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Isla de patogenicidad de
Vibrio parahaemolyticus en cepas
chilenas clnicas y ambientales
Harold Neza, Mara Teresa Ulloaa, Fabiola Guerrab,
Carlos G Osorio.
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ISLA DE PATOGENICIDAD DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN CEPAS CHILENAS - H Nez et al
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aTodoslos partidores usados en este trabajo se disearon en base al genoma de la cepa pandmica V.
parahaemolyticus RIMD2210633 obtenido desde el sitio TIGR.
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cepa como templado. El ADN genmico se obtuvo El tamao de los dos fragmentos de hibridacin
usando el kit de purificacin de ADN genmico esperados en estas condiciones para las cepas
DNeasy Tissue (Qiagen). Cada amplificacin se toxignicas es de 1,1 y 4,3 kpb. La sonda de ADN
realiz de acuerdo al siguiente protocolo de hot utilizada fue dirigida para la regin comn de 381
start: primero la mezcla se calent a 96C por 3 pb de los genes tdhA y tdhS y fue sintetizada con el
min y luego se agreg la enzima Taq polimerasa par de partidores tdhAf-tdhAr (ver Tabla 1). Luego
(Invitrogen). Posteriormente se aplicaron 30 ciclos la sonda fue marcada con el istopo 32P utilizando
de amplificacin, consistiendo cada uno de ellos el kit Megaprime DNA Labeling System (Amersham
en: 30 s a 95C, 30 s a 55-60C y 1 min a 72C Bioscience). Las placas fueron expuestas por 2 h y
(rango: 1-7 min, dependiendo del tamao del luego ledas con un equipo PhosphoImager (Bio-
producto esperado). Los amplicones fueron separa- Rad).
dos por electroforesis en geles de agarosa a 1,5% y
visualizados con bromuro de etidio. Los amplico-
nes que fueron sometidos a secuenciacin fueron RESULTADOS
purificados usando el kit QIAquick Gel Extraction
(Qiagen). Del total de 38 cepas clnicas estudiadas todas
resultaron ser toxignicas en base a la presencia
Ensayos de Southern blot. Los ensayos de Southern de los genes tdhA y tdhS y a la capacidad
blot fueron realizados de acuerdo a Sambrock et al, hemoltica evidenciada en agar Wagatsuma (fen-
198910. El ADN genmico fue purificado usando el meno de Kanagawa). Por otra parte, las 66 cepas
kit de purificacin DNeasy Tissue (Qiagen) y ambientales estudiadas fueron del tipo no toxig-
luego digerido con la enzima de restriccin EcoRI. nicas y no hemolticas (ver Tabla 2).
*Todos los resultados se expresan como N de cepas positivas/N total de cepas estudiadas
Deteccin por PCR del gen tdhA usando el par de partidores tdhAf/tdhAr
Southern blot usando una sonda radioactiva de 300 pb para los genes tdhA and tdhS
Fenmeno de Kanagawa en placas de agar Wagatsuma
Deteccin por PCR de extremos de isla de patogenicidad usando los pares de partidores VPA1304f-
VPA1308r y VPA1397f-VPA1400r
Deteccin por PCR de segmento de 1 kbp amplificado con par de partidores FABI5-vpa1397r
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Las reacciones de PCR para las cepas clnicas mencionado. La zona central del alineamiento de
fueron positivas para los marcadores tdhA, seg- estas secuencias se muestra en la Figura 2. Este
mento VPA1304f-VPA1308r (extremo 5 de la IPA) resultado confirma que las cepas secuenciadas
y segmento VPA1397f-VPA1400r (extremo 3 de la carecen completamente de la regin de 80 kpb
IPA) y marcadores tdhA1, VPA1355, VPA1380 entre los genes VPA1309 y VPA1397.
(datos no mostrados), consistente con su estrecha
relacin gentica con la cepa pandmica
RIMD221063311. En concordancia con los resulta- DISCUSIN
dos anteriores, el ensayo de Southern-blot con la
sonda radioactiva de ADN para los genes tdhA y Los resultados obtenidos en este trabajo demues-
tdhS determin la presencia de dos bandas de un tran que gran parte de las cepas ambientales
tamao esperado de 1,1 y 4,3 kpb (datos no carecen de la regin central de la IPA, conservan-
mostrados). En claro contraste, la mayora de las do sus extremos 5 y 3 intactos (segmentos
cepas ambientales (53/66, aproximadamente 80%) VPA1304-VPA1308 y VPA1397-VPA1400, respecti-
fueron negativas para los marcadores internos de vamente). Los resultados de PCR se complemen-
la IPA (e.g., tdh, VPA1355, VPA1380) y no demos- tan perfectamente con los resultados de la
traron bandas de hibridacin en los ensayos de secuenciacin, indicando especficamente que el
Southern-blot. Sin embargo, es destacable que segmento gentico que se extiende desde el gen
estas cepas fueron positivas por PCR para los VPA1309 al gen VPA1396, abarcando una exten-
extremos 5 y 3 de la IPA. Desde estas cepas se sin de casi 80 kpb y aproximadamente 86 genes
amplific adems un producto de 1 kpb con el putativos (segmento VPA1310-VPA1396), no se
par de partidores FABI5-VPA1397r (Tabla 2). Es encuentra presente en la mayora de las cepas
importante destacar aqu que el partidor FABI5 se ambientales. Por otra parte, estudios previos de
encuentra dentro del marco de lectura abierto PFGE (Hormazbal, J.C., resultados no publica-
VPA1309 (Figura 1A y 1B). Basndose en estos dos) indican que las cepas ambientales estudiadas
resultados y en informacin previa sobre los presentan una amplia diversidad gentica. Esto
perfiles de campo pulsado de las cepas ambienta- indica que la ausencia de la IPA en las cepas
les estudiadas en este trabajo (Hormazbal, J.C., ambientales es un fenmeno extendido y que no
resultados no publicados), se seleccionaron 3 se debe a un sesgo del muestreo. Apoya esta
cepas ambientales de perfiles claramente distantes interpretacin, el hecho que el conjunto de cepas
para secuenciar el amplicn de 1 kpb arriba ambientales presenta una amplia distribucin res-
Figura 2. Alineamiento de secuencias obtenidas con el par de partidores FABI5-VPA1397r desde cepas
ambientales no toxignicas de V parahaemolyticus. Se amplific por PCR con los partidores FABI5 y 1397r y
luego se secuenci el fragmento obtenido (el alineamiento se realiz con el programa CLUSTALW). A, B y C:
secuencias obtenidas para las cepas ambientales A3, A5 y A7, respectivamente; RIMD: secuencia de la cepa
pandmica RIMD2210633 de V parahaemolyticus. Los rectngulos indican las regiones ro abajo y ro arriba de
los genes VPA1309 y VPA1397, respectivamente. Los asteriscos indican residuos nucleotdicos idnticos a la
cepa RIMD2210633. Se debe destacar que slo se muestra la regin central del alineamiento.
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pecto al lugar geogrfico (Ej: Antofagasta, Con- nidos. Estos complementan perfectamente estu-
cepcin y Puerto Montt) y la fecha de su recolec- dios previos que mostraban que la mayora de las
cin (1998-2007). Por otra parte, nuestros cepas ambientales de V parahaemolyticus son del
resultados no permiten inferir la integridad de la tipo no patognico4-6, estableciendo una base
IPA en las cepas clnicas estudiadas, debido a que gentica para dicha observacin que no haba
en ellas lo nico que es posible observar es la sido descrita previamente en la literatura. Durante
presencia de los genes tdhA, tdhS, VPA1355 y la preparacin de este manuscrito, el grupo de
VPA1380, y la ausencia del amplicn esperado de Honda et al12,13 report que la mayora de las
1 kpb generado con el par FABI5-VPA1397r. Es cepas ambientales estudiadas por ellos carece de
posible que existan pequeas o medianas delecio- la regin central de la IPA (conservando sus
nes en la IPA de estas cepas y que no sean extremos), lo que concuerda plenamente con
detectadas mediante esta estrategia. Destaca que nuestros resultados y establece la necesidad de
los extremos de la IPA se encuentren presentes redefinir los bordes o lmites de esta estructura.
tanto en cepas clnicas como en cepas ambienta- Por otra parte, los resultados obtenidos nos llevan
les. Ello plantea la posibilidad de que los extre- a plantear la posibilidad que la IPA de V parahae-
mos de la IPA estn mal definidos. Lo que en este molyticus pueda transferirse horizontalmente en-
trabajo denominamos extremos 5 y 3 de la IPA tre cepas toxignicas y ambientales no
pudieran corresponder ms bien a las regiones 5 toxignicas, pudiendo as surgir nuevas variantes
y 3 adyacentes a la IPA propiamente tal. Esta con diferente potencial patognico14.
indeterminacin se debe, al menos en parte, a que
la IPA de V parahaemolyticus no est inserta en
un gen de tARN y no presenta secuencias repeti- Agradecimientos
das directas claramente identificables en sus mr- A los Drs. Romilio Espejo, del INTA (Universidad de
genes8. Los resultados de este trabajo favorecen la Chile) y Juan Carlos Hormazbal, del Instituto de Salud
interpretacin de que la IPA est ausente en cepas Pblica por proveernos de gran parte de las cepas
ambientales y que sus extremos deben ser redefi- utilizadas en este trabajo.
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Laboratory Press, 1989. 13. SUGIYAMA T, IIDA T, IZUTSU K, PARK KS, HONDA T.
11. GONZALEZ-ESCALONA N, CACHICAS V, ACEVEDO C, RIOSECO Precise region and the character of the pathogenicity
ML, VERGARA JA, CABELLO F, ROMERO J ET AL. Vibrio island in clinical Vibrio parahaemolyticus strains. J
parahaemolyticus diarrhea, Chile, 1998 and 2004. Bacteriol 2008; 190: 1835-7.
Emerg Infect Dis 2005; 11: 129-31. 14. LESIC B, CARNIEL E. Horizontal Transfer of the High-
12. IZUTSU K, KUROKAWA K, TASHIRO K, BUHARA S, HAYASHI T, Pathogenicity Island of Yersinia pseudotuberculosis.
HONDA T ET AL. Comparative genomic analysis using J Bacteriol 2005; 187: 3352-8.
microarray demonstrates a strong correlation bet- 15. SUTHIENKUL O, ISHIBASHI M, IIDA T, NETTIP N, SUPAVEJ S,
ween the presence of the 80-kilobase pathogenicity EAMPOKALAP B ET AL. Urease production correlates
island and pathogenicity in Kanagawa phenome- with possession of the trh gene in Vibrio parahae-
non-positive Vibrio parahaemolyticus strains. Infect molyticus strains isolated in Thailand. J Infect Dis
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