UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

Facultad de Ciencias Biolgicas
Departamento de Microbiologa y Parasitologa

Alumno:
Saavedra Camacho, Johnny Leandro

Tema:
Aislamiento de hongos productores de antibiticos en tierra de cultivo

Docente:
Blgo. Carlos A. Espinoza Valera

Lambayeque Per
2017
INTRODUCCON
El suelo es un reservorio natural de microorganismos, capaces de originar muchos productos
biolgicamente activos, incluidas la molculas antibiticas, que frecuentemente se producen
en respuesta al estrs ambiental o la competencia con otros microorganismos. Los
metabolitos microbianos son fuentes ricas para el desarrollo de nuevos agentes
antimicrobianos, de origen natural. Siendo los actinomicetos y hongos filamentosos, la
principal fuente de los antibiticos naturales.

La funcin de un antibitico es suprimir el crecimiento de otros microorganismos y en algunos

casos eliminarlos. Pero, a pesar de que ms de cinco mil sustancias antibiticas han sido
identificadas a partir de los cultivos de hongos filamentosos y bacterias, Gram positivas y
Gram negativas, solo alrededor de cien antibiticos se han utilizado comercialmente para el
tratamiento de enfermedades en humanos, animales y plantas, muchas veces por su alta
toxicidad. Al mismo tiempo que, la aparicin de agentes patgenos resistentes a mltiples
de estos frmacos, requiere la bsqueda continua de nuevos compuestos antimicrobianos
eficaces para controlar la propagacin de agentes patgenos resistentes, as como para el
tratamiento de enfermedades mortales como el cncer.

Considerando que la introduccin de nuevos antibiticos se est convirtiendo en unos de los

principales problemas con los que se enfrenta la sanidad a nivel mundial, la bsqueda de
sustancias antibiticas desconocidas, eficaces contra las bacterias patgenas resistentes a
mltiples frmacos es un rea importante de la investigacin biotecnolgica.

Los hongos son organismos eucariotas, hetertrofos y poseen una pared celular quitinosa,
que crecen como filamentos multicelulares llamados hifas las cuales forman un micelio,
algunas especies tambin crecen como clulas individuales. La mayora de los hongos no
son percibidos a simple vista, pueden estar presentes en el suelo, la materia muerta, y
formando simbiosis con plantas, animales u otros organismos. Los hongos se utilizan como
fuentes para producir antibiticos, para la industria mdica, y diversas enzimas, tales como
las celulasas, pectinasas y proteasas, importantes para el uso industrial. Estos se distribuyen
por todo el mundo, y crecen en una amplia variedad de hbitats, la mayora en ambientes
terrestres, incluyendo los desiertos, algunas especies viven exclusivamente en los hbitats
acuticos, ambientes hipersalinos y las profundidades del mar y tambin se los puede
encontrar en las rocas. Estos organismos soportan temperaturas extremas tanto bajas como
altas, la mayora de las especies son capaces de sobrevivir a la radiacin UV.
 I. POBLACIN DE MICROORGANISMOS EN UN SUELO AGRCOLA FRTIL

El suelo constituye un sistema complejo, principalmente diverso, que alberga una gran
riqueza de especies vegetales, animales y microbianas. Se considera un ambiente apropiado
para el desarrollo de los microorganismos tanto procariotas como eucariotas. Algunos
componentes del suelo sirven como fuentes de nutrientes para los microorganismos que lo
habitan como los minerales, materia orgnica, exudados radicales y biomasa. La fisiologa
del microorganismo depender de la naturaleza qumica y fsica del ambiente, es decir, de
los componentes que constituyen el suelo. Entre los gneros ms comunes de hongos
encontrados tenemos a Penicillium y Aspergillus.

Tipo de microorganismo Nmero aproximado por gramo

Bacterias 2,500,000,000

Actinomicetos 700,000

Hongos 400,000

Algas 50,000

Protozoos 30,000

II. FACTORES QUE INFLUYEN LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL

SUELO AGRCOLA

La poblacin microbiana puede variar de acuerdo a una gran cantidad de factores entre estos
los ms importantes son la cantidad de agua disponible, la materia orgnica presente, el pH,
la temperatura y la humedad.

El contenido de materia orgnica de un suelo proviene de restos de plantas y animales

muertos, ya que estos se descomponen en el suelo por accin de algunos invertebrados y
microorganismos principalmente hongos y bacterias. As, el nmero de microorganismos
disminuye a medida que se aleja de la superficie del suelo como de la materia orgnica y
oxgeno, debido a que la mayora de los microorganismos presentes son hetertrofos
aerobios, que participan en la descomposicin de sustratos orgnicos. Por tal razn, la
proporcin de los anaerobios aumentara con la profundidad, pero no en grandes cantidades.

Generalmente las condiciones neutras favorecen el crecimiento de bacterias y hongos pero

el alto contenido de sal puede ser toxico. En cuanto a la temperatura, existen
microorganismos que pueden crecer en entornos extremos, tales como 60C, as como a
temperaturas muy bajas de -18C. La humedad excesiva, mayor del 65% en el suelo reduce
el nmero de microorganismos.

El crecimiento de la poblacin de microorganismos depende de la concentracin de

sustancias inorgnicas en el suelo. Adems, que los nutrientes presentes en el suelo son
absorbidos por las plantas y microorganismos.
III. HONGOS DE SUELO AGRCOLA PRODUCTORES DE ANTIBIOTICOS

Hay ciertos gneros de hongos que producen una cantidad relativamente alta de antibiticos,
Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium y Fusarium. Los hongos poseen varios tipos de
metabolitos secundarios, pero solo aproximadamente mil quinientas, muestran actividad
antibitica.

Hongos productores % de antibiticos descritos

Penicillium 4,1

Aspergillus 3,0

Fusarium 1,2

Cephalosporium 0,8

Penicillium:

Los miembros del gnero Penicillium son hongos filamentosos. Se caracterizan por
formar conidios mediante una estructura ramificada que recuerda la forma de un pincel,
las ramificaciones terminan en unas clulas que se conocen como filides. Las filides
originan las esporas. Las especies de Penicillium estn ampliamente distribuidas en la
naturaleza y se hallan en el suelo y la vegetacin cada. Se encuentra en el suelo
cumpliendo la funcin de solubilizador de fsforo, en suelo de cultivos como el arroz
puede encontrarse en gran cantidad este hongo. Estos microorganismos producen los
distintos tipos de penicilina y la griseofulvina, aunque con una toxicidad relativamente
baja.
 Aspergillus:

Es un gnero de alrededor de 600 hongos (mohos), y es ubicuo. Los hongos se pueden

clasificar en dos formas morfolgicas bsicas: las levaduras y las hifas. Aspergillus es
un hongo filamentoso (compuesto de cadenas de clulas, llamadas hifas). Tambin
participa como solubilizador de fosforo en suelos y se puede encontrar ampliamente
distribuidos en cultivos de arroz, maz y soja. Los gneros de Aspergillus pueden producir
penicilinas de baja toxicidad.

Cephalosporium:

Las especies de Cephalosporium suelen ser de crecimiento lento y son inicialmente

compactas y hmedas. Sus hifas son finas y hialinas , y producen filides en su mayora
simples . Sus conidios suelen ser unicelulares (es decir, ameroconidios ), hialinos o
pigmentados, globosos a cilndricos y en su mayora agregados en cabezas viscosas en
el pice de cada filide. Estn distribuidas ampliamente en suelos agrcolas de maz,
como patgenos causando marchitamiento tardo. Comnmente produce antibiticos
como las cefalosporinas.
 Fusarium:

Fusarium es un extenso gnero de hongos filamentosos ampliamente distribuido en el

suelo y en asociacin con plantas. La mayora de las especies son saprfitas y son unos
miembros relativamente abundantes de la microbiota del suelo. Las esporas del hongo
son fcilmente reconocibles al microscopio por su forma de media luna o de canoa. Estn
distribuidas en suelos agrcolas de tomate, frijol, aj, algodn, arroz, etc., causando
chupadera fungosa. El gnero Fusarium en general tiene muy poca actividad productora
de antibiticos, sin embargo, los japoneses descubrieron en 1926 unas sustancias con
propiedades reguladoras del crecimiento al estudiar una enfermedad del arroz causada
por el hongo Fusarium moniliforme que se denomin Gibberella fujikuroi, establecindose
como el agente causal. Las plantas atacadas por esta enfermedad eran ms altas y
delgadas aunque casi no tenan lignificacin y lo llamaron sndrome de las plantas locas,
siendo el mismo genotipo aparecan dos fenotipos diferentes. Se analiz el hongo
tomando el lquido de extraccin y el propio hongo, a la sustancia que ste excretaba se
la denomin giberelina.

IV. ANTIBIOTICOS OBTENIDOS DE HONGOS AISLADOS DE SUELO AGRCOLA

a) Penicilina:
Las penicilinas constituyen uno de los grupos de antibiticos de mayor importancia.
Desde que pudo contarse con la primera han surgido otros antimicrobianos, pero sigue
siendo uno de los ms importantes y de mayor uso, y se siguen sintetizando nuevos
derivados del ncleo penicilnico bsico. Muchos de ellos ofrecen ventajas peculiares
y, por tal razn, los miembros de este grupo constituyen los frmacos ms indicados
contra un gran nmero de enfermedades infecciosas. Esta clase comprende a las
penicilinas G y V, que son altamente activas contra cocos Gram positivos sensibles;
penicilinas resistentes a la penicilinasa como nafcilina, que son muy activas contra
Staphylococcus aureus productor de penicilinasa. La estructura bsica de las
penicilinas, incluye un anillo de tiazolidina unido a otro anillo lactmico que est
conectado con una cadena lateral (R). El propio ncleo de penicilina es el elemento
estructural fundamental de actividad biolgica; la transformacin metablica o la
alteracin qumica de esta parte de la molcula hace que se pierda toda accin
bacteriana importante. La cadena lateral es la que rige muchas de las caractersticas
 antibacterianas y farmacolgicas de un tipo particular de penicilina. Se han producido
penicilinas naturales con base en la composicin qumica del medio de fermentacin
utilizado en el cultivo de Penicillium. La penicilina G (benclica) es la que presenta
mayor actividad antimicrobiana de todas y la nica penicilina natural que se utiliza en
clnica. En la penicilina G, la cadena lateral es un sustituyente fenilmetilo.

b) Griseofulvina:
Es fungisttica in vitro contra varias especies de los dermatofitos Microsporum,
Epidermophyton y Trichophyton. No tiene efecto alguno en bacterias u otros hongos.
Una manifestacin morfolgica prominente de la accin de la griseofulvina es la
produccin de clulas multinucleadas conforme el frmaco inhibe la mitosis del hongo.
En las clulas de mamfero tratadas con concentraciones altas, la griseofulvina
provoca desorganizacin del huso mittico al interactuar con los microtbulos
polimerizados. Adems de fijarse a la tubulina, la griseofulvina tambin se une a una
protena asociada al microtbulo.
c) Cefalosporinas:
La cefalosporina contiene una cadena lateral derivada del cido D-aminoadpico ,
condensado con un sistema de anillo lactmico de dihidrotiazina (cido 7-
aminocefalospornico). Los compuestos del cido son relativamente estables en un
medio cido diluido y fuertemente resistente a la penicilinasa, independientemente de
la naturaleza de sus cadenas laterales y su afinidad por la enzima. Las cefalosporinas
y cefamicinas inhiben la sntesis de la pared bacteriana de manera semejante a como
lo hace la penicilina.
V. METODOLOGA DE LA OBTENCIN DE ANTIBITICO

Material para el anlisis:

Las muestras se recolectan, a una profundidad de 5 10cm de la superficie del suelo
de tierra de cultivo, las mismas deben mantenerse en recipientes estriles, a 3C de
temperatura, hasta la realizacin del anlisis.

Aislamiento y purificacin de cepas microbianas del suelo:

Esta fase es necesaria para obtener cepas puras con las cuales se trabajara mejor
manera.

Preparacin de una suspensin con agua estril:

Se pesan 10gr de la muestra de suelo para aadirla a un frasco con 90ml de agua
destilada estril y se agita continuamente por 30 minutos.

Diluciones:
Se preparan tubos de ensayo estriles con 9ml de agua destilada, para preparar la
serie de diluciones desde 10-1 hasta 10-8.

Siembra de diluciones:
Se utiliza el PDA (Potato Dextrose Agar) para favorecer el crecimiento de mohos y
levaduras. Una vez servido el medio en placas de Petri, se siembra 1ml por el mtodo
de dispersin, de cada dilucin obtenida. Luego se lleva incubar durante 72 horas a
25C.

Aislamiento de microorganismos:
Transcurridas las 72 horas de incubacin, se seleccionan las placas Petri donde se
observan colonias aisladas, tomando como criterio de seleccin aquellas placas
donde se aprecia un nmero mximo de 300 UFC.

Antibiograma con cepas preseleccionadas:

Se utilizan microorganismos que tericamente pueden ser inhibidos por la presencia
del hongo que se est estudiando. Los microorganismo pueden ser Staphylococcus
aureus, Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas, Enterobacterias, etc.
Para este paso se pueden realizar por este mtodo:
 Mtodo de rayado con palillos:
Se prepara el microorganismo sensible, inoculando cada cepa en 10ml de
caldo tripticasa soya estril, y se deja en incubacin por 18 horas a 30C.
Transcurrido el tiempo se realiza el ajuste de la turbidez hasta obtener la
turbidez al 0,5 de MacFarland obteniendo una suspensin bacteriana que
contiene 1,5 x 108 UFC/ml.
Luego se utiliza agar nutritivo para poder sembrar el microorganismo sensible
presente en la suspensin, una vez realizada la siembra, se siembra con
palillos estriles de entre 1 a 2 cm las cepas preseleccionadas obtenidas del
suelo agrcola sobre la superficie de la placa, entre 5 a 8 palillos y se lleva a
incubar a 25C durante 24 a 72 horas para permitir el crecimiento de los hongos
aislados del suelo agrcola y la produccin del antibitico.
Se observa el resultado y se seleccionan las cepas que producen el halo de
inhibicin alrededor del rayado de los diferentes microorganismos.

Caracterizacin de las cepas productoras de antibiticos:

Se realiza la tincin con azul de metileno para observar la estructura celular de la cepa
del hongo usando posteriormente el microscopio ptico.

Cintica de crecimiento microbiano:

Temperatura ptima de crecimiento:

Se lleva a cabo la determinacin del crecimiento microbiano en cepas
productoras de antibiticos, variando la temperatura a 18C, 30C y 45C.

pH ptimo de crecimiento:
Se realiza la determinacin del crecimiento microbiano en cepas productoras
de antibiticos a diferentes valores de pH 5, 6, 7 y 8.

Produccin del antibitico:

Se prepara caldo ISP2 con 4g de extracto de levadura, 10g de extracto de malta y 4g
de dextrosa. Se regula el pH del caldo hasta llegar a 8,6 y posteriormente se lleva
hasta ebullicin para finalmente autoclavar.
Se prepara tambin 1000 ml de medio antibitico pesando 1,5 g de extracto de carne,
6 g de extracto de peptona de gelatina, 3 g de extracto de levadura y 15 g de agar. Se
regul el pH del medio hasta llegar a 8,6, posteriormente se lleva a ebullicin para
finalmente autoclavar.
 Actividad antimicrobiana:
Como una prueba preliminar se evala el potencial antibitico de las cepas
seleccionadas en caldo ISP2 durante 10 das, con el fin de elegir el tiempo de
cultivo favorable para la produccin de antibiticos. Los matraces de 250ml que
contenan 50ml de medio previamente inoculados con 3ml de caldo con pre-
cultivo de las cepas seleccionadas con el mismo medio, y se incuba a 30C
durante 2 das. Los cultivos se incubaron en un agitador rotatorio a 30C
durante 10 das. La produccin de antibiticos tiene que ser examinada todos
los das.

Mtodo de difusin en pocillo de agar:

Se coloca 60ul del sobrenadante en el pozo, realizado con pipetas Pasteur en
medio antibitico previamente inoculado con los microorganismos sensibles.
Para obtener el rea de inhibicin total se resta el rea del pocillo.

Extraccin y purificacin de antibiticos:

El caldo de cultivo se centrifuga para separar la biomasa bacteriana, posteriormente
se retira el sobrenadante y se coloca en un embudo de separacin con la misma
cantidad de diclorometano, el cual extrajo el medio, dejando como resultado las
mezclas antibiticas. Posteriormente se disolvi las mezclas en 1ml de metanol y se
bioensaya contra los microorganismos sensibles como patgenos. Utilizando el
ensayo de difusin en pocillo de agar.

Espectro infrarrojo de los antibiticos obtenidos:

Se realiza la tcnica de las micropastillas de KBr, donde se pesa un gramo de KBr y
compactndolo en una pastilla baada por una gota del antibitico purificado
previamente diluido en metanol y se procede hasta la lectura.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Goodman y Gilman. Bases Farmacolgicas de la Teraputica. Mc Graw Hill
Interamericana. 2 volmenes. 10 Edicin. 2001.
http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/12142/1/UPS-QT09705.pdf
Prescott, L. M., Harley, J. P., y Klein, D. A. Microbiologa. 4 edicin. McGraw-Hill
Interamericana, 1999.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biologa de los Microorganismos.
10 edicin. Prentice-Hall. Madrid, 2003.