Pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes

enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasas,
coagulasas, decarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc) involucradas en el metabolismo
bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que contienen los substratos
(DNA, hidratos de carbono, aminocidos, etc) sobre los cuales ellas actan, junto con un sistema
indicador que va a poner de manifiesto la degradacin del substrato o la presencia de un
metabolito especfico (cido frmico, cido lctico, cido succnico, indol, etc). Las pruebas
bioqumicas tambin evalan: la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a frrico), la presencia
o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o no de hemolisinas, el requerimiento
o no de algunos factores especiales (protenas sricas), la produccin o no de algunas toxinas con
capacidad virulenta (toxina diftrica, toxina botulnica, etc).

AGAR TSI: siembre el agar TSI haciendo una puncin central hasta el fondo del tubo y estra en
superficie.

Principio: en TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de

carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con produccin o no de gases (CO2 y H2), junto con
la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).

Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se lee un quebrado, la reaccin

ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin
ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia) La acidez se
denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo)

Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:

Fermentacin de la glucosa (K/A).

Fermentacin de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A)

No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de carbono,

produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio. Algunas bacterias no
fermentadoras solamente atacan la peptona aerbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay
cambio en el fondo del tubo.

Produccin de gas: ruptura del medio.

Produccin de H2S:ennegrecimiento del medio

El agar TSI tiene tres azcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) y sacarosa (10 g/L). Como indicador
de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en
presencia de alcalinidad.

Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan
producir H2S y como indicador de H2S, SULFATO FERROSO el cual reacciona con el H2S
produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S, se
requiere de un medio cido por lo que dicha produccin generalmente est limitada al fondo del
medio, razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido), aunque el color amarillo
usual est tapado por el color negro.

AGAR LIA

Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para atacar el aminocido

LISINA descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de glucosa, la produccin o no de
gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).

Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es necesario) a 37C. Se

lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte
aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte
anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K
(color prpura).

Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:

a- Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminocido solo fermenta la glucosa.

b- Descarboxilacin de la lisina: (K/K)

c- Desaminacin de la lisina: R/A) rojo/ amarillo

d- Produccin de gas: ruptura del medio

e- Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio

El indicador del PH del medio es PRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color
amarillo y en alcalinidad al color prpura. Por contener pequea cantidad de Glucosa (1 g/ L) al ser
fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.

Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminocido lisina, con liberacin de
aminas de reaccin alcalina y con produccin de CO2. Para que acten las descarboxilasas se
requiere PH cido que se obtiene por la fermentacin de la glucosa que tiene el medio. La
desaminacin de la lisina es un proceso oxidativo que se manifiesta por la aparicin de color rojo
en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por fermentacin de la glucosa que posee el
medio. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias
puedan producir H2S y como indicador H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con
el H2S produciendo un precipitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S
se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin generalmente est limitada al fondo
del medio, razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido), aunque el color amarillo
usual est tapado por color negro.

AGAR CITRATO DE SIMMONS:

Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un microorganismo de

emplear el citrato como nica fuente de carbono en ausencia de fermentacin de azcares o de
produccin de cido lctico.

Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas s es necesario) a 37C.

Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo

con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene
tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como nica fuente
de carbono tambin es capaz de utilizar las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las
sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH) con la consiguiente alcalinidad del medio.

El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul

indicando que la prueba es POSITIVA. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la
prueba es NEGATIVA. Si no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

AGAR UREA

Principio: en agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y

desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco. + +d - 5 Lectura. Se efecta despus de 18
a 24 horas de incubacin a 37C.

Fundamento: El sustrato urea es una diamina del cido carbnico, denominada carbamida. Todas
las amidas (RCO- NH2) son rpidamente hidrolizadas. La hidrlisis de la urea es catalizada por una
enzima especfica que es la ureasa es una enzima microbiana importante, relacionada con la
descomposicin de los compuestos orgnicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas
o constitutivas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria
solamente cuando se encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una enzima
constitutiva ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. El
indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba
POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.
AGAR SIM

Principio: EN AGAR SIM se determina la capacidad e un microorganismo de moverse (presencia e

flagelos), de producir INDOL y H2S.

Lectura: Se efecta de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de reactivo de

ERLICH.

Fundamento: el INDOL es uno de los productos del metabolismo del aminodico

TRIPTOFANO. Las bacterias que poseen la enzima TRIPTOFANASA son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El indol se puede
detectar en un medio adecuado observando el desarrollo de un color rojo despus de agregar el
reactivo de Erlich o de Kovacs indicando una prueba POSITIVA, debido a que el indol reacciona con
el grupo aldehdo del p- dimetilaminobenzaldehido. Si el color es amarillo indica una prueba
NEGATIVA. EL SIM es un medio semislido sin hidratos de carbono que inhiban la produccin de
H2S y tiene TIOSULFATO DE SODIO fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como indicador de HS,
lo que lo hace ms sensible en la deteccin de H2S por produccin de un precipitado negro de
sulfuro ferroso.

La MOVILIDAD BACTERIANA es otra caracterstica importante en la identificacin final de especie,

se realiza en medios semislidos como el SIM, debindose leer antes que la prueba de indol
porque al agregar el reactivo de Erlich sta se puede enmascarar. La prueba de motilidad se
interpreta realizando un cuidadoso examen macroscpico del medio para observar una zona de
desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin.

DILUCIONES Y CONCENTRACIONES. MUESTRAS LQUIDAS Y SLIDAS

Es un hecho que en la mayora de los ambientes, la densidad microbiana suele ser demasiado
elevada o baja para poder realizar una siembra directa de la muestra que de buenos resultados en
la enumeracin de microorganismos. Esta situacin hace necesaria la dilucin o la concentracin
de la muestra previa a la realizacin de cualquier estudio. Adems, las muestras slidas requieren
su dilucin para facilitar la manipulacin y permitir trabajar con ellas como si fueran muestras
lquidas.

En la mayora de los casos, se trabaja con diluciones decimales. El caso ms sencillo es la

preparacin de 10 ml de la dilucin 1/10 de la muestra. Para ello, se aade 1 ml de muestra a 9 ml
de diluyente; es decir de cada 10 ml de esta dilucin 1/10, 1 ml corresponde a la muestra.

Banco de diluciones
Esta tcnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y adems el recuento de los
microorganismos que tenemos en el cultivo inicial.

Se trabaja con cinco tubos con suero fisiolgico estril, uno de ellos con 10 ml y el resto con 9 ml,
en el orden que se muestra en la figura. Mediante una pipeta estril tomar 1 ml del cultivo mixto y
depositarlo en el primer tubo. Agitar hasta conseguir una suspensin homognea. Tomar otra
pipeta estril y de este primer tubo transferir 0,1 ml al segundo tubo, agitar y repetir la operacin
transfiriendo 1ml del segundo al tercer tubo, del tercero al cuarto y del cuarto al quinto.

Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar de los tres ltimos tubos
(diluciones 104, 105 y 106) 0,1 ml en placas de agar nutritivo, mediante la tcnica de siembra por
extensin (ver video). Se depositan los 100 microlitros en la superficie del agar y se debe extender
la muestra en toda la superficie del mismo, utilizando para ello el asa de vidrio.

Para esterilizar el asa de vidrio, en primer lugar se introduce en alcohol y se flamea encendindola
con la llama del mechero bunsen. Dejar que se consuma la llama y abriendo la placa lo justo para
introducir el asa, extender la muestra arrastrndola con la base del tringulo por toda la superficie
del medio hasta que ste absorba toda el agua. Incubar a 37C durante 24 horas y realizar el
recuento de las colonias calculando la concentracin de clulas en el tubo inicial mediante la
frmula:

ufc / ml = N x D x 10

Dnde:

ufc = unidades formadoras de colonias

D = dilucin

N = n de colonias
Pruebas Microbiolgicas para E. coli

La mayora de los microorganismos pueden cultivarse sobre substratos nutritivos para el estudio
de sus propiedades o para la utilizacin de ciertas propiedades en condiciones controladas. La
proliferacin de bacterias es el resultado de una interaccin compleja de diferentes sustancias
alimenticias y principios activos dnde intervienen factores fsicos como: temperatura, pH, el
factor redox entre otras.

Al momento de tener una muestra en donde se desee identificar la presencia de E. coli hay que
definir que medios de cultivo son selectivos para enterobacterias. Los medios selectivos son muy
utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de reas que poseen una flora
abundante.

Los medios selectivos incorporan sustancias inhibidoras de la propagacin de un grupo bacteriano

que no sea de inters pero en cambio permite el crecimiento de otros grupos.

Para microorganismos entricos, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes
e ingredientes que inhiben los organismos gram positivos y permite la propagacin de los bacilos
entricos Gram negativos.

Otra tipos de medio que es una gran herramienta a la hora de la identificacin de

microorganismos entricos como la E. coli son los medios diferenciales que poseen componentes
qumicos e indicadores que permiten identificar con cierta facilidad algunos gneros o especies
bacterianas por el aspecto caracterstico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son
tambin diferenciales por ejemplo podemos mencionar:

Agar Salmonella Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa

como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa positivas,
como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.
Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa de las
especies no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias amarillas.
Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la
lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciacin de especies
fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias
que varan del prpura a verde metlico.