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FUNDAMENTOS DE
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA

Franklin Muoz Crdenas


2011 framunoz@starmedia.com
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Historia

1850 Runge
Anilinas (Colorantes) 1906 Mikhail 1941 Martn y Singe
Cromatografia-Papel Tswett Posibilidad terica
Fm: Solventes Pigmentos vegetales Fm: Gas
Fe: Papel Cromatografia-Colummna

1952 Martn y
1955 Primer CG 1954 Ray 1 Publicacin James
Realidad Experimental 1941

Chroma : Color
Graphein: Escribir
1955-1967 usos de otras 1960 SFC
Fases mviles JJ kirkalnd 1960
1987 se comercializa
auge-comercializacin

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Definicin IUPAC

Mtodo
Separacin fsica componentes
Muestra distribuye 2 fases

Migracin entre zonas

Fase Fase
Mvil Estacionari
a

Lquida
Gas Slida Lquida

Slido

Lq/gas
Gel
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Modalidades de Cromatografia

Naturaleza
Fase
Estacionaria Fenmeno en
Naturaleza
Columna
Fase mvil

L iq-Sol (LSC)
Gas : C. Gaseosa GC Liq-Liq (LLC)
Gas-Liq (GLC)
Lquido: C Lquida LC Gas-Sol (GSC) 1. Afinidad
Normal/Reversa
Capa Delgada TLC Ligada
Columna Abierta Intercambio Inico
HPLC *
2. Tamano molecular
Lquido/Gas :SFC
Permeacin por gel
Filtracin por gel

Cantidad Muestra
Aplicada

Analtica: Pg Ug
Semipreparativa: ug gramos
Preparativa: gramos-

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CG
HPLC
vS e p a r a : S u s t a n c i a s O r g n i c a s
Voltiles , NO Termolbiles, peso
molecular promedio (no alto )
vSepara: Orgnicos e inorgnicos
vLa fase el parmetro de separacin Voltiles o no, Termolbiles o no,

v20% pueden separarse sin previo vLa fm es el parmetro fundamental de


tratamiento la separacin.

vDetectores; Diferencian fm del analito, vDetectores; NO Diferencian fm del


la fm es inerte al detector analto, la fm no es inerte al detector.

vDestructivo no recupera muestra vNO Destructivo recupera muestra


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Inter.
Inico
IEC
Liq-
Sol
LSC

Formas
CL

Excl.
Liq-
Tamao
Liq
SEC
LLC

Fase
ligada
BPC

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Dnde est ? Qu se usa?

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Solventes
Es el verdadero motor y una gran diferencia con CG donde
el gas es solo Carrier del analito.

Propiedades de los solventes en HPLC

Alto poder solubilizante de las muestras


Baja reactividad
Compatibilidad con el detector utilizado
Adecuado punto de ebullicin y volatilidad
Baja viscosidad
Seguridad (salud)
Alto grado de pureza

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Preparacin fases mviles

Es necesario tener en cuenta;

1. Material volumtrico limpio


2. Fenmenos de contraccin de volmenes
3. Determinar uso del pH
4. Despus de preparada se debe filtrar y
desgasificar

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Se debe filtrar por:

Partculas de la fase mvil taponan y


desgastan los filtros tuberas sellos y
rotor del inyector

Se efecta con membranas de 0.45 o


0.22 um de poro que eliminan
partculas y bacterias

Se recomienda descartar los primeros


mililitros por arrastrar partculas de la
membrana

Las muestras a inyectar tambin se


deben filtrar.

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Se debe desgasificar por:

Liberacin de burbujas
bomba y celda del
detector

Eliminacin de oxigeno
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Mtodos de desgasificacin:

Se pueden emplear mtodos por Temperatura, Presin y


Afinidad.

Temperatura favorece o no la disolucin del gas en la


fase
N2 Disminuye en agua pero en Benceno aumenta.

Presin : Si Disminuye, se disminuye la disolucin


del gas

A finidad : Son ms solubles en donde predomine


fuerzas diferentes a las propias del gas.

Reflujo, Burbujeo gas inerte, Ultrasonido, Vaco

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Bomba

Funcin : Impulsar Fase mvil desde el Reservorio Inyector y la


columna

Caractersticas
Permitir caudal 0.1 a 10 mL/m
Generar presin hasta 6000 psi ( libras/pulgada )
Exactitud de caudal alto
Ruido Bajo ( Generacin de pulsos mnimos variacin de caudal)
Deriva Baja ( Ruido que se genera por el uso en un largo tiempo)
Sistema Corte: Poder parar cuando aumente o disminuya presin del
sistema

Material
Cuerpo en acero Inoxidable
Partes en contacto fase mvil : Zafiro, Rub, tefln , Acero
Se usa TITANIO cuando el acero es incompatible con muestras
biolgicas

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Clases Bombas

vPistn ( Reciprocantes )
Mayora equipos la poseen, las hay 1, 2, 3 pistones. Bomba Tanden.

Desplazamiento Continuo ( Jeringas )


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Porqu usar gradientes ?

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Permite : Introducir la muestra en solucin interrumpir el


caudal .

Inyectores
Caractersticas

Fcil de operar
Inerte
Soportar altas presiones 7000 psi
Preciso en la cantidad de muestra introducida
Soportar altas temperaturas ( para mantener en
solucin polietilenos )
Biocompatible con la muestra TITANIO
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Clases Inyectores

Septum: Elastmero (Cromatografa de gases )

Desprenden material
Perdida de presin
Necesario vencer la presin para inyectar
Necesita flujos altos
Poca reproducibilidad en la inyeccin

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Clases Inyectores

Vlvulas: Bucles de muestras


Cuerpo fijo con un rotor y loop (intercambiable 5 a 2000 uL)
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Vlvula

Vlvulas posee dos posiciones:

Posicin de llenado o carga : Fm pasa directo a la


columna Via Inyeccin a Presin atmosfrica
El loop se llena con 5 veces su capacidad
RDS=0.05%

Posicin de Inyeccin : Fm arrastra muestra del


loop y la lleva a la columna

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DUCTOS TUBERIA
Para: uniones entre la fase mvil bomba Inyector.

Caractersticas

1. Inerte
2. Resistencia a la presin (Indeformable) Acero Inoxidable (316-314),
Polmeros (Polipropileno-tefln)

Acero 316 Tefln


Mayor Presin Menor Presin
Bomba Inyector Reservorio Solvente - Bomba
Inyector Columna Frasco desperdicios.
Columna Detector
Entre detectores en serie.

Su dimetro externo es estndar 1/16 de pulgada


Su dimetro interior va desde 0.2 a 0.7 mm

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UNIONES
Permiten conectar las tuberas y los componentes
cromatogrficos

Caractersticas

Inertes a la fase Mvil


Cierre hermtico
Evitar volmenes muertos
Son dos piezas:

Macho Hembra
Frula + Tornillo Conector
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Columnas

Funcin : contribuir a la separacin de los


analitos de una muestra.

Caractersticas

Tubo de acero Inoxidable > 600 psi.


Tubo de vidrio < 600 psi
Diametro interno Uniforme

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Clases
1 Analticas 10 a 30cm

Las hay Rectas y helicoidales (se pierde eficiencia)


Dimetro interno 4 a 10 mm
Tamao partcula 5 a 10 um
Ms usadas 25cm - 4,6mm Dint Partcula 5um
3-7cm 1-4mm Dint Partcula 3um

2 Precolumnas

Aumento vida columna


Elimina material suspensin, contaminantes fase mvil y
sustancias que se unen irreversiblemente a la columna
Saturar fase mvil con fase estacionaria.

Rellenos Pelicular y Material poroso


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Detectores
Funcin : Ver y ubicar en el tiempo y espacio la posicin de
cada uno de los componentes a la salida de la columna.

Caractersticas

1. Sensible
2. Amplio rango dinmico de respuesta
3. No destruir la muestra
4. Estable a la temperatura
5. Respuesta lineal
6. Alta relacin seal /ruido
7. No contribuir al ensanchamiento de la seal (Banda
extracolumna)
8. Responder a todos los solutos
9. Constante de tiempo baja (Velocidad de respuesta rpida)

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Clasificacin

Generales Selectivos

* Miden propiedad fsica de la fm * Sensibles a propiedad del


Con y sin analto analto

Ej ndice de refraccin Ej UV- visible


Conductividad

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Detector ndice de refraccin

Funcin : Medir la diferencia de Indice de refraccin


entre Solvente puro y solvente con analito

Caractersticas:

Detector Universal porque :


improbable Ir soluto = Ir solvente
No destructivo
Poco sensible
Lo afecta la temperatura
No se pueden emplear series eluotrpicas

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Funcin : Medir la cantidad de luz que absorbe el soluto o


analito a una determinada longitud de onda

Caractersticas

Ms empleado.
Buena sensibilidad
Detector Ultravioleta - Visible
Buen rango lineal
No destructivo
Puede emplearse con gradientes eluotrpicos
Estable a cambios de caudal y temperatura
190-350 nm UV
Hasta 700nm Visible
Concentracin analito cumple la ley de Beer

A=a.b.c

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Detector Ultravioleta Visible Onda fija

Longitud de trabajo prefijada

Generalmente se emplea 254nm - Lmpara de Hg

214nm Lmpara de Zn
229nm Lmpara de Cd

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Onda Variable ( Espectrofotomtrico )

Longitud de mxima absorcin para el analito motivo


de estudio.

Lmpara de Deuterio o Xenn con filamento de


Wolframio

Arreglo de diodos

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Detector Ultravioleta - Visible

De luz dispersada tras evaporacin

Se evapora fase mvil


Formacin suspensin analto en un gas ( N o Aire )
Haz de luz laser
Medida dispersin del haz
Mide un fotodiodo de Silicio
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Electroqumico

Compuestos redox
1000 veces ms sensible que UV.
Necesita fases mviles conductivas
( Buffers dePO4 0.02M)
Electrodos de Au, C, Pt, Hg

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Bases de la Separacin
Serie de Interacciones de la MUESTRA Fase mvil y Fase
estacionaria

Hidrofbica
Hidroflica
Puentes de H2
Momentos dipolares
Cargas electrostticas

Todo ello define la afinidad por fm o fe

afinidad fm elucin ms rpida


afinidad fe elucin ms lenta

Cada analito crea su propio equilibrio diferente al otro ello permite


la separacin.

Si Un analito A necesita ms volumen de elucin por ende mayor


tiempo
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Cromatograma
Volumen de Elucin, de retencin total
Volumen muerto
Lnea base
Tiempo de retencin
Tiempo de retencin neto o relativo
Velocidad lineal ( u)
Factor de capacidad ( K ), Cte , coeficiente, razn de
distribucin (IUPAC)
Factor de separacin, de selectividad, de resolucin
Ancho de pico
Platos tericos, Altura plato terico
Asimetra
Resolucin
Eficiencia

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Procesos de ensanchamiento de banda

El ensanchamiento demuestra la distribucin de un analito desde el momento de la


inyeccin.

Porque se sucede el ensanchamiento?

Por las diluciones que sufre el analito a medida que atraviesa el sistema
cromatogrfico y por efectos extracolumnares.
Analitos menos retenidos producen picos ms angostos
El ensanchamiento depende de la eficiencia (N) Platos tericos y calidad de ellos

Ensanchamiento intramolecular

Segn Van Deemter las contribuciones son 4:


Proceso multipasos ( caminos mltiples)
Difusin Longitudinal
Resistencia a la transferencia de masa en la fase mvil
Resistencia a la transferencia a la fase estacionaria

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PROCESO MULTIPASO (A)

Difusin de EDDY y contribuye al ensanchamiento basado en el


Dimetro de la Partcula y por una constante del proceso de relleno y
calidad del empaquetamiento.

Este fenmeno es determinante cuando:

Tamao de partcula irregular


Columna mal empacada

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DIFUSION LONGITUDINAL
(B/U)

Difusin del analito en todas las direcciones de la fase mvil.

Este fenmeno es determinante cuando:

Viscosidad de la fase mvil baja


Flujo de la fase mvil lenta
Coeficiente de difusin del analito es alto

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RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE
MASA (C*U)

En la fase mvil
En la fase estacionaria

Este fenmeno es determinante cuando:

Flujos rpidos Porque entre menor volumen de flujo se efecta el


equilibrio fm= fe en ese menor volumen y por tanto se generan
picos ms pequeos

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Ensanchamiento Extracolumnar

En condiciones normales los ensanchamientos solo se producen por efectos


columnares

Se sucede por: Desajustes en Inyeccin Tuberas, uniones y detector

Como los analitos ms retenidos generan picos ms anchos que los menos
retenidos este fenmeno afecta mas a los picos menos retenidos que son ms
agudos (Se nota mas)

Tuberias: A medida que aumenta su longitud , dimetro


Inyeccin: Demasiado volumen inyectado
Detector : Volumen geometra y tubera de conexin asi como la
velocidad de respuesta si es lenta se pueden unir picos y ensancharse

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Material relleno columna

Bases de la Separacin

1. Morfologa: Esfrico o Irregular con tamao de 2 a 60 um de diametro

2. Porosidad: Relacin entre el volumen interno de los poros y el


volumen de la partcula

Poro: cavidades de mayor profundidad que dimetro, pueden ser abiertos o


cerrados

Area Superficial: Determina la capacidad de retencin de la fase


estacionaria

A menor dimetro del poro mayor rea superficial y mayor retencin

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Estructura Qumica

La columna se conforma por una estructura


interna y una externa ( responsable de los
procesos de retencin )

La estructura EXTERNA se constituye por


grupos activos

Naturales
Productos de modificacin inducida
Productos de modificacin permanente

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Estructura Qumica

La estructura INTERNA generalmente es SILICAGEL

Oxido de silicio hidratado


Slido amorfo y poroso de gran rea superficial( 30 a 500 )
Alto volumen de poro ( 0.4 a 1.2 mL/g) con un dimetro de 60 y 300 A
Es fuertemente higroscpico
La humedad bloquea y hace perder actividad
A 200C pierde agua y se condensan los grupos silinoles formando
puentes siloxanos volviendo la silica inactiva
Es insoluble en solventes apolares
Soluble en agua 100ppm a pH Neutro y Temp ambiente
La solubilidad aumenta con el pH (>7.5)
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Preparacin fase ligada

Silicagel , almina, agarosa, copolmeros, divinilbenceno +


Compuesto con grupo funcional determinado.

1. Tipo ester (Si-OR)


2. Tipo Amino (Si-NR2)
3. Tipo Carbono (Si-CR3)
4. Tipo Siloxano (Si-O-SiR3)

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Cromatografa Fase Reversa

Bases de la Separacin

Fase Estacionaria APOLAR


Fase mvil POLAR

VENTAJAS:
Compuestos ionicos , no ionicos e ionizables pueden separarse
en la misma columna, con la misma fase mvil
La fuerza de atraccin superficial es dbil
La adsorcin irreversible raramente ocurre
La fase mvil predominante es agua
El modificador orgnico es etanol o metanol
El orden de elucin es predecible en funcin hidrofobicidad
Los equilibrios del sistema se alcanzan rpido.
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Fase Mvil (Reversa)

Es un solvente polar

Mezcla de Agua y un modificador orgnico


Se pueden agregar aditivos, sales, Boffers
A mayor proporcin de modificador orgnico menor retencin
(Menor K)
A mayor cantidad de agua Mayor retencin ( Mayor K)
Los solventes de mayor uso son:
Agua
Metano
Acetonitrilo Por Transparencia al UV y Viscocidad
Tetrahidrofurano

La selectividad es dada por los modificadores orgnicos

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Fase Mvil(Reversa)

AGUA Es el carrier.

METANOL Modificador Orgnico ms utilizado por

Alto poder disolvente de sales y reactivos de apareamiento ionico


Poco txico , fcil adquisicin y purificacin
Bajo costo

DESVENTAJA Avido por el Oxigeno y genera mayor presin que los otros solventes

ACETONITRILO

Se almacena en el oscuro y bien cerrado por ser higroscpico


Ideal para longitudes de onda cortas 190nm
Solvente caro

TETRAHIDROFURANO

Forma facilmente peroxidos y se comercializa con antioxidantes que absorben al UV

DIOXANO Muy viscoso se usa en pocas proporciones

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Mecanismo de Retencin Fase Reversa

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Mecanismo de Retencin Fase


Reversa
Puede ser de 3 tipos

Particin entre fase mvil y estacionaria


Adsorcin sobre la fase estacionaria
Proceso mixto Particin- adsorcin

Teora Solvofbica: fuerzas intrasolvente ms fuertes que las generadas con el soluto obligando
al soluto a interactuar con la fase estacionaria

ACCION DE LA CADENA CARBONADA ( FASE LIGADA )

La ms empleada son cadenas alquilicas de 18 y 8 carbonos respectivamente


A mayor longitud de la cadena ms retencin
A mayor cobertura mayor retencin
A mayor hidrofobicidaad del soluto mayor retencin.
Ir de c1 a c22 la retencin aumenta 10 veces. 10% de modificador orgnico reduce la
retencin en 2 a 3 veces por tanto la fase mvil sobre la selectividad afecta ms que
la fase estacionaria.
Cadenas cortas producen picos ms simtricos ( por menor tiempo de retencin)
Ensanchamientos intracolumnnares y porque los silinoles libres interaccionan con la
fase mvil permitiendo equilibrios ms rpidos

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Formas de cromatografa en fase reversa

1. Regular o de particin Simple La fase mvil son mezclas de agua y un modificador


orgnico ( hasta cuaternarias)
La retencin la gobierna la hidrofobicidad del soluto a Mayor polaridad menor retencin
( Fase mvil Polar)

A mayor proporcin de agua mayor retencin


A mayor proporcin de modificador menor retencin
Fuerza elutiva decrece asi THC> AcN> MeOH> AGUA

2 Control de ionizacin ( Supresin Inica )


Los solutos ionizables dan picos con baja retencin y baja simetra fenmeno que no se
corrige con un modificador orgnico;

3. De apareamiento ionico

4. Complejacin con iones metlicos Argentacin de la silicagel ( Cu, Cd, Ni, Zn. Ag )
Excelente para resolucin de isomeros geomtricos ( cis- Trans)

5. En medio no acuoso ( para aceites, grasas, Hidrocarburos )


Con solventes de muy baja polaridad pero polares frente a la fase estacionaria

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Cromatografa Fase Normal

Fase Estacionaria POLAR


Fase mvil APOLAR

VENTAJAS :

Unico modo en HPLC que permite separar ismeros


posicionales con sustituyenyes polares.

MATERIALES DE RELLENO

Silica Proceso de adsorcin gobernado por los grupos


silinol ( vecinal ,geminal y aislado ) formando ptes de
hidrogeno.
Alumina carcter bsico
Fase ligada

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Fase Mvil ( Normal )

Es un solvente apolar

Mezcla solventes
Se pueden agregar aditivos que actuan sobre sitios de fuerte
retencines causantes de irregularidades en la fase estacionaria
(Agua o solvente altamente polar)

A mayor proporcin de modificador menor retencin


(Menor K) aumentar la fuerza eluotropica del solvente en 0.05
disminuye k en 3 a 4 unidades
A mayor cantidad de agua menor retencin ( Menor K)

CUIDADO silica soluble en agua

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Mecanismo de Retencin Fase


Normal

Competencia fase mvil - Superficie adsorbente


Competencia analito - Superficie adsorbente

Interacciones dipolo- dipolo


Puentes de hidrogeno
Transferencias de carga
Formacin de complejos Pi

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Cromatografa Intercambio Inico

Fase Estacionaria GRUPOS FUNCIONALES IONICOS


Fase mvil SOLUCION ACUOSA DE pH

CLASES :

Aninica
Cationica

UTILIDAD

Solutos ionicos, ionizables y neutros con capacidad de


formar complejos ionicos. Generalmente Acidos, Bases y sus
sales

Esta cromatografia ha sido desplazada por cromatografia en


fase reversa ( Apareamiento ionico, Supresin ionica)

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Mecanismo de Retencin
Intercambio Inico

Reacciones irreversibles entre soluto y fase estacionaria


Distribucin del soluto entre fase estacionaria y fase mvil
Competencia analito- Superficie adsorbente.

Ph = Pka forma ionica y no ionica coexistes 50%


Ph+2UNIDADES por encima del Pka 99% ionizado
Ph-2 UNIDADES por debajo del Pka 99% no ionizado por tanto
se pueden emplear modificadores organicos en este caso

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Material relleno columna

Polmeros orgnicos
Intercambiadores fase ligada
Oxidos inorgnicos
Intercambiadores peliculares

Fase Mvil
Es un solucin acuosa de pH y fuerza ionica controlada por un
buffer.

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Cromatografa Exclusin

Fase Estacionaria GELES BLANDOS, RIGIDOS


Fase mvil SOLVENTES Y AGUA

CLASES :

De filtracin por gel (Hidrosolubles)


De permeacion por gel ( Insolubles en agua )

UTILIDAD
Solutos de peso mayor a 2000 que presentan
problemas en otros metodos

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Caractersticas Generales

Picos angostos (por Volumen elucin pequeo)


Tiempo de separacin cortos
Orden elucin predecible (por tamao)
No hay perdida de muestra

La resolucin no puede manipularse (Diferencia peso 10%)


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Mecanismo de Retencin Exclusin

Tamao efectivo en solucin (Dimensin molecular)

Exclusin esterica
Mayor peso mayor tiempo
Menor tamao mayor tiempo

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