de ADN despus de una insercin incorrecta de la
base y, a continuacin, eliminar esa falta de concordancia (Figura 1). La eliminacin de los desajustes
se denomina revisin y se logra mediante una actividad exonucleasa 3 '- 5' de ADN pol III, extirpando
una porcin de la hebra naciente incluyendo el desajuste. El ADN pol luego reanuda la sntesis de la
hebra naciente. La exactitud proporcionada al ADN pol III a travs de la seleccin de bases y
correccin de pruebas es impresionante, resultando en un solo error por 105 a 106 bases replicadas.
Sin embargo, incluso este alto nivel de exactitud es insuficiente y no podra ser tolerado por un
organismo. Por lo tanto, hay una serie de sistemas de vigilancia celular adicionales que identifican y
eliminan los desajustes. Debido a los efectos colectivos de los diferentes mecanismos de edicin /
vigilancia, organismos como E. coli pueden mantener una estabilidad gentica en la que se producen
errores aproximadamente una vez en 1010 bases replicadas (Friedberg et al., 1995). El ADN presente
en las clulas tiene una estabilidad qumica finita que es en gran medida un reflejo del dao fsico y
fsico espontneo que sufre. Para mantener la mutagnesis espontnea en un mnimo, hay una serie
de sistemas de reparacin que exploran los cromosomas para las formas ms comunes de las bases
daadas. Si una base daada no se elimina antes de que el ADN pol encuentre ese sitio en la plantilla,
pueden surgir mutaciones. La desaminacin de bases es relativamente frecuente y es
potencialmente una de las formas ms mutgenas de dao espontneo. Por ejemplo, la
desaminacin de la citosina producir uracilo, que durante la replicacin del ADN codificar la
adicin de adenina (A) en la hebra naciente. Tales eventos daran lugar a mutaciones de transicin
C a T (o G a A en la cadena complementaria). En este ejemplo, la polimerasa no comete un error; En
cambio el cambio de la citosina a uracilo presenta desinformacin a la pol de ADN (Friedberg et al.,
1995). El dao oxidativo al ADN es otra causa importante de mutagnesis espontnea. Las especies
reactivas del oxgeno tales como el perxido de hidrgeno y el superxido se estn produciendo
continuamente como subproductos de la respiracin celular normal. Una falla en la reparacin del
dao oxidativo tambin contribuye a la mutagnesis espontnea. Muchas mutaciones espontneas
tambin resultan de inserciones por transposones. Cuando un transposn salta en un gen, la
insercin de este gran segmento de ADN a menudo interrumpir la continuidad lineal del gen, dando
lugar a una mutacin nula. El nivel de mutagnesis espontnea debido a la transposicin es
altamente variable y por lo general refleja el tipo de transposn (es) presente (s) en ese organismo.
Figura 1 Actividad de correccin de la polimerasa de ADN. Despus de una insercin incorrecta de
un nucletido ('Error'), DNA pol se detiene, invierte la direccin (3 '} 5') y elimina una parte de la
hebra naciente (hebra azul superior) que incluye el error as como parte de los alrededores
Nucletidos. Despus de la eliminacin de las secuencias, se reanuda la sntesis de la hebra
naciente.

Mutagnesis inducida

Las tasas de mutacin pueden incrementarse por condiciones que daan el ADN. Cualquier agente
qumico o fsico que aumenta la mutagnesis se denomina mutagnico. La mutagnesis inducida
por la exposicin al dao se define como mutagnesis inducida. Los mutgenos introducen algn
cambio qumico en el ADN, como alteracin de las bases o tal vez rompiendo el esqueleto azcar-
fosfato. Una base daada o segmento de ADN no es realmente una mutacin; Se refiere en cambio
como una lesin premutacional. La formacin de una mutacin depende generalmente de la
operacin aberrante de algn proceso celular (por ejemplo, replicacin o recombinacin del ADN)
despus de encontrar una lesin premutacional (Friedberg et al., 1995: Snyder y Champness, 1997).
Diversos tipos de radiacin son mutagnicos. Los rayos X producen rupturas en el ADN y los intentos
de reparar estos cortes por recombinacin pueden llevar a cambios genticos dramticos tales
como deleciones, translocaciones y otros reordenamientos cromosmicos. La radiacin ultravioleta
(UV) cataliza la unin de bases de pirimidina adyacentes, y estas bases unidas, o dmeros, suelen dar
lugar a mutaciones puntuales. Muchos de los primeros anlisis moleculares sistemticos del dao
del ADN y la mutagnesis utilizaron los rayos UV, y nuestra comprensin de sus efectos es
probablemente la ms extensa. Los fotoproductos UV ms abundantes son los dmeros de
pirimidina-ciclobutano. Se producen las cuatro posibles combinaciones de dmeros (T-T, T-C, C-T y
C-C), pero los dmeros T-T son los ms comunes. Cada dmero de ciclobutano acta como un
obstculo que hace que una ADN polimerasa se detenga, aunque ocasionalmente el ADN pol
contina la sntesis ms all del dmero e insertar la base incorrecta (vase ms adelante). La clase
ms prominente de las mutaciones inducidas por UV son las transiciones, seguidas por otros tipos
de mutaciones puntuales. El bloqueo por ADN pol en fotoproductos UV (as como otras lesiones
relacionadas) inducir un proceso de reparacin celular del ADN. En las bacterias se denomina
respuesta SOS que implica la expresin aumentada de una serie de genes cuyos productos no slo
ayudan a la clula a sobrevivir al dao del ADN sino que tambin aumentan las tasas de mutacin
(Friedberg et al., 1995; Frank et al., 1996; abajo).

Los mutgenos qumicos se clasifican en cuatro grupos generales, basados en el mecanismo por el
cual interactan con el ADN (Snyder y Champness, 1997). (1) Los anlogos de la base son
estructuralmente similares a las bases; Tienen su efecto mutagnico al ser incorporados en el ADN
y causar un mal cumplimiento durante la replicacin. (2) Los agentes intercalantes son
generalmente molculas planas que pueden encajar entre bases, produciendo distorsiones de
hlice que pueden conducir a errores de replicacin. (3) Los productos qumicos que reaccionan con
el ADN, como el oxgeno reactivo, pueden modificar directamente las bases, cambiando los grupos
de codificacin y permitiendo as el emparejamiento de bases con la base incorrecta. (4) Los agentes
alquilantes se unen covalentemente al ADN y dan como resultado la adicin de algn grupo orgnico
a las bases o posiblemente al esqueleto azcar-fosfato. Los grupos alquilantes varan ampliamente
en tamao y producen mutaciones por diversos mecanismos. La adicin de pequeos grupos alquilo
puede modificar la codificacin de una base y, de este modo, presentar una desinformacin durante
la replicacin del ADN. Las bases alteradas por grandes grupos voluminosos usualmente no exhiben
su potencial mutagnico por replicacin de informacin errnea; En su lugar, la ADN polimerasa se
bloquea a menudo en estas bases modificadas. Estos aductos voluminosos actan como potentes
inductores de la respuesta SOS (Friedberg et al., 1995, Frank et al., 1996). La induccin de SOS puede
conducir a la replicacin propensa a errores ms all de una serie de lesiones premutationales
(vase ms adelante).

Sistemas para detectar y analizar las mutaciones

Por lo general, las mutaciones son relativamente raras, y sera necesario buscar a travs de miles o
incluso millones de individuos para detectar una sola mutacin. Este enfoque se denomina a veces
una pantalla de fuerza bruta y generalmente se considera que no es prctico. Debido a esto se han
ideado una serie de enfoques ms prcticos para detectar cambios genticos raros. El enfoque ms
poderoso depende de la seleccin directa de mutantes, aprovechando las sustancias letales (es
decir, toxinas, antibiticos, virus, etc.) que pueden matar a toda una poblacin, excepto aquellos
raros mutantes resistentes a una sustancia dada (Miller, 1992; Friedberg Et al., 1995, Snyder y
Champness, 1997). Por ejemplo, estudios de mutagnesis temprana usaron potentes virus que
mataron rpidamente al husped bacteriano, permitiendo a los investigadores seleccionar
mutantes raros resistentes a un virus en particular (10 2 6 a 10 2 8).

La mayora de los ensayos se clasifican como ensayos de mutagnesis directa o mutagnesis de

reversin. La mutagnesis hacia adelante se refiere a mutaciones que inactivan un gen funcional;
Mutagnesis de reversin, es esencialmente el evento recproco, en el que una mutacin restaura
la funcin normal. Los ensayos directos detectan un espectro diverso de cambios ya que las
mutaciones que alteran un gen estn en cada clase (por ejemplo, transiciones, cambios de marcos,
deleciones, etc.) y se producen en numerosos lugares dentro del gen. Al principio del estudio de la
gentica bacteriana, se desarrollaron ensayos de mutagnesis que aprovecharon tanto la seleccin
como la mutagnesis directa del gen lacI. El gen lacI codifica el represor del opern de utilizacin de
lactosa (lacZYA) de E. coli y mutaciones nulas conducen a la expresin continua (es decir,
constitutiva) de ese opern. Una seleccin se bas en la propiedad de que los mutantes lacI2
podran utilizar un azcar sinttico (fenilb-d-galactsido) y crecer debido a que el opern lac se
expres constitutivamente (Miller, 1992, Snyder y Champness, 1997).

Para aclarar qu tipos de mutaciones ocurren en diferentes condiciones, los investigadores han
aislado un gran nmero de mutantes en genes bien caracterizados (llamados objetivos mutagnicos)
y han determinado los cambios en la secuencia de ADN para cada mutante. Colectivamente, los
estudios de secuencias de nucletidos han revelado que todas las clases de mutaciones puntuales
estn bien representadas, siendo las transiciones usualmente las ms abundantes, seguidas de
transversiones (Miller, 1992; Friedberg et al., 1995). Una explicacin de la abundancia relativa de
estas sustituciones de un solo nucletido es que los errores de replicacin ms sutiles pueden tener
la mayor probabilidad de evitar la correccin de pruebas y / o sistemas de vigilancia celular. Estos
estudios tambin concluyeron que el tipo de alteraciones espontneas, las frecuencias mutantes y
la localizacin de los cambios, cambiaron completamente con la exposicin al dao evidente del
ADN. Estos y otros estudios han llevado a la comprensin de que los procesos de mutacin que
resultan de la mutagnesis espontnea son fundamentalmente diferentes de los que resultan de la
mutagnesis inducida (Miller, 1992, Friedberg et al., 1995, vase ms adelante). Debido a que la
mutagnesis lacI se ha utilizado ampliamente, se ha desarrollado una impresionante base de datos
mutacional para este objetivo. Para aprovechar esto, el lacI tambin se ha empleado como un
blanco mutagnico para estudios eucariotas (vase ms adelante). Los ensayos de mutagnesis de
reversin implican tpicamente la inversin de una mutacin puntual para restablecer una funcin
seleccionable y se han utilizado ampliamente en sistemas bacterianos y fngicos. Las cepas que
llevan una mutacin en un gen que bloquea un paso en un proceso importante, tal como la va
biosinttica de la histidina (es decir His2), no pueden crecer en un medio mnimo que carece de
histidina. Dado que slo las clulas que pueden sintetizar histidina (His 1) pueden crecer en este
medio, se hace posible seleccionar directamente incluso para sus clulas His 1 revertantes (por
ejemplo 10 2 4 -10 2 7). La prueba de Ames es una aplicacin de un His 2 a His 1 ensayo de reversin
en la bacteria Salmonella typhimurium (Ames et al., 1975). La prueba de genotoxicidad de Ames
implica exponer la cepa de prueba apropiada de His 2 a algn compuesto mutagnico candidato,
revestirlo con un medio mnimo y despus determinar si la exposicin da lugar a una frecuencia
aumentada de His 1 colonias reversibles. En un esfuerzo por aplicar este ensayo bacteriano a la
genotoxicidad en sistemas de mamferos, primero se incuba un compuesto con extractos de hgado
de rata, que simula el metabolismo de un agente mutagnico potencial que ocurre en un animal
completo. Debido al hecho de que la mayora de los agentes conocidos por causar cncer
(carcingenos) tambin son mutgenos, este ensayo condujo a un estudio extenso de compuestos
qumicos (Friedberg et al., 1995). El nmero de productos qumicos naturales y sintticos que han
sido identificados como mutgenos por la prueba de Ames es impresionante y sugiere que los
procesos de reparacin humana deben hacer frente a una exposicin sustancial a mutgenos
(Sancar, 1995). Aunque la mayora de los mutgenos identificados por el ensayo de Ames eran
tambin mutagnicos cuando se ensayaban en sistemas de mamferos, algunas sustancias exhiban
un potencial mutagnico diferente en procariotas y en animales (Friedberg et al., 1995). Estas y
otras observaciones subrayaron la importancia de desarrollar ensayos de mutagnesis convenientes
en mamferos para proporcionar mejores estimaciones de genotoxicidad para seres humanos.

Anlisis de mutagnesis en clulas de mamferos

Factores como el tamao del genoma, la complejidad del genoma, la escasez de estrategias
convenientes de seleccin gentica (en comparacin con las bacterias y hongos) y los tiempos de
generacin prolongados han presentado un reto especial para los anlisis moleculares de
mutagnesis de mamferos. Para minimizar algunos de estos problemas, gran parte de los estudios
de mutagnesis molecular temprana se llevaron a cabo sobre genes diana llevados a cabo en
vectores pequeos derivados del virus Simian 40 (SV40) (Siedman et al., 1985). La estrategia general
fue infectar una lnea celular de mamfero susceptible, luego despus de la replicacin en estas
clulas para recuperar el ADN del vector y examinar la presencia de mutaciones. El desarrollo de
"vectores lanzadera" que se pueden propagar tanto en mamferos como en hospedadores
bacterianos mejor sustancialmente la utilidad de estos sistemas (Figura 2). Estos vectores
usualmente consistan en un objetivo mutagnico procariota, secuencias de SV40 para replicacin
en hospedadores de mamferos, un origen de replicacin para bacterias y un gen de seleccin de
antibiticos (Siedman et al., 1985).

El uso de genes diana procariticos establecidos (por ejemplo, lacI) ha proporcionado ventajas
significativas en el estudio de la mutagnesis de mamferos: en primer lugar, la utilizacin de
ensayos de deteccin de mutantes convenientes en bacterias; Segundo, el acceso a mtodos rpidos
de biologa molecular; Y tercero, la capacidad para comparar los cambios de secuencia producidos
en clulas de mamfero con la extensa base de datos mutagnica acumulada durante dcadas de
investigacin de mutagnesis bacteriana (Siedman et al., 1985; Miller 1992; Friedberg et al., 1995).
Figura 2 Sistema vectorial de desplazamiento. Una representacin hipottica de un mapa de
plsmido de vector lanzadera y enfoque general utilizado para detectar mutaciones que surgen
en clulas de mamferos. Los vectores de lanzadera pueden comprender varios segmentos,
incluyendo una secuencia diana mutagnica (roja), secuencias para seleccin y replicacin en
Escherichia coli (azul) y secuencia para replicacin en una lnea celular de mamfero. El vector
puede introducirse en el husped mamfero apropiado y luego exponerse al tratamiento
mutagnico de inters (por ejemplo, ultravioleta). El vector de ADN se recupera de una lnea
celular, a continuacin se introduce en la cepa de E. coli apropiada ('tester strain') para la
deteccin rpida de mutaciones en la secuencia diana bacteriana (por ejemplo lacI).

Los primeros estudios con vectores lanzadera detectaron sorprendentemente altas frecuencias de
mutacin espontnea que condujeron a algunas reservas sobre su fiabilidad. Las modificaciones de
los vectores lanzadera y la identificacin de lneas celulares alternativas redujeron las frecuencias
mutantes espontneas. Sin embargo, las reservas sobre la fiabilidad de muchos sistemas de
lanzadera persistieron, ya que los niveles de mutagnesis eran altamente variables y porque algunos
vectores virales no se replicaban en sincrona con la regulacin normal del ciclo celular (Friedberg
et al., 1995; Sancar, 1995). Para simular mejor el riesgo humano, sera claramente preferible
examinar la mutagnesis de un objetivo cromosmico de animales enteros, lo que refleja el
metabolismo normal de los mutgenos por las enzimas desintoxicantes del hgado y la sincrona
normal de la replicacin del ADN. Adems, podran abordarse otras cuestiones, como el impacto
mutagnico de un determinado carcingeno qumico en diversos tipos de tejidos (por ejemplo, el
hgado, la piel o el cerebro). Un avance que facilit estudios de mutagnesis animal fue el desarrollo
de animales "transgnicos" endogmicos que portaban diferentes vectores lanzadera. Se
construyeron artificialmente roedores que portaban un gen diana procaritico (por ejemplo, lacI)
que se puede recuperar y examinar para mutaciones (Kohler et al., 1991). Estos animales
transgnicos llevan un vector lanzadera derivado de un virus procaritico (l) incorporado en el
genoma, que se repite pasivamente con las secuencias cromosmicas circundantes durante la fase
apropiada del ciclo celular (Sphase). Despus del tratamiento por un mutgeno, el ADN se asla de
los tejidos y se recupera el vector que porta el blanco mutagnico. El vector puede recuperarse
selectivamente de las secuencias de ratn circundantes sometiendo el ADN a un extracto de
envasado in vitro. El envase l produce partculas vricas intactas que, a su vez, se utilizan para infectar
la cepa de ensayo de E. coli apropiada en la que se detectan mutaciones. Usando estos mtodos
genticos moleculares establecidos y convenientes, las frecuencias mutantes y los cambios en la
secuencia de nucletidos pueden determinarse fcilmente y compararse con una base de datos
mutacional extensa (Kohler et al., 1991, Miller, 1992). La disponibilidad de estos sistemas de
mutagnesis transgnica ofrece una mejora significativa en la estimacin del potencial mutagnico
de un tratamiento dado. No obstante, la extrapolacin del riesgo para las personas a partir de datos
de animales puede ser incierta y compleja. Estudios posteriores y la aplicacin de tecnologas
rpidas como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tejidos humanos probablemente
desempearn papeles importantes en el futuro para mejorar nuestra comprensin de la
mutagnesis en humanos (Friedberg et al., 1995).

Bases moleculares de la mutagnesis en E. coli

Se ha demostrado que E. coli y otras bacterias tienen una combinacin notablemente precisa de
procesos replicativos y de reparacin (se produce un error una vez cada 1010 bases replicadas). Las
clulas expuestas a una variedad de mutgenos, especialmente aquellas que producen aductos
voluminosos, dan como resultado un aumento dramtico en la tasa de mutacin (Weigle et al.,
1995, Frank et al., 1996). Este aumento usualmente no ocurre pasivamente, sino que requiere la
induccin de protenas de procesamiento de dao altamente especializadas. El aumento de la
mutagnesis se induce como parte de la respuesta SOS global que est regulada por un represor
(LexA) y la protena RecA, que escinde LexA despus del dao (Friedberg et al., 1995; Snyder y
Champness, 1997). La induccin de los genes SOS da como resultado un aumento de las actividades
de reparacin, un aumento en las protenas de recombinacin y mayores tasas de mutagnesis.
Despus del dao, las bacterias primero intentan reparar el ADN de una manera libre de errores.
Sin embargo, pueden surgir situaciones en las que no se consigue una reparacin sin errores y se
piensa que bajo estas condiciones, la replicacin propensa a errores acta como un ltimo esfuerzo
de supervivencia. Dos genes SOS llamados umuC y umuD fueron implicados en primer lugar en este
proceso debido a la inactivacin de cualquiera de los genes result en el bloque total de SOS
mutagnesis. Los estudios mostraron que RecA escindi la protena UmuD a una forma
mutagnicamente activa (UmuD ') y que las protenas UmuCD' forman un complejo con RecA y ADN
pol III (Frank et al., 1996). Se cree que este complejo, denominado mutasoma, contina la sntesis
de ADN a travs de los dmeros de ciclobutano o aductos voluminosos (Figura 3). Esta replicacin
de 'bypass' es propensa a errores, permitiendo la insercin incorrecta de bases opuestas a la lesin,
pero se cree que mejora la supervivencia produciendo hilos incipientes nacientes. La replicacin
propensa a errores se denomina as mecanismo de tolerancia a las lesiones, empleado en
condiciones de emergencia (Friedberg et al., 1995, Frank et al., 1996). El mecanismo utilizado por el
mutasoma para inducir el ADN pol III para evitar lesiones sigue siendo objeto de intenso estudio
bioqumico. Una consecuencia a menudo pasada por alto de la mutagnesis SOS es que en
momentos de extrema coaccin habra una rpida acumulacin de mutaciones y una mayor
variacin gentica entre los supervivientes. Aunque la nocin de "evolucin inducible" ha sido
controvertida, merece la consideracin la posibilidad de que la mutagnesis inducible pueda
desempear un papel en la rpida especiacin de las poblaciones confrontadas por presiones
selectivas extremas.

Figura 3 Modelo para la mutagnesis SOS. La replicacin se bloquea cuando el ADN bacteriano III
pol III se encuentra y se detiene en una lesin voluminosa tal como los dmeros de pirimidina de
ciclobutano inducidos por ultravioletas. Se muestra aqu un dmero C-T. Despus de la induccin
de la respuesta SOS, los niveles de las protenas RecA, UmuC y UmuD 'aumentan y se ensamblan
en la lesin. Se cree que este complejo ensamblado ('mutasoma') dirige al ADN pol III a sintetizar
ms all de la lesin, posiblemente insertando una base incorrecta en la hebra naciente.
Resumen

Una de las actividades ms importantes que un organismo emprende durante cada ronda de divisin
celular es la replicacin exacta de su genoma. El ADN sufre dao espontneo y es bombardeado por
la radiacin y los productos qumicos; Por lo tanto, las clulas invierten una proporcin considerable
de sus recursos para reparar los daos y mantener la mutagnesis a un mnimo. El ADN cambia
necesariamente a medida que los organismos evolucionan; Sin embargo, la mutagnesis excesiva
no puede ser tolerada por un organismo. El estudio de la mutagnesis ha llevado a una mejor
comprensin de cmo los mecanismos celulares lograr este equilibrio entre la integridad gentica y
los requisitos para el cambio. Los investigadores tempranos como el fsico suizo Jean Weigle, que
descubri la mutagnesis inducible (Weigle, 1953), nunca podran haber previsto la caja de Pandora
que abrieron. Los avances desde los primeros das han sido espectaculares, contribuyendo a la
comprensin fundamental de los procesos biolgicos, como la reparacin SOS, la replicacin
propensa a errores y una base molecular para la evolucin. Estos estudios seguirn avanzando en
nuestra comprensin de otros procesos complejos, como la carcinognesis y la forma de producir
estimaciones precisas del riesgo mutagnico humano debido a la exposicin a mutgenos presentes
en el medio ambiente.
 Mecanismos de mutagnesis

Muchos tipos de lesiones de ADN causan mutaciones. Aunque las mutaciones pueden ser
perjudiciales para la clula individual, la mutacin en las poblaciones es valiosa porque conduce a la
variacin gentica.

Introduccin

El ADN, el material gentico en todas las clulas, consiste en dos cadenas de azcar fosfato, con
bases nitrogenadas unidas, retorcidas entre s para formar una doble hlice. Los enlaces de
hidrgeno entre las bases mantienen unidas las dos hebras. Las dos bases purnicas, la adenina (A)
y la guanina (G), se unen respectivamente con las dos pirimidinas, la timina (T) y la citosina (C).
Debido a que los hilos son complementarios, la ADN polimerasa es capaz de usar la secuencia de
bases presentes en cada hebra de ADN como molde para formar una nueva molcula de ADN
completa. Este proceso, la replicacin del ADN, tiene lugar cada vez que una clula se divide.
Durante muchos aos, los cientficos dudaron que el ADN era el material gentico porque su
estructura era tan simple. Sin embargo, la clave est en el cdigo gentico: grupos de tres bases
especifican los aminocidos individuales que forman las molculas de protenas. El orden de los
codones en el ADN es el mismo que el orden de los aminocidos en la protena acabada. Otras
combinaciones de bases controlan la replicacin del ADN y los procesos mediante los cuales la
informacin gentica fluye del ADN al ARNm (transcripcin) y del ARNm a la protena (traduccin).
Algunos genes son cientos de kilobases pares (kb) de largo (1 kb 5 1000 pares de bases). Sin
embargo, la alteracin de una sola base (una mutacin puntual) a menudo es suficiente para
codificar la informacin gentica. Las mutaciones puntuales vienen en dos tipos: frameshifts, la
prdida o ganancia de una o dos bases (Figura 1); Y sustituciones de bases, el reemplazo de una base
por otra (Figura 2). Si la base original es una purina (A o G) y su sustitucin es una pirimidina (T o C),
la mutacin de sustitucin de la base se clasifica adems como una mutacin de transversin. Una
mutacin de transicin es aquella en la que una base se sustituye por otra del mismo tipo (es decir,
sustitucin de una purina o pirimidina por la otra purina o pirimidina).

Puesto que varios codones diferentes a menudo especifican el mismo aminocido, las mutaciones
puntuales no cambian necesariamente la secuencia de una protena. Aquellos que sustituyen un
aminocido por otro (una mutacin de sentido errneo) (Figura 2), o introducen un codn de parada
(una mutacin sin sentido) (Figura 1). Por ejemplo, cambiar la G en un codn GAA a un C sustituye
una glutamina no cargada por un glutamato cido, mientras que la sustitucin con un T lo convierte
en un codn de parada TAA. (Los otros dos codones de parada son TAG y TGA). Las mutaciones de
mutacin son slo perjudiciales si el aminocido original es particularmente importante para la
estructura o funcin de la protena. En contraste, las mutaciones sin sentido son casi siempre
dainas porque los codones terminales terminan la traduccin, dando como resultado la produccin
de una protena truncada. Como su nombre indica, las mutaciones de desplazamiento de marcos
alteran el marco de lectura traslacional completo aguas abajo de la mutacin, cambiando todos los
codones subsiguientes e introduciendo con frecuencia codones de parada. Las mutaciones en
protenas importantes pueden ser muy perjudiciales para la salud de un organismo. Por ejemplo, la
fibrosis qustica es causada por cualquiera de varias mutaciones puntuales en el gen CFTR humano
de 230 kb. Sin embargo, la mayora de las mutaciones probablemente tienen muy poco efecto en el
individuo. De hecho, hay muchas versiones de cada gen (alelos) dentro de una especie dada, un
hecho que nos permite usar pruebas de ADN para identificar individuos. Las diferencias entre estos
genes slo pueden ser importantes si el entorno cambia significativamente. A continuacin, los
individuos cuyas caractersticas fsicas (fenotipo) son los ms adecuados para la supervivencia en las
nuevas condiciones son los ms propensos a vivir y reproducirse, pasando sus alelos beneficiosos a
la prxima generacin. En otras palabras, la variacin allica causada por la mutacin es la materia
prima de la evolucin. Las mutaciones que se acumulan en las clulas de un organismo durante su
vida probablemente contribuyen al deterioro fsico que acompaa al envejecimiento. Los seres
humanos que heredan genes defectuosos para algunas de las protenas de reparacin del ADN
desarrollan enfermedades especficas, algunas de las cuales (por ejemplo, el sndrome de Werner,
el sndrome de Cockayne) se caracterizan por los sntomas del envejecimiento prematuro. Este
artculo se refiere a la mutagnesis, el proceso por el cual las mutaciones se introducen en el ADN.
Incluye discusin sobre cmo ocurren las mutaciones y cmo se previenen. Adems, considera los
efectos de las alteraciones en la tasa de mutacin en la supervivencia de las clulas. Gran parte de
la informacin de este artculo proviene de estudios

Bacteria, Escherichia coli, pero muchos de los mismos mecanismos operan en otras especies,
incluidas las nuestras.

Figura 1 errores de replicacin del ADN puede dar lugar a unpairedbases. Sin reparar, estas
lesiones producen mutaciones de cambio de marco (la prdida o ganancia de una o dos bases).
Tales alteraciones en el ADN con frecuencia conducen a la formacin de codones sin sentido, tal
como el codn TAG mostrado aqu. Los codones sin sentido terminan la traduccin, dando como
resultado la produccin de protenas truncadas.

Figura 2 Desaminacin espontnea (la prdida de un grupo NH2) convierte citosinas metiladas en
tirominas. Si el desajuste resultante de T / G no se repara antes de que el ADN se repliegue, el T
normalmente se empareja con un A, dando como resultado una mutacin de transicin de CG a
TA. En el ejemplo mostrado aqu, esto conduce a la sustitucin de una leucina por una prolina en
el producto proteico del gen mutado (una mutacin missense).
Muchas versiones de cada gen (alelos) dentro de una especie dada, un hecho que nos permite usar
pruebas de ADN para identificar individuos. Las diferencias entre estos genes slo pueden ser
importantes si el entorno cambia significativamente. A continuacin, los individuos cuyas
caractersticas fsicas (fenotipo) son los ms adecuados para la supervivencia en las nuevas
condiciones son los ms propensos a vivir y reproducirse, pasando sus alelos beneficiosos a la
prxima generacin. En otras palabras, la variacin allica causada por la mutacin es la materia
prima de la evolucin.

Las mutaciones que se acumulan en las clulas de un organismo durante su vida probablemente
contribuyen al deterioro fsico que acompaa al envejecimiento. Los seres humanos que heredan
genes defectuosos para algunas de las protenas de reparacin del ADN desarrollan enfermedades
especficas, algunas de las cuales (por ejemplo, el sndrome de Werner, el sndrome de Cockayne)
se caracterizan por los sntomas del envejecimiento prematuro. Este artculo se refiere a la
mutagnesis, el proceso por el cual las mutaciones se introducen en el ADN. Incluye discusin sobre
cmo ocurren las mutaciones y cmo se previenen. Adems, considera los efectos de las
alteraciones en la tasa de mutacin en la supervivencia de las clulas. Mucha de la informacin en
este artculo viene de estudios en la bacteria, Escherichia coli, pero muchos de los mismos
mecanismos funcionan en otras especies, el nuestro incluido.

Base de Mispairing y el origen de las mutaciones de sustitucin de la base

Para hacer dos molculas de ADN idnticas, la ADN polimerasa debe sintetizar una nueva hebra
complemetaria en cada una de las hebras de plantilla originales, emparejando A con T y G con C. La
mayora de las polimerasas no son particularmente precisas y se puede copiar hasta una base en
1000 incorrectamente. Cada base tiene el potencial de desajustarse con otros tres,

Incluidos, resultando en ocho posibles mispairs, o desajustes

(A - A, A - C, A - G, C - C, C - T, G - G, G - T y T - T). Si estos desajustes persisten hasta que la nueva

pieza de ADN se reproduce a su vez, una de las dos molculas de segunda generacin contendr
una mutacin. La alteracin qumica de las bases a menudo incrementa las posibilidades de error.
Por ejemplo, la oxidacin de G hace que se empareje igualmente bien con C o A. La insercin de un
G oxidado frente a A durante la replicacin de un par de bases A-T produce un desajuste de A-G. En
una nueva ronda de replicacin del ADN, el G puede emparejarse con un C, dando como resultado
la sustitucin del par A-T original por un par C-G (una transversin AT-a-CG). A veces una
modificacin qumica convierte realmente una base en otra. La desaminacin hidroltica modifica la
5-metilcitosina, un constituyente comn del ADN de muchos organismos, en timina, creando una
desigualdad T-G en lugar del par C-G (Figura 2). Si el desajuste de T-G se replica, el C-G original se
reemplaza por una T-A (una transicin de CG a TA) en una de las molculas hijas. Ocasionalmente
una base de ADN se pierde completamente, creando un sitio abasic. La replicacin de estos sitios
suele ser mutagnica, ya que slo hay una probabilidad de cuatro en que la ADN polimerasa inserte
una base que es complementaria a la base que falta. Se dice que los desajustes descritos en el
prrafo anterior son "espontneos", ya que son causados por procesos celulares normales. Sin
embargo, los desajustes tambin pueden ser 'inducidos' por la exposicin del ADN a una variedad
de productos qumicos (Figura 3). Si una base daada no es eliminada por una protena de
reparacin del ADN, puede causar la mutacin apareando de forma inapropiada durante la
replicacin del ADN. Si se elimina, el sitio absico resultante puede resultar en mutacin. Los
anlogos de la base tambin tienen el potencial de desajustarse con las bases normales. Por
ejemplo, el anlogo de adenina 2-aminopurina mispairs con C. Tanto AT-to-GC y GC-AT transiciones
se producen, dependiendo de si el anlogo mispairs cuando est en la cadena de plantilla o en la
nueva cadena sintetizada. Aunque los errores se producen con frecuencia, muchos son invertidos
inmediatamente por la propia polimerasa del ADN (correccin de pruebas). La mayora de los que
quedan son corregidos por un proceso llamado desajuste de reparacin. Varias protenas cooperan
para identificar la lesin y eliminar la base errnea junto con su esqueleto azcar-fosfato. Se
eliminan hasta varios kb de la secuencia circundante al mismo tiempo. El parche que falta de ADN
es luego resintetizado por la polimerasa, y enlazado al resto del ADN por ADN ligasa. La reparacin
incorrecta corrige la mayora de los tipos de errores de replicacin del ADN, incluidos los que causan
frameshifts (ver ms abajo). Algunos tipos de desajustes tambin son reparados por enzimas
especficas de la lesin. Por ejemplo, la MutY glucosilasa de E. coli excisa como que han desajustado
con G oxidado, mientras que la endonucleasa Vsr elimina Ts de los desajustes de T-G causados por
desaminacin de 5-metilcitosina. Muchos procesos de reparacin del ADN se encuentran en forma
muy similar en organismos como no relacionados como seres humanos y bacterias.

Figura 3 Si se eliminan las bases daadas en el ADN, se produce un sitio absico. Cuando la
polimerasa de ADN, la enzima que copia el ADN, encuentra un sitio tal, normalmente inserta un
A en la nueva cadena de ADN. A menos que la base daada original fuera un T, esto resulta en
una mutacin como la transicin CG-a-TA mostrada aqu. Afortunadamente, en este ejemplo
tanto el codn CAC original como el nuevo cdigo de codn CAT para una histidina, de manera
que el producto proteico de este gen mutado no se altera.

El deslizamiento de la polimerasa de ADN y el origen de las mutaciones de cambio de marco

ADN polimerasa errores son tambin la principal causa de frameshift mutaciones. Cuando las bases
en una plantilla de ADN se deslizan fuera de alineacin durante la replicacin del ADN, pueden ser
perdidas por la polimerasa, con el resultado de que la nueva hebra de ADN es ms corta que la hebra
molde. Sin embargo, si la polimerasa se desliza hacia atrs sobre la plantilla, puede copiar la misma
base dos veces, produciendo una nueva hebra que sea ms larga que la hebra de plantilla. En ambos
casos, el resultado es una mutacin frameshift. El deslizamiento de hilos se produce con mayor
frecuencia durante la replicacin de secuencias repetitivas (por ejemplo, An o (CG) n), haciendo que
estas secuencias sean las ms propensas a producir mutaciones de cambio de marco. Sin embargo,
las mutaciones pueden ocurrir en otros sitios como un efecto secundario del dao de la base o
emparejamientos de pares de bases. Una base daada puede obligar a la polimerasa a evitar la
lesin y continuar la sntesis desde la siguiente base a lo largo, mientras que una base que no
coincide puede disociarse de su primera pareja, emparejndose en su lugar con una base correcta
ms abajo de la plantilla. En ambos casos, las bases intermedias no se copian y se crea un frameshift.
En algunos casos, sin embargo, los filamentos deslizados realinear despus de la incorporacin de
una sola base, dando lugar a una mutacin de sustitucin de base en lugar de un frameshift. Este
proceso se conoce como mutagnesis de dislocacin. Muchos errores de deslizamiento de cadena
se corrigen antes de que las mutaciones se conviertan en permanentes (fijas). La reparacin es
llevada a cabo por el mismo conjunto de protenas que corrige los desajustes de pares de bases. Un
nmero muy elevado de desajustes de pares de bases en el ADN (causado, por ejemplo, por
tratamiento de una clula con un mutgeno o por un defecto en la funcin de correccin de la
polimerasa) sobrepasa la capacidad del sistema de reparacin de desajustes. En ese caso, muchos
de los errores de deslizamiento de hebras hechos naturalmente por la polimerasa permanecen sin
reparar, y el nmero de mutaciones de cambio de marco aumenta dramticamente en todas partes
en el ADN de la clula (su genoma).

Mutaciones complejas

Ocasionalmente un corto tramo de ADN contiene mltiples sustituciones de bases y / o mutaciones

de frameshift. Estas mutaciones complejas ocurren probablemente cuando una secuencia de ADN
se junta con una secuencia complementaria en su propia hebra, formando una estructura en
horquilla. Puesto que es poco probable que las dos secuencias sean una coincidencia perfecta, la
horquilla contiene bases que estn mal emparejadas o no apareadas. La correccin de la lesin
anterior por el sistema de reparacin de la falta de concordancia da lugar a mutaciones de
sustitucin de bases, mientras que la reparacin de sta por la misma va produce mutaciones de
desplazamiento de marco (Figura 4).

Figura 4 El emparejamiento de secuencias en la misma hebra de una pieza de ADN da lugar a

estructuras de horquilla del tipo mostrado aqu. Las secuencias emparejadas no son generalmente
idnticas al 100%, por lo que algunas bases estarn desemparejadas o desajustadas. Esta figura
muestra que la eliminacin de bases no emparejadas conduce a mutaciones de desplazamiento
de marco, mientras que la eliminacin de una base mal emparejada conduce a una mutacin de
sustitucin de base.

Aspectos aleatorios y no aleatorios de la mutagnesis

Las mutaciones son eventos raros. Incluso los ms fuertes mutgenos introducir slo unas pocas
mutaciones en el genoma de una clula. Adems, las mutaciones son aleatorias; Cualquier base en
un genoma puede mutar, espontneamente o en respuesta a un mutagn particular. Detectar y
analizar la aparicin de mutaciones en todo el genoma sera prcticamente imposible. Por esta
razn, los ensayos de mutagnesis miden la ocurrencia de mutaciones en un nico gen
representativo. El gen elegido tiene que ser uno asociado a una caracterstica fsica fcilmente
medible, de modo que una mutacin en el gen cambie el fenotipo de la clula y hace que sea fcil
de identificar. Un ejemplo es el ensayo lacI de E. coli. Muchas mutaciones en el gen lacI inhiben la
protena represora Lac que codifica, permitiendo a la clula hacer la enzima b-galactosidasa
continuamente. Tales clulas forman colonias azules en medios indicadores especficos. Mediante
la secuenciacin del gen indicador de muchas clulas mutantes independientemente aisladas para
identificar las mutaciones causales, los cientficos producen un espectro mutagnico para
mutgenos individuales o para defectos especficos en la reparacin del ADN. Se han desarrollado
ensayos similares para levaduras y clulas humanas. Una de las revelaciones proporcionadas por los
espectros mutagnicos es que algunas bases se mutan ms fcilmente que otras. Un ejemplo clsico
es la identificacin de tres Cs en el gen lacI que espontneamente mutar a T a una alta frecuencia.
Estos "hotspots" mutacionales corresponden a sitios de metilacin de citosina. La mutacin se debe
a la desaminacin de 5-metilcitosina a timina. Cs metilado son tambin hotspots mutacin en las
clulas humanas. En muchos casos, sin embargo, las razones de los hotspots y coldspots no son tan
fcilmente evidentes. La secuencia de ADN que rodea a una base afecta su capacidad de mutacin,
pero con algunas excepciones notables (por ejemplo, frameshifts en secuencias repetitivas) las
reglas que gobiernan esto todava estn lejos de ser claras.

Mecanismos especiales de mutagnesis

En algunos casos, una alta tasa de mutacin en genes especficos puede ser realmente una ventaja
para la clula. El mejor ejemplo es el factor de virulencia genes en la bacteria Haemophilus
influenzae, una de las principales causas de la neumona humana. Las protenas del factor de
virulencia se encuentran en la superficie de las clulas bacterianas, por lo que son los principales
objetivos de nuestra respuesta inmune. Las mutaciones en los genes del factor de virulencia
cambian la forma de las protenas, disminuyendo la capacidad de los anticuerpos del husped para
reconocerlas y, de este modo, ayudando a las bacterias a sobrevivir. Los genes del factor de
virulencia mutan a una velocidad elevada porque contienen las secuencias repetitivas que son
particularmente propensas a errores de deslizamiento de la hebra. Los genes hipermutables, como
los genes del factor de virulencia, se conocen como "loci de contingencia", ya que ayudan a asegurar
que al menos algunas bacterias de una poblacin puedan sobrevivir al proceso de infeccin. Los
animales, a su vez, usan genes hipermutables para hacer el gran nmero de molculas de
anticuerpos diferentes que necesitan para luchar contra los patgenos bacterianos y virales
constantemente cambiantes. La mayora de las diferencias entre molculas de anticuerpos se
encuentran en una porcin particular de la molcula llamada regin variable (V). El ADN que codifica
la regin V muta a una velocidad que es al menos un milln de veces mayor que la que se produce
en otros genes en el genoma de mamfero. Este proceso se llama hipermutacin somtica. Otros
fragmentos de ADN insertados, experimentalmente, en lugar de la regin V son tambin
hipermutable, lo que sugiere que, a diferencia de los loci de contingencia, es la ubicacin del ADN
lo que es importante, no su secuencia.

La transcripcin es necesaria, pero no suficiente, para la mutagnesis, y hay evidencia de que

algunas de las protenas de reparacin de desajuste pueden jugar un papel. A pesar de estos
hallazgos muy importantes, el mecanismo preciso de la hipermutacin somtica es todava
desconocido.

Las dos secciones siguientes describen dos situaciones que conducen a un aumento temporal en la
tasa de mutacin en E. coli. Al igual que los loci de contingencia y los genes de anticuerpos, esta
hipermutacin puede ser una estrategia para aumentar las posibilidades de supervivencia. Sin
embargo, hay una diferencia importante: el aumento de la mutacin no se limita a genes especficos,
sino que se extiende por todo el genoma.

Translasion DNA Synthesis

La exposicin de las clulas a la luz ultravioleta (UV), oa una variedad de agentes qumicos, causa
dao severo al ADN. Este dao es potencialmente letal porque bloquea la replicacin del ADN.
Cuando E. coli se trata con luz UV, responde produciendo una coleccin especial de protenas que
le permiten sobrevivir al dao. Esto se conoce como respuesta SOS. Algunas de las protenas ayudan
a reparar el ADN, mientras que otras permiten que la sntesis de ADN contine incluso en presencia
de dao del ADN. El bypass de dao permite que las clulas sobrevivan, pero tambin causa
mutacin. La mutagnesis SOS requiere dos polimerasas de ADN especiales, polimerasa IV y
polimerasa V, las cuales se producen solamente durante la respuesta SOS. Estas polimerasas son
necesarias porque la polimerasa III, la enzima que lleva a cabo la mayor parte de la replicacin del
ADN en E. coli, est bloqueada por bases daadas en la plantilla de ADN. Si la polimerasa III se
detiene antes de la lesin, la polimerasa V permite que la sntesis de ADN contine insertando una
base opuesta a la lesin. Sin embargo, esto generalmente causa una mutacin de sustitucin de
base porque no hay garanta de que la base insertada sea la correcta. A veces, la polimerasa III
aparentemente evita la lesin antes de que cesa. En este caso, la polimerasa IV extiende la nueva
hebra por una sola base, permitiendo la continuacin de la sntesis de ADN pero produciendo una
mutacin de cambio de marco. La polimerasa IV tambin puede ser responsable de las denominadas
mutaciones no segmentadas que se producen en ausencia de dao al ADN. En este caso, la
polimerasa puede aadir una base inadecuada frente a una base normal, creando una mutacin de
sustitucin de base. El aumento de la mutacin causada por la respuesta SOS puede ser
simplemente el precio que la clula paga para sobrevivir a las lesiones que bloquean la sntesis de
ADN. Alternativamente, las mutaciones que la polimerasa IV y V causan pueden ser realmente
beneficiosas porque aumentan la variabilidad gentica en la poblacin bacteriana. Esto mejora las
probabilidades de que habr individuos dentro de la poblacin bacteriana que pueden sobrevivir y
reproducirse bajo las nuevas condiciones ambientales.

Mutacin adaptativa

Cuando grandes poblaciones de bacterias se encuentran con ambientes hostiles, casi siempre hay
individuos que sobreviven y se multiplican. Durante la primera mitad del siglo XX hubo mucha
controversia sobre el origen de estas variantes. Muchos crean que las variantes eran clulas que se
haban adaptado a las nuevas condiciones. Otros crean que las variantes eran mutantes que haban
estado presentes en la poblacin todo el tiempo, y que las nuevas condiciones simplemente
favorecieron su crecimiento. La famosa "prueba de fluctuacin" de Luria y Delbrck de 1943
confirm la hiptesis de la mutacin mostrando que las clulas bacteriophageresistant estn
presentes en una poblacin de E. coli antes de la exposicin al fago. Los fagos no hacen que las
clulas se vuelvan resistentes a ellas, sino que, en su lugar, permiten el crecimiento de (seleccionar)
los mutantes resistentes al fago preexistentes eliminando las clulas sensibles a los fagos. Es
evidente que las bacterias, como los organismos ms complejos, siguen la ley darwiniana de la
supervivencia del ms apto. La hiptesis de adaptacin recibi un nuevo contrato de vida en 1988
cuando la prueba de fluctuacin se repiti mediante un proceso de seleccin que no mata las
clulas. Algunas cepas de E. coli son incapaces de metabolizar la lactosa debido a

Mutaciones en los genes del opern lac. Se dice que son Lac 2. Si se extienden grandes cantidades
de clulas Lac 2 en placas que no contienen azcar excepto lactosa, aparece un pequeo nmero
de colonias que se originan a partir de mutantes lac 1 que estaban presentes en la poblacin Lac 2
original. Sorprendentemente, la prueba de fluctuacin indic que se producen clulas Lac 1
adicionales despus de la exposicin a la lactosa. De hecho, los mutantes continan apareciendo en
medio de lactosa durante muchos das despus de la galjanoplastia. Dado que inicialmente no haba
pruebas de que existan mutaciones en otros genes, pareca que las bacterias hambrientas se
estaban adaptando creando deliberadamente mutaciones en los genes lac. Se sabe ahora que las
mutaciones estn, de hecho, ocurriendo en todo el genoma, no slo en el opern lac. Sin embargo,
el trmino "mutacin adaptativa" sigue siendo utilizado para distinguir las mutaciones que ocurren
en presencia de la seleccin de las que ocurrieron de antemano. Aunque el mecanismo de la
mutacin adaptativa todava no est completamente claro, la inanicin parece causar al menos
algunas de las clulas en una poblacin para entrar en un estado hipermutable. La tasa de mutacin
vuelve a la normalidad cuando una mutacin se produce en laca que permite a las clulas a consumir
la lactosa y sobrevivir. Dado que los errores de la polimerasa del ADN son la principal fuente de
mutaciones espontneas, uno de los mayores enigmas acerca de la mutacin adaptativa es la forma
en que se producen grandes cantidades de mutaciones en las clulas no divisorias. Una posibilidad
es que cualquier sntesis de ADN que se produzca, por ejemplo durante la recombinacin entre
molculas de ADN, tenga lugar en ausencia de reparacin normal del ADN.

Mutadores y Antimutadores

En la mutagnesis SOS y mutacin adaptativa, la hipermutabilidad es transitoria; Las tasas de

mutacin vuelven a la normalidad cuando se elimina el estrs. Sin embargo, algunas cepas
bacterianas, llamadas mutantes, tienen una tasa de mutacin continuamente alta debido a la
reduccin de la reparacin del ADN. Dado que hay muchos genes de reparacin de ADN en E. coli,
hay docenas de mutantes de E. coli, cada uno con un espectro mutagnico diferente. Por ejemplo,
las cepas con alteraciones en los genes mutT, mutY o mutM son incapaces de prevenir las
mutaciones causadas por G. mutY y las cepas mutM oxidadas han aumentado las mutaciones de GC
a TA, mientras que las cepas mutT se caracterizan por la transversin inversa, TA-to -GC. La prdida
de la funcin del gen vsr causa aumento de las mutaciones CG-to-TA porque la clula es incapaz de
reparar T-G desajustes causados por la desaminacin de 5-metilcitosina. Sin embargo, con mucho
los mutantes ms comunes de E. coli son aquellos con una menor reparacin de la falta de
coincidencia. En estas cepas se incrementan todos los tipos de mutaciones de transicin y de cambio
de marco. La mayora de ellos tienen defectos en uno de tres genes, mutS, mutL o mutH. De
particular inters mdico es el hecho de que las clulas humanas tienen mltiples equivalentes
funcionales (homlogos) tanto de mutLandmutS, y que ellos tambin se convierten en mutadores
cuando estos genes son defectuosos. La alta tasa de mutacin est asociada con la ocurrencia de
tipos especficos de cncer. Las tasas ms altas de mutacin en E. coli se encuentran en clulas con
un defecto en la ADN polimerasa III. Todos los tipos de mutacin estn dramticamente elevados
en estas clulas. Curiosamente, algunas mutaciones en el gen de la polimerasa III tienen el efecto
inverso, convirtiendo las clulas en antimutadores. La disminucin de la mutacin en algunos
antimutadores se debe a una copia de base ms precisa por la polimerasa, mientras que en otros se
debe a una correccin mejorada. Los antimutadores probablemente no tienen mucho xito fuera
del laboratorio, ya que tardan ms en replicar su ADN que una clula normal. En contraste, como se
describe en la siguiente seccin, mutadores pueden tener ms xito que las clulas con tasas de
mutacin normales en algunas circunstancias.

Tasas de mutacin espontnea y su impacto

La mayora de los organismos tienen tasas de mutacin notablemente similares. Slo los virus ARN,
como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tienen tasas espectacularmente ms altas. Sin
embargo, los organismos difieren en su capacidad de tolerar una mayor tasa de mutacin. En
general, los organismos multicelulares son intolerantes; Como se mencion anteriormente, el
aumento de las tasas de mutacin en las clulas humanas aumenta el riesgo de cncer. Los
organismos unicelulares toleran tasas ms altas, ya que la muerte de una sola clula no pone en
peligro el destino de toda la poblacin. De hecho, la presencia de mutadores mejora las
posibilidades de supervivencia de una poblacin.

Las clulas mutator son comunes entre las cepas de E que causan la enfermedad. Coli y Salmonella.
Tambin superan con facilidad las clulas normales en el laboratorio cuando las condiciones son
estresantes durante largos perodos de tiempo. El xito de las cepas mutator es casi seguro debido
a su capacidad para producir muchos individuos con fenotipos ligeramente diferentes. Por lo tanto,
casi siempre habr algunas clulas que estn bien adaptadas a las nuevas condiciones ambientales.
Sin embargo, los aumentos transitorios en la mutacin pueden ser an ms beneficiosos, ya que la
tasa de mutacin disminuye cuando se elimina el estrs, reduciendo las posibilidades de mutacin
adicional. Puede haber otros mecanismos para producir mutantes transitorios, adems de la
mutagnesis SOS y la mutacin adaptativa, que an estn a la espera de ser descubiertos.
Escherichia coli Operon Lactosa

El estudio del opern de lactosa de Escherichia coli sent las bases de la biologa molecular moderna.
Contribuy a la elaboracin del concepto de regulacin gentica, propuesto por Jacob y Monod hace
casi 50 aos, un modelo que sobrevive esencialmente sin cambios. Se ha elaborado la estructura
del opern, que consta de genes estructurales y reguladores y se ha aclarado su respuesta
reguladora a molculas pequeas, tales como inductor, glucosa y AMP cclico. La regulacin gnica
del opern de la lactosa condujo al descubrimiento del cido ribonucleico mensajero (mRNA), a la
identificacin del represor de Lac y al desarrollo de la teora de la alostera. Los genes de lactosa y
sus derivados proporcionan herramientas para una amplia gama de aplicaciones actuales en muchos
campos de la biologa; Son los genes reportero ms comnmente utilizados en el anlisis de sistemas
regulados por el desarrollo, en el estudio de las frecuencias de mutacin y en la genmica funcional.

Desarrollo histrico del paradigma lac La exploracin del sistema de lactosa (lac) se inici a finales
de los aos cuarenta en el Instituto Pasteur de Pars por Jacques Monod y sus colaboradores. Desde
el comienzo del siglo XX se saba que ciertas enzimas microbianas se formaban slo en presencia de
su sustrato especfico. Este fenmeno, llamado "adaptacin enzimtica", fue ms tarde redefinido
y denominado "induccin enzimtica". Cabe destacar que en el momento en que no se conoca la
estructura del cido desoxirribonucleico (ADN), se conoca poco sobre la estructura de las protenas
y no se conoca nada de su biosntesis. El hallazgo de un mutante fermentador de lactosa (Lac +) de
una cepa de Escherichia coli Lac2 permiti a Monod concluir que la capacidad del lactante Lac + de
utilizar lactosa se debi a la formacin de una enzima adaptativa, la b-galactosidasa (llamada lactasa
en ese momento). Estos resultados plantearon la cuestin fundamental de la relacin entre el gen,
la enzima y el sustrato inductivo. La propia naturaleza de la induccin enzimtica se haba dilucidado
a principios de los aos cincuenta cuando se demostr que el efecto inductor del sustrato (lactosa)
implicaba la biosntesis total de la b-galactosidasa a partir de aminocidos. Vase tambin: Monod,
Jacques Lucien; Escherichia coli como Organismo Experimental La mayora de los conceptos
principales de expresin gnica y regulacin se establecieron usando el sistema de lactosa de E. coli.
B La galactosidasa, que divide la lactosa en glucosa y galactosa, podra determinarse fcilmente
cuantitativamente gracias a un sustrato cromognico o-nitrofenil-b-D-galactsido (ONPG). Adems,
el desarrollo de anlogos galactsidos, principalmente tiogalactsidos, que sirvieron para disociar
la actividad enzimtica de induccin enzimtica (inductores gratuitos) permiti un anlisis directo
del sistema. El descubrimiento de la conjugacin bacteriana en 1946 por Lederberg, y el
refinamiento de esta tcnica en 1956 por Wollman, Jacob y Hayes, permiti un anlisis gentico
temprano de los genes que determinaban el metabolismo de la lactosa. Vase tambin: Escherichia
coli y el desarrollo de la gentica bacteriana; Lederberg, Joshua A finales de la dcada de 1950 se
haba obtenido una serie de mutaciones lac2: la mayora de estas mutaciones se correlacionaron
con un solo locus del cromosoma E. coli, definiendo la regin ahora conocida como locus lac, que
contiene tres genes estructurales, lacZ, LacY y lacA, que codifican la b-galactosidasa, la lactosa
permeasa y la tiogalactosida transacetilasa (vase ms adelante). El descubrimiento de una nueva
clase de elementos genticos, los genes reguladores, la demostracin de que la expresin de los
genes lacZ y lacY est regulada negativamente por un represor y, finalmente, la hiptesis de un
intermediario obligatorio, el mensajero ribonucleico (ARNm) En la transferencia de informacin
estructural de genes a protenas, culmin en el concepto de opern. El trabajo sobre el sistema lac
se convirti en la base del nuevo campo de la biologa molecular.
A finales de los aos sesenta, se haban resuelto los principales problemas planteados por la
expresin de genes lac en E. coli. Estas nuevas ideas se aplicaron posteriormente a un gran nmero
de sistemas diferentes. Nuestra actual comprensin molecular de la expresin gnica y la regulacin
se puede rastrear sin ambigedad de nuevo al sistema de lactosa. Ver tambin: Historia de la
Biologa Molecular.

Los genes estructurales de lac

Los tres genes estructurales del locus lac, lacZ, lacY y lacA, codifican para b-galactosidasa, lactosa
permeasa y tiogalactosida transacetilasa, respectivamente, como se muestra en la Figura 1.

B-galactosidasa

Desde los primeros estudios de induccin enzimtica, la E. coli b-galactosidasa se ha asociado con
una amplia gama de aplicaciones en diversos campos de la biologa molecular. Es una
transglucosidasa hidroltica, especfica para la configuracin galactopiranosida b-D, y puede actuar
como una hidrolasa as como una transferasa. La b-galactosidasa es un tetrmero, la nica forma
activa de la enzima. Se compone de cuatro subunidades idnticas, cada una de las cuales tiene un
peso molecular de aproximadamente 120 000. Debido a su alto nmero de rotacin
(aproximadamente 6000 mol ONPG hidrolizado s21 mol21 enzima), una molcula de b galactosidasa
por clula bacteriana se puede determinar con precisin.

La secuencia de aminocidos de la b-galactosidasa se determin antes de que se hubieran

desarrollado las tcnicas de secuencia de ADN; Fue la mayor secuencia de protenas jams
dilucidada. De acuerdo con esta secuencia, la protena contiene 1021 residuos de aminocidos que
corresponden a un peso molecular de subunidad de 116 248. Cuando, posteriormente, tambin se
determin la secuencia de nucletidos del gen lacZ en 1983, la secuencia de aminocidos deducida
de la secuencia de ADN difera solamente En 10 residuos de aminocidos, y se predijo que la
subunidad de la galactosidasa b consistira en 1023 residuos. Se ha revelado una caracterstica
interesante del gen lacZ, denominada complementacin a y o, cuando se han aislado mutantes de
delecin, que implican segmentos bastante grandes del gen, mutantes de delecin inactivos, que
carecen de la La N- o la regin C-terminal de la b-galactosidasa (a- y o-pptidos, respectivamente)
complementara otro mutante de delecin inactivo que contiene la regin que falta en la primera.
Esta complementacin representa la reasociacin no covalente de fragmentos complementarios,
que luego se reensamblan en una estructura tetramrica enzimticamente activa.

Estructura tridimensional de la b-galactosidasa

La b-galactosidasa se haba obtenido en forma cristalina a principios de los aos cincuenta, pero la
resolucin de su estructura de rayos X tuvo que esperar 40 aos. La estructura cristalina a una
resolucin de 2,5-A representa la cadena polipeptdica ms larga para la que se ha determinado
una estructura atmica. La estructura cristalina muestra que la b-galactosidasa es un tetrmero con
unas dimensiones de aproximadamente 175 x 135 x 90 A a lo largo de los respectivos ejes de 2
plegados. El monmero consiste en cinco dominios compactos y un segmento N-terminal de 50
restos relativamente extendido, que corresponde al a-pptido (Figura 2). La imagen de rayos X de
la b-galactosidasa proporciona un fundamento estructural tanto para la complementacin a como
para la complementacin o. El segmento N-terminal, que representa el pptido-a, participa en la
formacin de una interfaz de subunidad, que a su vez permite la formacin del sitio activo,
constituido por elementos de dos subunidades diferentes. El tercio C-terminal de la cadena
polipeptdica muestra un dominio compacto bien definido, correspondiente al o-pptido, y
representa una unidad plegable independiente, como se haba sugerido anteriormente a partir de
estudios de complementacin. Ver tambin: Determinacin de la Estructura Macromolecular por
Cristalografa de Rayos X; Protenas: Propiedades Qumicas Fundamentales

Lactosa permeasa

Entre los mutantes aislados por Monod a finales de 1940, los llamados mutantes crpticos fueron
capaces de sintetizar bgalactosidasa pero incapaz de metabolizar la lactosa. Cuando, a mediados de
los aos cincuenta, se pusieron a disposicin inductores gratuitos, se resolvi el misterio de los
mutantes crpticos. Utilizando un inductor gratuito radioactivo, el metil-bD-tiogalactsido (TMG),
Monod y colaboradores mostraron, en 1956, que las clulas lac + de tipo salvaje acumulan TMG
marcado aproximadamente 100 veces frente a un gradiente de concentracin, la cantidad
acumulada que representa aproximadamente 2% peso. Tambin mostraron que la acumulacin de
TMG era dependiente de energa y reversible. El TMG marcado se acumul en las bacterias
inducidas, pero no en las no-inducidas, de tipo salvaje. Adems, no se observ acumulacin en los
mutantes crpticos. La conclusin fue clara: el factor responsable de la acumulacin de TMG slo
podra ser una protena especfica, controlada por un gen, lacY, a diferencia de lacZ. La sntesis de
esta protena, denominada "permeasa", fue inducida por b-galactosidos simultneamente con la de
la b-galactosidasa; Por lo tanto el descubrimiento de la permeasa jug un papel importante en el
desarrollo del modelo del opern (vase ms adelante). El aislamiento del producto del gen lacY se
consigui 10 aos despus del descubrimiento de la permeasa. Es una protena altamente lipfila
con un peso molecular de subunidad aparente de aproximadamente 30.000. El mecanismo de
transporte ha sido aclarado: La permeasa de lecho transporta varios a- o bgalactsidos en las clulas
de E. coli contra un gradiente de concentracin por co-transporte de un protn junto con uno
Galactosida. El ADN del gen lacY se secuenci en 1980 y, segn esta secuencia, Lac permeasa
contiene 417 residuos de aminocidos. El anlisis topolgico sugiere que Lac permease consiste en
12 hlices a lipoflicas, y ambos terminales N y C se encuentran en el interior de la clula de E. coli.
Parece que Lac permease es activo como un monmero. Ver tambin: Membrana citoplasmtica
bacteriana; Transporte de Membranas Bacterianas: Organizacin de Actividades en Membranas.

Thiogalactosida transacetylase

El tercer gen del locus lac, lacA, codifica una enzima, capaz de acetilar algunos tiogalactsidos y
denominada tiogalactosida transacetylase. El gen lacA se ha secuenciado: incluye 203 codones. Los
estudios bioqumicos mostraron que la enzima es un heterotrmero y es un miembro de una gran
familia de acetiltransferasas que O-acetilan sustratos disimilares, pero comparten una homologa
de secuencia limitada. La funcin in vivo de la tiogalactosida transacetilasa an no est clara.
Figura 2 Estructura tridimensional de la b-galactosidasa. (A) Representacin en cinta del
tetrmero de b-galactosidasa que muestra la cara ms grande de la molcula. Los contactos entre
los dmeros rojo / verde y azul / amarillo forman la interfaz larga. Los contactos entre los dmeros
rojo / amarillo y azul / verde forman la interfaz de activacin. La formacin de la partcula
tetramrica da como resultado dos hendiduras profundas que corren a travs de las caras
opuestas de la molcula. Cada uno contiene dos sitios activos. (B) Diagrama de cinta del dmero
azul / verde visto abajo del eje molecular de 2 veces, que muestra la composicin de la interfaz
de activacin. Los residuos 1-50 de cada cadena, que forman la regin de complementacin a
(vase el texto), se muestran en rojo. La interfase incluye contactos entre los respectivos pptidos
de complementacin, entre dos hlices de los monmeros respectivos que se unen para formar
un haz de cuatro hlices y entre un bucle extendido (residuos 272-288) de cada monmero que
alcanza a travs de la interfaz y se extiende en La regin del sitio activo del monmero vecino que
estabiliza la estructura del sitio activo. (C) Diagrama de cinta estreo del monmero de b-
galactosidasa que muestra la organizacin del dominio de la cadena. Los residuos
correspondientes a dominios sucesivos se colorean en sucesivos colores espectrales. Reimpreso
de Jacobson RH, Zhang XJ, DuBose RF y Matthews BW (1994) Estructura tridimensional de la b-
galactosidasa de E. coli. Nature 369; 761-766, con permiso.

El represor

A finales de la dcada de 1950, el conocimiento de los pasos involucrados en la conjugacin

bacteriana (transferencia de una parte del cromosoma de una bacteria a otra) permiti un nuevo
enfoque para el estudio de la regulacin de la expresin gnica. Ya se saba que en E. coli, la sntesis
de b-galactosidasa depende del gen lacZ (z) y de un factor gentico adicional, que se sabe que existe
en dos formas, el tipo salvaje, llamado i +, que corresponde a El fenotipo inducible (es decir, la
sntesis enzimtica slo se produce si se aade inductor a la bacteria) y la forma i constitutiva (es
decir, la enzima se sintetiza en ausencia de inductor). El anlisis gentico previo revel que los genes
z e i estn estrechamente vinculados en el cromosoma. Todo esto sirvi de base para el experimento
Pardee, Jacob y Monod (1959), conocido como experimento PaJaMo, que llev a tres conceptos
principales de la expresin gnica: los conceptos de represor, control negativo de la induccin
enzimtica y mRNA. En el experimento PaJaMo, se midi la sntesis de b-galactosidasa durante la
conjugacin de bacterias macho (Hfr) con hembras (F2). Cuando se cruz una cepa LacZ + Hfr del
genotipo i + z + con una F2 del genotipo i2 z2, se sintetiz inmediatamente la b galactosidasa, pero
en pocos minutos se detuvo la sntesis enzimtica. Si en este momento se a~nadi inductor, se
reanud la sntesis enzimtica (Figura 3). La interpretacin del experimento fue sencilla: despus de
la transferencia cromosmica, el gen z + se puede expresar en un citoplasma i2, pero la transferencia
concomitante del gen i + resulta en la detencin de la sntesis enzimtica. En un experimento
paralelo, cuando la direccin de la cruz se invirti, es decir, una cepa de Hfr i2 z2 se cruz con un F2
i + z +, no se produjo sntesis enzimtica. As, el gen i + en el receptor era dominante sobre el gen i2
del donante. Esto condujo a la hiptesis de que el gen i + produce una sustancia que interrumpe la
sntesis enzimtica. Fue nombrado represor. Vase tambin: Cromosoma bacteriano; Intercambio
gentico bacteriano; Jacob, Francois; Monod, Jacques Lucien Durante la conjugacin el gen lacZ del
Hfr se expres inmediatamente en el diploide. En ese momento, se crea generalmente que los
genes producen estructuras estables, que se acumulan en el citoplasma y, como el RNA ribosmico
(ARNr) era el nico ARN conocido, se supuso que actuaba como un molde para la sntesis de
protenas. En el experimento PaJaMo una plantilla estable no podra explicar la rpida cintica de la
sntesis enzimtica. Por lo tanto, se propuso una nueva hiptesis: el gen estructural produce un ARN
metablicamente inestable, denominado mRNA, que a su vez se decodifica en los ribosomas para
producir la protena correspondiente. El modelo de regulacin de genes naci: se estableci que en
las bacterias, la transcripcin, es decir, la produccin de mRNA, se regula de manera negativa por
los represores. En el sistema lac, se necesita un inductor para contrarrestar la accin del represor.
Ver tambin: ARN mensajero en Prokaryotes Dos preguntas importantes todava esperaban una
respuesta: cul es la naturaleza del represor y dnde est su sitio de accin? Los experimentos
PaJaMo sugirieron que E. coli no contiene ms de 10 molculas de represor Lac por clula y su
aislamiento fue por lo tanto un gran desafo; El xito proporcion pruebas de que el represor es una
protena. El aislamiento de mutantes que sobreproducen el represor de Lac varios 100 veces abri
el camino para estudios bioqumicos adicionales. Tanto el aminocido como las secuencias de ADN
del represor de Lac se determinaron en los aos setenta. El represor de Lac es un tetrmero, que
contiene 360 residuos de aminocidos por monmero, y cada monmero se une a una molcula de
inductor. Mecanismo de represin Un amplio anlisis gentico del gen lacI, dio como resultado ms
de 4000 sustituciones de aminocidos individuales de fenotipo conocido entre los codones 2 y 329
del gen lacI. La determinacin de la estructura tridimensional del represor Lac (Figura 4), tanto en
presencia como en ausencia de inductor, confirm plenamente estudios bioqumicos anteriores.
Tambin permiti combinar datos estructurales y genticos, para mapear todas las mutaciones de
sustitucin de aminocidos en la estructura tridimensional del represor y proporcionar una imagen
clara de la funcin represora.

Figura 3 El experimento 'PaJaMo'. Una cepa macho (Hfr) lac i + z + se conjug con una cepa hembra
(F-) lac i-z- en ausencia de inductor. En el momento indicado, el inductor se aadi a uno de los
cultivos, mientras que el otro no recibi adicin. Se midi la actividad de b-galactosidasa en
funcin del tiempo. Adaptado de Pardee AB, Jacob F y Monod J (1959) El control gentico y la
expresin citoplsmica de la "inducibilidad" en la sntesis de b-galactosidasa por E. coli. Journal
of Molecular Biology 1; 165-178, con permiso.
Figura 4 La estructura cristalina del complejo represor-ADN de Lac construido a partir de las
estructuras de banco de datos de protenas disponibles (Lewis et al., 1996) mediante
procedimientos de modelado (Balaeff et al., 2004). En el represor de Tetrameric Lac en forma de
V, cada uno de los dos dmeros (dibujados como dibujos de protenas prpuras) se une con alta
especificidad a un fragmento de ADN de 21 pares de bases de operador (dibujado como tubos
azules y esferas rojas) a travs de la cabeza N 62 terminal residuelong (Dibujado en verde). El
montaje dmero-dmero se produce a travs de un paquete compacto de cuatro hlices formado
por 18 residuos C-terminales de cada subunidad (dibujado como tubos naranja). Adaptado de
Balaeff A, Mahadevan L y Schulten K (2004) Base estructural para la unin de ADN cooperativo
por CAP y represor de Lac. Estructura 12; 123-132, con permiso de Elsevier.

El operador

A finales de los aos cincuenta se estableci que la sntesis de las protenas lac (b-galactosidasa,
permeasa y acetilasa) se produjo a las mismas velocidades despus de la adicin del inductor, y en
los mutantes i2 tambin se coordin la sntesis constitutiva. Estas observaciones llevaron a Jacob y
Monod, en 1961, a desarrollar el concepto de dos tipos de genes: "estructural", que codifican la
sntesis de protenas; Y "regulador", que se postularon para controlar la expresin de protenas a
travs de intermediarios de represores. Tambin postularon que haba una estructura gentica
nica asociada con el grupo de genes estructurales, el sitio de interaccin con el represor, que ellos
llamaron "operador". Las mutaciones en el sitio del operador conduciran a una prdida de
sensibilidad al represor, produciendo as mutantes constitutivos. En una cepa diploide (que contena
dos copias del locus lac), los mutantes constitutivos del operador (o) eran cis-dominantes, es decir,
actuando solamente sobre los genes de la zona adyacente. Un nuevo concepto naci, el "opern",
definido como una unidad de transcripcin coordinada, compuesta de genes estructurales
conectados por un operador, el objetivo de la accin de un represor, producido por un gen
regulador. Varios aos ms tarde se hizo necesario postular un elemento gentico adicional, una
regin especfica del ADN, distinta del operador, en donde se inicia la transcripcin del mRNA. Esta
regin ha sido nombrada 'promotor'. La Figura 5 ilustra el opern de lactosa en los estados
reprimido e inducido. El operador se aisl como un oligonucletido de 27 bp protegido de la
digestin de la ADNasa por el represor de Lac unido. La especificidad de la unin del represor Lac al
operador es alta, siendo la constante de equilibrio aproximadamente 10213 mol L21. Tambin se
ha determinado la estructura tridimensional del represor de Lac complejado con un ADN de
operador sinttico de 21 pb. En la estructura cristalina del complejo represor-ADN, los cuatro
dominios de unin a ADN del tetrmero represor de Lac estn unidos a dos hlices dobles
independientes y simtricas del operador (Figura 4). Ver tambin: Constantes de encuadernacin:
Medicin y rango biolgico.

Figura 5 Diagrama del opern de lactosa en los estados reprimido (a) e inducido (b). La sntesis de
las protenas de opern de lactosa, determinada genticamente por los genes estructurales (lacZ,
lacY y lacA), est bloqueada por el represor LacI sintetizado por el gen regulador, lacI. El operador
(O) es el sitio de interaccin especfica con el represor. El represor puede ser inactivado por el
inductor, lo que permite que la transcripcin tenga lugar en el promotor. Inherente al modelo de
opern es la suposicin de que la transferencia de informacin gentica de genes a protenas
implica un mRNA de corta vida. Reimpreso con permiso de Jacob F y Monod J (1961) Mecanismos
reguladores genticos en la sntesis de protenas. Journal of Molecular Biology 3: 318 - 356.
Derechos de autor # 1961 Academic Press. Dibujo cortesa de Jean-Marc Ghigo.

El inductor

Hasta finales de la dcada de 1940 slo los sustratos de las enzimas eran conocidos para servir como
inductores de esas enzimas. La sntesis de b-galactsidos artificiales hizo posible separar su papel
como sustratos enzimticos de su papel como inductores. El hallazgo de Monod, a principios de los
aos cincuenta, de que un b-galactsido podra ser un inductor pero no un sustrato, llev al uso del
trmino "inductores gratuitos". La existencia de inductores no substrato descart cualquier
conexin directa entre los bgalactsidos como sustratos y como inductores. Fue este
descubrimiento el que condujo al abandono del trmino "adaptacin enzimtica" ya la adopcin de
la "sntesis enzimtica inducida". Otro descubrimiento importante surgi del estudio de la
induccin: el concepto de "alostera". Desde el principio de la dcada de 1960, uno de los principales
intereses de Monod era cmo las protenas reconocen las seales qumicas: cmo el represor
reconoce tanto el inductor como el ADN. La interaccin entre el inductor y el represor fue
extremadamente rpida, especfica y totalmente reversible. El estudio del fenmeno de la induccin
sugiri a Monod la teora de la alostera: se postul que el represor posea dos sitios
estereospecficamente diferentes, uno para el inductor y otro para el operador de ADN. La induccin
se debe enteramente a alteraciones conformacionales reversibles inducidas en la protena unida al
ADN cuando interacta con el inductor. Posteriormente, el concepto de alostera se convirti en
una importante generalizacin biolgica y una de las ideas ms importantes que surgieron del
estudio del modelo opern. Hoy sabemos que la mayora de los mecanismos de sealizacin celular
implican interacciones alostricas. Una gran sorpresa vino de la conclusin de que en una lacZ2 LacY
+ cepa la permeasa no fue inducida por la lactosa, lo que sugiere que la b-galactosidasa es necesaria
para la permeasa (y acetilasa) que se induce. Dado que la b-galactosidasa puede actuar tanto como
una hidrolasa como una transferasa, puede transferir el resto galactosilo desde la posicin C4 hasta
la posicin C6 de glucosa para formar el 1-6-bD-galactsido-glucosa, un ismero de lactosa,
alolactosa, que Es el inductor natural del opern lac.

Catabolita Represin Control de laca

La represin catablica es un trmino relativamente reciente dado a un fenmeno descubierto hace

casi un siglo por Dienert, y sucesivamente denominado adaptacin, diauxie y efecto glucosa.
Una observacin importante fue realizada por Karstrom en 1938, que demostr que las bacterias
crecidas en glucosa son incapaces de fermentar otros azcares, como galactosa, maltosa o lactosa,
mientras que las bacterias crecidas en estos azcares son capaces de crecer en glucosa. El primer
anlisis cuantitativo de este fenmeno fue realizado por Monod en 1945. Cultiv cultivos
bacterianos en presencia de dos carbohidratos en lugar de uno y, dependiendo de la naturaleza de
los dos carbohidratos, la curva de crecimiento mostr dos ciclos sucesivos de crecimiento,
separados por Un lag.Monod llamado este fenmeno 'diauxie'. Cuando la glucosa se asociaba con
carbohidratos, como la maltosa o la lactosa, metabolizada por "enzimas adaptativas", el crecimiento
diauxico se produca invariablemente. Monod concluy que el crecimiento diahlico fue el resultado
de una accin inhibidora de la glucosa en la formacin de la enzima adaptativa especfica. Ms tarde
demostr que la glucosa inhibe la sntesis de la b-galactosidasa. En 1961, se observ que los
productos del catabolismo de la glucosa, en lugar de la propia molcula de glucosa, son responsables
del efecto inhibitorio de la glucosa sobre la sntesis enzimtica; Por lo tanto, un nuevo nombre para
el efecto de la glucosa, "catabolita represin" fue acuado. La identificacin de 3'5'-cclico
adenosina monofosfato (cAMP) en glucosestarvedE. Coli, en 1965, sugiri un posible papel de este
nucletido en la represin cataboltica. De hecho, la adicin de AMPc a una cultura cultivada con
glucosa podra superar la represin catablica de la sntesis de la b-galactosidasa. Un estudio
adicional de los mecanismos de la accin del AMPc condujo al descubrimiento de la protena
receptora de AMPc, tambin llamada protena activadora de catabolitos (CAP) y al gen
correspondiente, crp, as como a la identificacin del gen cya que codifica la adenilato ciclasa, la
enzima Responsable de la sntesis de AMPc. Posteriormente se estableci que el complejo cAMP-
CAP promueve la expresin gnica de operones catablicos mediante la unin a sitios cercanos a la
transcripcin comienza de varios genes catablicos o operones y activa su expresin. El mecanismo
de interaccin de CAP con ARN polimerasa en estos sitios tambin ha sido aclarado. Ver tambin:
Regulacin de la transcripcin bacteriana Se ha determinado la secuencia del gen crp. Codifica una
protena de 209 residuos. CAP es un dmero y tiene un sitio de unin para cAMP por monmero. La
estructura cristalina del dmero CAP, complejado con dos molculas de AMPc, fue resuelta por Steitz
y colaboradores. CAP tiene una estructura modular, el dominio N-terminal se une a cAMP y el
dominio C-terminal se une al ADN. Tambin se ha determinado la estructura cristalina del complejo
CAP-ADN y una de las caractersticas ms sobresalientes de la unin de CAP a la regin promotora
lac es la creacin de una curva en el ADN de aproximadamente 808. Estudios estructurales in vitro
recientes sugieren que La unin de CAP estabiliza la unin del represor Lac al operador. Por lo tanto,
la PAC acta no simplemente activando la transcripcin, sino tambin aumentando la represin de
los genes lac (Figura 6). El control positivo mediado por cAMP-CAP ha sido a menudo asociado con
el efecto de cAMP en el alivio de la represin catabolita. Todava existe tal creencia en esta
asociacin que no se hace distincin entre la participacin de cAMP-CAP en la expresin de genes
eficientes y en la modulacin de la represin catabolita. Sin embargo, este modelo ha sido desafiado
a la luz de una serie de resultados que muestran que la represin catablica del opern lac (y
tambin de otros sistemas) puede ser modulada independientemente de cAMP. Por lo tanto, el (los)
mecanismo (s) responsable (s) de la represin de los catabolitos est todava pendiente de
aclaracin.
Figura 6 Estructura esquemtica del complejo CAP-ADN. Para el ADN, fuertemente doblado por CAP,
las bases y la columna vertebral se muestran en rojo. La protena se representa como un diagrama
de cinta (azul) con dos molculas de AMPc (rojo) colocadas para indicar los sitios de unin en cada
subunidad de CAP. Reproducido de Parkinson G, Gunasekera A Vojtechovsky J et al. (1996) Enlace
de hidrgeno aromtico en el reconocimiento del ADN de la protena especfica de la secuencia.
Nature Structural Biology 3: 837-841, con permiso de Nature Publishing Group. Figura cortesa de
Richard H. Ebright.

Los Componentes del Opern lac como herramientas

Fusin de b-Galactosidasa

La observacin de que los 23 residuos N-terminales de la b-galactosidasa pueden ser reemplazados

con otros aminocidos sin afectar la actividad enzimtica, permiti la produccin de fusiones entre
los genes lacI y lacZ, lo que produjo una protena hbrida con ambas actividades de represor de Lac
y b-galactosidasa . Esto abri el camino para la construccin de una variedad de fusiones lac,
resultando en la formacin de genes hbridos que especifican las protenas hbridas. En la actualidad,
existen varios vectores comercialmente disponibles para construir fusiones lacZ in vitro. La
deteccin sensible de la actividad de la b-galactosidasa con un substrato soluble incoloro, 5- bromo-
4-cloro-3-indolil-bD-galactsido (X-Gal), que forma un colorante azul insoluble tras la hidrlisis, ha
hecho que el gen lacZ una De los genes informadores in vivo ms habituales. Proporciona un mtodo
sensible para detectar genes que estn sujetos a seales reguladoras especficas, estudiar la
localizacin de una protena en un compartimento celular dado y analizar genes regulados por el
desarrollo, expresin de transgenes, expresin especfica de tejidos y otros aspectos involucrados
en la embriognesis o desarrollo biologa. La regulacin, identificacin y localizacin de muchas
protenas de diversos orgenes se han descubierto utilizando la actividad de la b-galactosidasa de
las protenas de fusin como marcador. Durante las ltimas dcadas, los ratones transgnicos que
llevan el gen reportero lacZ se han utilizado ampliamente para analizar patrones de expresin gnica
a travs de las etapas de desarrollo del ciclo de vida en diferentes tejidos. Para obtener ratones
transgnicos, el gen lacZ se fusiona con el promotor de un gen diana, entonces se prepara ADN y se
microinyecta en vulos de ratn fertilizados. La expresin del transgn que lleva actividad de b-
galactosidasa puede visualizarse fcilmente in situ en secciones de tejido usando el sustrato
cromognico X-Gal o los sustratos fluorognicos recin introducidos que permiten localizaciones
sensibles y precisas. La explosin de los datos de la secuencia del genoma revel que una gran
fraccin de los marcos de lectura abierta codificados por estos genomas no tiene funcin biolgica
conocida. Un gran desafo sigue siendo encontrar nuevas tcnicas eficaces para investigar la funcin
de estos genes, un enfoque conocido como "genmica funcional", que incluye el anlisis de las
interacciones protena-protena, que son fundamentales para la mayora de los procesos biolgicos.
En la actualidad, el enfoque ms potente utilizado para seleccionar o detectar las interacciones
protena-protena se basa en dos mtodos hbridos. Originalmente desarrollado por Fields y Song
en 1989, en la actualidad se han descrito varios sistemas hbridos de levadura o bacterianos; En
general, los dos putativos asociados proteicos se fusionan a dos polipptidos que interactan, tales
como factores de transcripcin o dominios complementarios de una protena especfica. En la
mayora de los sistemas, la lectura de la asociacin de protenas hbridas se acopla a fenotipos
seleccionables o sometidos a seleccin, uno de los ms sensibles es la expresin de LacZ. Ver
tambin: Ingeniera Gentica: Genes Reporter; Fusin de dominio de protenas

alfa-Complementacin

Tal vez la propiedad ms ampliamente explotada de b-galactosidasa es el fenmeno llamado

complementacin. Esta complementacin implica la reasociacin no covalente de fragmentos
complementarios de la cadena polipeptdica de la subunidad de la b-galactosidasa, que luego se
reensamblan en una estructura tetramrica enzimticamente activa. En el caso de la
complementacin, la restauracin de la actividad enzimtica se produce cuando los 60 residuos N-
terminales de la b-galactosidasa interactan in vivo o in vitro con un mutante LacZ inactivo (un
aceptor) que carece de los codones 11-41. Este fenmeno se utiliz para desarrollar nuevos vectores
de clonacin para identificar colonias bacterianas que contienen ADN recombinante en 1977; La
regin reguladora lac y los 60 primeros codones del gen lacZ se insertaron en el ADN del fago M13.
Las bacterias, que producen la protena aceptor, cuando se infectan con el fago producen
bgalactosidasa activa por complementacin y forman placas azules en presencia de X-Gal. La
insercin de ADN extrao en la regin de M13 interfiere con la complementacin a, dando lugar a
recombinantes que forman placas incoloras. Esta simple prueba ha hecho que la clonacin en M13
sea un procedimiento de rutina. La complementacin intracistrnica del gen lacZ se ha adaptado
recientemente para uso en clulas eucariticas. Se ha demostrado que la complementacin de
mutantes lacZ relevantes en clulas de mamferos permite el anlisis de la fusin celular y la
deteccin de protenas interactuadas co-localizadas dentro de clulas intactas individuales. La
complementacin intracistrnica de la b-galactosidasa tambin se ha utilizado para la evaluacin
directa de interacciones especficas de dimerizacin de protenas en un contexto biolgicamente
relevante. Vea tambin: Hbridos celulares.
Lac repressor como herramienta

La capacidad del represor de Lac para unirse eficientemente al operador y liberarse de l mediante
un inductor ha sido frecuentemente utilizada para modular la expresin gnica o para seleccionar
mutantes negativos homocigticos en clulas eucariotas. La estructura modular del represor de Lac
permite la creacin de protenas de fusin, incluyendo dominios de localizacin nuclear eucaritica
y dominios de activacin de la transcripcin a ambos extremos N y C del represor sin interrupcin
significativa de la unin especfica al ADN. Esta propiedad del represor de Lac se ha utilizado para
examinar bibliotecas de pptidos complejos para interaccin directa con un receptor dado. Los
pptidos fusionados al extremo C del represor de Lac pueden todava unirse al operador con alta
eficiencia. Esta unin permite el enriquecimiento para ligandos peptdicos especficos en la
poblacin aleatoria de pptidos por purificacin por afinidad de los complejos peptdico-represor-
operador con un receptor inmovilizado. El sistema de deteccin de mutacin de ratn transgnico
Big Blue comercialmente disponible proporciona un enfoque potente para el anlisis directo de
mutaciones espontneas y qumicamente inducidas in vivo. El ratn Big Blue es transgnico para
tres elementos genticos del opern lactosa: el gen lacI, el operador y el gen lacZ. El gen lacI es el
blanco de la mutagnesis. Las clulas con un gen lacI mutado producen un represor Lac defectuoso,
por lo tanto la b-galactosidasa se sintetiza y puede ser fcilmente detectada. Las clulas con el gen
lacI no mutado producen represor activo y no se produce b-galactosidasa. Este sistema ha sido
ampliamente utilizado para estudiar los efectos de los carcingenos qumicos sobre las frecuencias
de mutacin. Vase tambin: Organismos experimentales utilizados en gentica; Protenas:
Etiquetas de Afinidad Dada la amplia gama de aplicaciones a las que se ha asociado el opern lac,
se puede anticipar que desarrollos adicionales contribuirn a nuestra comprensin de muchas
caractersticas de la regulacin y organizacin celular.