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PRODUCCION DE PLACAS DE INMUNODIFUSION RADIAL

PARA LA CUANTIFICACION DE IgG HUMANA

Bruno Lomonte*, Eugenia Mata*

Key Word Index: Radial lnmunodiffusion, Human lgG

RESUMEN 1,5 cm) de protena A-Sepharose 4 B (Pharmacia


Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) equili brada con el
Se describe un mtodo para la preparacin de placas mismo amortiguador. Se registr la absorbancia del
de inmunodifusin radial para la cuantificacin de la eluente a 280 nm, y una vez que sta regres a la
lgG humana. El mtodo s e bas en las siguientes lnea base se eluy la IgG con un amortiguador de
etapas: (1) aislamiento de lgG de suero normal glicina HCI 0,1 M (pH 3,0) (Fig. 1). El goteo fue
mediante cromatografa de afi nidad; (2) inmunizacin recogido directamente en tubos con 0,5 ml de
en cobayo con lgG com pleta en un esquema breve amortiguador Tris 0,5 M (pH 8,8) a razn de 80
para evitar la induccin de anticuerpos anti-cadenas gotas/tubo en un colector de fracciones (Isco,
livianas; (3) evaluacin de la especificidad del Nebraska, E.U.A.). La fraccin de lgG se dializ
antisuero; (4) preparacin de las placas y contra agua destilada durante 48 horas a 4 C y se
estandarizacin de las variables; y (5) evaluacin del liofiliz.
mtodo en estudio frente a un mtodo comercial El anlisis de la pureza de esta preparacin se realiz
usado corno referencia. mediante electroforesis discontinua en gel de
La correlacin obtenida fue de 0,93 (p<0,01) lo que poliacrilamida al 10 por ciento con duode cil sulfato de
nos permite concluir que el mtodo es ade cuado, y sodio bajo condiciones desnaturalizantes, segn el
podra implementarse a escala mayor con fines de mtodo de Laemmli (4). La muestra (20 ug) se redujo
produccin.227 - 231]. por tratamiento con 2-mercaptoetanol (5%) a 100 C
durante 5 minutos y se corri junto a una mezcla de
marcadores de peso molecular (Pharmacia Fine
INTRODUCCION Chemicals, Uppsala, Suecia) tratados de igual forma.

El alto costo de la importancin de reactivos Obtencin de suero anti-IgG:


biolgicos para diagnstico, junto con la crisis Se emulsific una solucin con 2 mg de IgG en
econmica existente en Costa Rica, han moti vado a coadyuvante de Freund completo (Difco, Michigan,
varios grupos de investigadores a buscar formas de E.U.A.) y se inocul un cobayo adulto por va
producir dichos reactivos localmente (1, 6, 8, 9, 11, subcutnea. A los 15 y 30 das el animal recibi
13, 16, 17, 18). En los ltimos aos el Instituto refuerzos de 2 mg de lgG en alginato de sodio por va
Clodomiro Picado se ha sumado a esta iniciativa intramuscular. Una semana des pus del ltimo
tendiente a investigar mtodos de produccin de refuerzo se exsanguin el animal por puncin
algunos reactivos biolgicos. En el presente informe cardaca y se separ el suero.
se describe un mtodo sim ple y de bajo costo para la El ttulo precipitante de este suero se determin
preparacin de placas de inmunodifusin radial para probando diluciones dobles del mismo frente a suero
la determinacin de lgG humana en suero. humano normal, mediante doble inmuno difusin de
Ouchterlony (12) en agarosa al 0,75 por ciento en
MATERIAL Y METODOS solucin salina amortiguada con fosfatos (SSF) a pH
7,2. El anlisis de la especificidad del antisuero se
Aislamiento de IgG humana: realiz por inmunoelec troforesis (12) contra suero
Se purific IgG a partir de una mezcla de sueros humano normal, en agarosa al 0,75 por cien to en
humanos normales mediante cromatografa de amortiguador de barbital (pH 8,2). Como control en la
afinidad en protena A (2, 5, 19). Para esto se diluy 6 inmunoelectroforesis se incluy suero anti -humano
ml de la mezcla de sueros con un volumen igual total producido en carneros.
de amortiguador Tris 0,05 M NaCI 0,15 M
(pH 7,5) y se aplic a una columna (4 X Preparacin de placas para inmunodifusin
radial:
El gel empleado consisti de agarosa al 1,5 por ciento
* Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologa, Universidad con tres distintas concentraciones finales
de Costa Rica, San Jos, Costa Rica.

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y a temperatura ambiente durante 48 horas. Las
muestras se aplicaron con micropipeta Hamilton
mecnica (Hamilton Co., Nevada, E.U.A.) colocando
3 ul en las placas comerciales segn la
recomendacin del fabricante, y 2 ul en las placas
preparadas. La lectura de los dimetros de
precipitacin se hizo mediante un visor con escala de
0,1 mm (Precision Viewer, Hyland Diagnostics,
Illinois, E.U.A.) y en todos los casos se realiz por los
dos autores en forma ciega, no debiendo ser la
diferencia mayor de 0,2 mm.
Para evaluar la reproducibilidad de la determinacin
en las placas en estudio se prob una muestra de
suero seis veces, efectundose el mismo
procedimiento en placas comerciales.

RESULTADOS

El anlisis electrofortico de la preparacin de IgG


mostr dos bandas de protena de 53.000 y 27.000
daltons, correspondiendo al peso molecular de la
cadena pesada gamma y de las cadenas livianas
kappa y lambda de la lgG, res pectivamente (Fig. 2).
El anlisis inmunoelectrofortico del suero de cobayo
anti-lgG total mos tr un intenso arco de precipitacin
correspondiente a la lgG y un arco apenas perceptible
en la regin de IgA (Fig. 3). El ttulo de dicho suero en
del antisuero: 5, 10 y 12 por ciento. Para su la prueba de doble inmunodifusin fue de 1:4. Los
preparacin se mezcl volmenes iguales de agarosa resultados de las pruebas para seleccionar las
al 3 por ciento en SSF y las cantidades respectivas variables del sistema de inmunodifusin radial a
del suero en SSF pH 7,2, realizando esto con ambos emplear, se muestran en la (Fig. 4). Con una
componentes en bao a 55 C. La mezcla se verti concentracin de 5 por ciento de antisuero en el gel
sobre placas de plstico usadas de la misma casa los anillos son demasiado difusos y no se logra
comercial utilizada como referencia en este estudio, linealidad en la curva de referencia. Con 10 por ciento
sobre una superficie nivelada (Gelman, Michigan, de antisuero se obtiene linealidad con un volumen de
E.U.A.) en cantidad de 2,0 ml por placa. Una vez muestra de 2 ul y con 12 por ciento de antisuero hay
gelificadas a temperatura ambiente, las placas se linealidad para 1 y 2 ul de muestra. Debido a que el
colocaron a 4 C durante 20 minutos y luego se aumento de concentracin de anticuerpos en el gel
procedi a abrir los pozos en el gel (6/placa) con una causa una disminucin en el tamao de los crculos
pipeta Pasteur con bulbo de hule. Se probo tres de precipitacin, se escogi la concentracin de 10
tamaos de pozos, para 1, 2 y 4 ul de muestra, por ciento de antisuero. Como volumen de muestra
res pectivamente. se escogi 2 ul pues se puede medir con menos error
Para seleccionar las condiciones ms adecuadas de que 1 UI y adems produce anillos mayores.
concentracin de antisuero y volumen de muestra de Con las condiciones establecidas (2 ul y 10 por ciento
probo tres patrones de lgG comerciales (Hyland de antisuero), se analiz 34 sueros y se calcul su
Diagnostics, Illinosis, E.U.A.) en cada uno de los correlacin respecto a los valores obtenidos con
sistemas. placas comerciales. El coeficiente de correlacin fue
0,93. Estos resultados se resumen en la Figura 5.
Estudio de correlacin: La prueba de reproducibilidad dio resultados similares
Una vez escogidas las condiciones del sistema a empleando ambos tipos de placas. El coeficiente
usar, se probo su funcionamiento con 34 muestras de de variacin fue de 3,8 para las pla-
suero, las cuales se analizaron concomitantemente
empleando placas comerciales para cuantificacin de
lgG de la casa Hyland Diagnostics, que fungi en este
caso como mtodo de referencia. En todas
las determinaciones se utiliz el mtodo
de difusin completa de Mancini et al.
(7) incubando en cmara hmeda

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cas comerciales y de 3,5 para las placas en estudio,
al analizar una misma muestra seis ve ces. se puede prolongar el esquema de refuerzos (para
obtener mayores ttulos y avidez) para que no
DISCUSION aumenten los ttulos de anti -kappa y antilambda en el
suero. An as, el ttulo y la avidez obtenidos con
La inmunizacin con lgG humana en animales hace nuestro esquema permiten realizar la determinacin
que se produzcan anticuerpos tanto contra las de IgG adecuadamente. Respecto a la especificidad
cadenas pesadas como contra las cadenas livianas. del antisuero incorporado en el gel, es importante
Sin embargo, algunas especies como el cobayo sealar los estudios de Reimer y Maddison (14),
tienden a responder ms contra las cadenas pesadas quienes inves tigaron casi 200 reactivos comerciales y
(Dr. Edgardo Moreno, comunicacin personal). En el encontraron que solamente uno de cada tres o cuatro
presente caso, a pesar de que el antisuero producido antisueros contra IgA o lgM era monoespecfico y que
no fue estrictamente monoespecfico contra lgG, su ms del 95 por ciento de los antisueros contra
contenido de anticuerpos contra cadenas livianas fue IgG precipitaban inapropiadamente con-
tan bajo (Fig. 3) que al diluirlo en el gel solamente
produjo un sistema de precipitacin. Una limita cin
de este mtodo de inmunizacin es que no 229
merciales (Fig. 5) esto no es un obstculo para su
implementacin siempre y cuando se establezca
valores de referencia con dichas placas. Los
resultados tambin mostraron que la reproducibilidad
de la determinacin es adecuada y similar a la que se
obtiene por el mtodo comer cial. En un interesante
estudio comparativo de cinco marcas de placas para
inmunodifusin radial comerciales, Hosty et al. (3)
demostraron que hay una amplia variabilidad de
resultados entre las distintas casas productoras. Al
determinar el contenido de lgG de una muestra del
suero de Referencia Internacional 95/69 con placas
de la casa Hyland, ICL Scientific, Kallestad, Me loy y
Behring, los res ultados variaron desde 63 hasta 102
UI/ml para un valor de dicho patrn de 95,3 UI/ml (3).
En conclusin, consideramos que el mtodo aqu
descrito para la produccin de placas de
inmunodifusin radial para la cuantificacin de IgG
srica es adecuado, simple y econmico y puede
servir de base para una futura produccin de dichas
placas en mayor escala, para uso en los laboratorios
del pas.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a los doctores Luis Cerdas y Jos


Mara Gutirrez por sus sugerencias en la elabo-
racin del manuscrito; a la Dra. Olga Arroyo por la
tra otras inmunoglobulinas. Los mismos autores preparacin del material fotogrfico; a todo el
sealan que al reevaluar unos aos despus la personal del Instituto Clodomiro Picado por su valiosa
especificidad de las placas de inmunodifusin radial colaboracin; a la Srta. Roco Monge por su
producidas por seis fabricantes comerciales, se excelente trabajo secretarial; y a la Vicerrectora de
encontr que tres de ellos eran monespecficas (14). Investigacin de la Universidad de Costa Rica por su
Otro aspecto importante sobre el suero anti -IgG apoyo econmico. En especial, agradecemos al Dr.
producido es que probablemente carece de an- Edgardo Moreno por su valiosa y desinteresada
ticuerpos contra determinantes antignicos nicos de colaboracin.
la IgG3, debido a que esta subclase no se une a la
protena A usada en el aislamiento (19). Al respecto ABSTRACT
debemos mencionar que la IgG3 de las muestras a
determinar constituye apenas deI 5 al 8 por ciento de A method for the preparation of radial immunodif-
la IgG total (14, 15) y adems puede ser reconocida fusion plates for the quantitation of hum an lgG is
antignicamente gracias a los epitopos compartidos described. It is based upon the following steps: (1)
con las otras subclases de cadenas gamma (20). La isolation of IgG from normal serum by affinity
mayora de los antisueros comerciales tienden a tener chromatography; (2) immunization of guinea pigs
ms anticuerpos contra lgG1 e IgG2 que contra IgG3 e using a short schedule to avoid response against light
IgG4 (14) debido a su abundancia relativa. Por otro chains; (3) assessment of antiserum specificity; (4)
lado, la produccin de suero anti -IgG con preparation of pIates and standardization of variables;
inmunoglobulina aislada de casos de mieloma and, (5) evaluation of the proposed method by a
mltiple tiene la desventaja de reaccionar contra una correlation analysis with a commercially-available
subclase particular ms que contra las otras (10), y el method utilized as reference.
uso de DEAE Sephadex para el aislamiento de IgG The correlation obtained was 0.93 (p<0.O1), in-
normal disminuye la presencia de IgG4 en el dicating that the method is adequate, providing a
inmungeno (10). basis for a future large-scale production.
La correlacin obtenida entre las placas preparadas y
las comerciales es estadsticamente sig nificativa
(p<0,01) y nos permite concluir que el mtodo en
estudio es aceptable para la cuantificacin de lgG.
Aunque es notorio que las placas preparadas
mostraron una tendencia a dar valores
ligeramente ms elevados que las co-

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