FICHE N9 Extraction de chlorophylle et sparation des composants de la chlorophylle brute

Cette manipulation courante en SVT, trouve sa place dans cet enseignement comme un exemple de
prparation dun extrait : la chlorophylle brute. Elle est complte par une manipulation un peu
moins courante trouve sur le site http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
qui permet de sparer les composants de la chlorophylle.

1- Rle des pigments chlorophylliens en cosmtologie

La chlorophylle dite brute contient des chlorophylles a et b, des carotnes et de la xanthophylle

1-1-Effets cosmtiques des pigments de la chlorophylle

Beaucoup de produits cosmtiques contiennent de la chlorophylle, surtout des produits naturels : on
lui prte des effets rafraichissants, tonifiants, stimulants, antioxydantes, antige mais nous navons
trouv aucune trace de recherche prouvant les effets de la chlorophylle. Cet actif embrouille le
consommateur qui lassocie au vert, au naturel
En revanche laction anti-oxydante des carotnodes et des xanthophylles est bien documente
(exemple de rfrence http://www.sfa-site.com/?q=ingredients_rech/Peau&page=4). Beaucoup ,de
travaux portent sur leurs effets in vivo car ils sont utilises dans ce qui est appel
Nutricosmtiques , les cosmtiques de lintrieur , comme acclrateur de bronzage, anti-
radicalaires. ..

1-2-Les pigments comme colorants dans les cosmtiques

De nombreuses substances naturelles sont utilises dans les cosmtiques. Les chlorophylles,
carotnodes et xanthophylles sont des colorants utiliss en cosmtologie.

Colorants naturels
E 100 Curcumine
E 101 Lactoflavine (riboflavne)
E 120 Cochenille, Acide carminique
E 121 Oseille, orcine
E 140 Chlorophylles
E 14 Complexes cuivriques des chlorophylles et chlorophyllines
E 150 Caramel
E 153 Carbo-indecinalis vegetalis
E 160 Carotnode
E 161 Xantophylles
E 162 Rouge de betterave, btanine
E 163 Anthocyanes

Tir de : http://www.dermaptene.com/les-lexiques/1-allergologique/484-colorants-alimentaires-et-
pharmaceutique
Plusieurs articles signalent la possibilit de toxicit des xanthophylles dans les aliments.

2- Extraction de la chlorophylle

Voir le protocole sur : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Photosynthese-cours/04-pigments.htm

ou http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
 Ci-dessous un rsultat dextraction de chlorophylle dpinards.
(http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle)

3- Sparation des pigments chlorophylliens par chromatographie sur couche mince (CCM)
Voir le protocole sur : http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
Images et commentaire de la plaque trouv sur ce site.

Plaque CCM. Dpt au capillaire. Taches aprs lution.

Analyse de la plaque :

En haut de la plaque, on remarque une tache jaune constitue de carotnes

Puis vient une tache de couleur vert-bleu correspondant la chlorophylle a.

Puis une tache de couleur vert-jaune correspondant la chlorophylle b.

Enfin, deux tches jaunes constitues de xanthophylles (violaxanthine et noxanthine).

NB : on obtient le mme rsultat sur du papier de cellulose (papier filtre)

4- Sparation et extraction des pigments
 Voir le protocole complet et les rsultats sur
http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
Ci-dessous quelques extraits

4.1 Matriel et produits

Colonne de chromatographie (ou burette gradue) ,

Coton

Sable grossier

Sable de Fontainebleau (sable fin)

Sucre glace

Pipette

Erlenmeyer ou autre rcipient en verre denviron 100 mL

ther dithylique

ther de ptrole
4.2 Protocole

Les constituants de lextrait dpinard sont rcuprs grce la chromatographie liquide sur
colonne. Cette technique de purification peut sembler difficile mettre en uvre la premire fois,
mais en respectant bien les diffrentes tapes dcrites, russir la purification est loin dtre si
complexe que a. Nous verrons ici la purification avec du sable de Fontainebleau et, chose rare, du
sucre glace !

La chromatographie liquide sur colonne (CLC) ncessite lemploi dune colonne de verre, dune
longueur dune trentaine de centimtres, si possible munie dun robinet son extrmit infrieure. Si
la colonne na pas de robinet, on peut fixer son extrmit un tuyau muni dune pince de Mohr.
 Colonne sans robinet. Colonne avec pince de Mohr.
Prparation de la colonne
Prparer 400 mL dluant : mlange de solvants ther de ptrole/ther dithylique (60/40 en
volume)
Fixez la colonne en deux points un support fixe.
Remplir la colonne de sable de Fontainebleau sur environ 20 cm de hauteur.

Colonne fixe. Colonne remplie de sable.

 Videz la colonne dans un bcher de 400 mL.
Replacez la colonne sur son support et placer un peu de coton en bas de colonne puis le
recouvrir dune couche denviron 1 cm de sable.
Ajoutez environ 10 cm de lluant et chassez les bulles dair en tapotant lgrement la
colonne laide dun objet quelconque en caoutchouc (une gomme fait trs bien laffaire).
Ajoutez environ 200 mL dluant dans le bcher contenant le sable. Bien agiter pour obtenir
un gel un peu visqueux.
Versez doucement ce gel dans la colonne. Chassez les bulles dair en tapotant la colonne.
Rajoutez si besoin de lluant dans la colonne de faon ce que le haut de la couche de sable
ne soit jamais sec. Laisser environ 2 cm de solvant au-dessus du sable de Fontainebleau.
Dposez doucement environ 1 cm de sable grossier sur le sable de Fontainebleau.

Sable grossier ajout dans

Sable et solvant Solvant au dessus du la colonne.
Sable dans un bcher.
mlangs. sable.
4.2.2 Purification sur la colonne de sable [3]

Laissez le solvant scouler jusqu atteindre la couche de sable grossier.

Prlever la solution dextrait dpinard dans le dichloromthane laide dune pipette et la
dposez goutte goutte sur tout le pourtour interne de la paroi. Ne pas dposer la solution
directement sur le sable.
Laissez scouler un peu de solvant pour faire pntrer lextrait dans le sable.
Rajoutez la pipette (toujours sur le pourtour de la colonne) de lluant propre.
Laisser couler le solvant en en rajoutant rgulirement de lluant en haut de colonne afin
que celle-ci ne soit jamais sche.
Solvant affleurant la couche de sable grossier. Extrait en dbut de colonne. Ajout de solvant.

Observez les couleurs qui semblent avancer sur le sable.

Les substances sont spares dans le mme ordre qu'en Belle sparation de toutes les
CCM. couleurs.

Rcuprer les diffrentes fractions dans des erlenmeyers, ou tout rcipient en verre, en
fonction de la couleur du coton en bas de colonne. On obtient ainsi les carotnes, la chlorophylle
a, la chlorophylle b et les xanthophylles.
Fraction jaune : Fraction bleu-verte : Fraction verte : Fraction jaune :
carotnes. chlorophylle a. chlorophylle b. xanthophylles.

Ensemble des fractions rcupres.

En vaporant une partie du solvant, on obtient des solutions concentres de ces molcules.

Solutions concentres dans l'ther, de gauche droite : carotnes, chlorophylles a, b, xanthophylles.

4.2.3 Purification sur colonne de sucre [4]

Prparez la colonne de la mme faon que prcdemment en remplaant le sable de

Fontainebleau par du sucre glace.
 Dposez lextrait et ralisez llution comme prcdemment.

CLC sur sucre glace. Sparation. Sparation.

On peut donc de la mme faon que prcdemment rcuprer les diffrentes fractions
composant lextrait dans des rcipients en verre. On retrouve les carotnes (jaune), les
chlorophylles a et b (respectivement vert-bleu et vert-jaune) et la violaxanthine (jaune, trs peu
visible sur le sucre). Et ceci grce du sucre glace.
5 Explications

5.1 Plusieurs couleurs pour un mme compos !

Extrait vu la lumire naturelle. Extrait clair par UV.

La mme exprience peut tre ralise sur les diffrentes fractions aprs chromatographie :

Sous lumire naturelle, de gauche droite (dans lther) : carotnes, chlorophylles a, b,

xanthophylles.
Sous UV, de gauche droite (dans lther) : carotnes, chlorophylles a, b, xanthophylles.

Les carotnes ne sont pas fluorescents et les xanthophylles ne le sont que trs peu, du moins dans la
longueur d'onde utilise ici.

5.2 Extraction et sparation

Les solvants employs lors de lextraction ne dissolvent pas que les chlorophylles mais galement
dautres pigments. Pour obtenir les chlorophylles pures, il faut sparer le mlange par
chromatographie.

Cette technique est base sur les diffrentes interactions entre une molcule, un support solide et un
solvant. Le solide est du sable, donc de la silice qui prsente sa surface de nombreux groupes
hydroxyles (-OH) qui vont interagir avec les molcules dissoutes dans un solvant. Le sucre en poudre
(saccharose) peut jouer le mme rle en raison de ses nombreux groupes hydroxyles disponibles.