Biotecnologa Agroindustrial

Biotecnolog
Cin tica de crecimiento microbiano
Cin

Dr.. Ing. Waldir D. Estela Escalante, MSc, PhD

Dr

Crecimiento celular en sistemas de fermentacin

Procesos discontinuos (Ba tch)

La f ormacin ef iciente de producto tiene lugar slo d urante un a

f raccin del ciclo de f ermentacin.

Cultivo batch
Xinicial
Sinicial
dV/dt = 0
dV/dt: variacin del volumen

Ciclo de fermentacin

Formacin de
producto eficaz

Recoleccin del producto

Lavado del fer mentador
Formacin de lotes
Esterilizacin
Producto

Inoculaci n Inoculaci n

Proceso de cultiv o batch

1

Sistema cerrado excepto par a la aireaci n.

Se aad e oxgeno en f orma de aire, un agente antiesp umante y

cidos o bases para controlar el pH.

Fase
Log del nmero de clulas

estacionaria
Fase de
muerte
Fase
logartm ica

Fase de
latencia

tiempo

Fas es de cr eci mi ento de un c ulti vo micr obiano dis c ontinuo

Fas e de latencia

Condicin f isiolgica del inculo es crucial en la lon gitud de la f ase

de latencia.

Si el inculo es tomado de un cultiv o en el que se ha detenido el

crecimiento debid o a una limitacin de substrato necesita ms
tiempo para ad aptarse a la nuev a solucin de nutrientes.

La concentracin de l inculo tiene tambi n inf luencia en la f ase de

latencia.

Fase logartmica

El crecimiento celular pu ede describi rse cuantitativ amente en

f uncin de la duplicacin del nme ro de clul as por unida d de
tiempo (lev aduras y bacterias) o por duplicacin d e la biomasa por
unidad d e tiempo (org anismos f ilamentosos como estreptomicetos
y hongos).

La v elocidad de crecimiento en la f ase logartmica es independiente

de la concentracin de substrato en tanto que exista exceso.

La concentracin elev ada de azcar puede inhibir el crecimiento

debido a los ef ectos osmticos que af ectan ms a las bacterias que a
los hongos.

La v ariacin del crecimiento es igual:

dx = creci miento muerte o lisi s

dt

dx
= .X X
dt

dx
: vari aci n de l a biomasa, vel oc . de aumento de biomasa,
dt vel oc . de cr eci mi ento

2

El crecimiento se mide en funcin al incremento de la masa celular
segn la ecuacin:

dx/dt = X X

Donde: X = concentraci n de masa c el ular s ec a ( mg/ml)

t = ti empo de c ulti vo (h)
= vel oci dad es pecfic a de cr eci mi ento ( 1/h)
= vel oci dad es pecfic a de lisi s c el ular (1/h)

Si l a c onc . de nutri entes y l as condici ones de cr eci mi ento s on

favor ables, entonc es >>> :

As ; X = 0
dx/dt = X

Integrando d esde Xo (conc. a tiempo cero) y Xt (conc. a un interv alo

de tiempo) y ordenando se tiene:

Ln Xt = Ln Xo + .t

Si, t = t d ; tiempo para que se dupli que la biom asa, entonces Xt = 2 Xo

Ln 2Xo = Ln Xo + .t d
Entonces:

Ln 2
td =

Factores que influyen en la velocidad de crecimiento

 Tipo de c l ul a micr obi ana

 Tiempos de duplic aci n de l as cl ul as ani mal es y veg etal es son mayor es

que los de l os mohos y l as levadur as y es tos s on mayor es al de las
bacteri as

 Condici ones medio ambi ental es fsic as y qumic as :

Efecto de l a temper atur a:

-Ea/RT
= A e
D onde:
= vel oci dad de cr eci mi ento es pec fic o ( 1/h)
A = c ons tante de Arr heni us
Ea = energa de ac ti vaci n ( kc al /mol)
R = c onstante uni vers al de l os g as es
T = temper atur a abs ol uta

3
 Ef ecto del pH

Inf luy e en la activ idad enzimtica, se distingen m.o acidf ilos,

neutrf ilos y alcalinf ilos.

Ef ecto de la activ idad de agua o de la humeda d relativ a

Las bacterias necesitan una A w 0.95, los mohos puede n crecer

a activ idades de agua men ores, de hasta 0.7 como mximo.

Ef ecto de la concentracin de nutrientes

La v elocidad de crecimiento especf ico () para un substrato

limitante puede escribi rse por la ecuacin d e Mo nod.

Ecuacin de Mon od:

S
= max
Ks + S

Donde:

= vel oci dad es pecfic a de cr eci mi ento ( 1/h)

max= vel oci dad especfi ca mxi ma de cr eci mi ento (1/h) .
S = c onc entr aci n de s ubstr ato li mitante
Ks = cons tante de s atur aci n es pecfic o para c ada s ubstr ato ( mg /L) ,
equi val e a l a c oncentracin del substr ato c uando = 0,5 max

Canti dad mxi ma de sustr ato q ue no provoc a s atur aci n al

micr oorganis mo y q ue hasta dic ha c oncentracin no pr ovoc a
ni ngn cambi o metablic o.

Velocidad de crecimiento
especfico (1/h)

max

= max/2 Crecimiento a
Disminucin de , cercano a m a x ,
concentracin crtica concentracin de
sustrato lim itante
de sustrato limitante
no crtica

0 Ks
S: Concentracin de sustrato limitante (g/L)

Influencia de la concentracin de substrato limitante en la velocidad de

crecimiento especfico

4

Si hay exceso de todos los substratos, entonces = max y el
cultiv o est en la f ase logartmica a max.

Si se agota un substrato y est presente todava otro substrato

puede existir una segu nda f ase logartmica durante el
metabolismo de ste segund o substrato con un segunda .

Las v elocidades especf icas mximas de crecimiento (max) son

de considera ble importa ncia en la industria.

El v alor de max depende d el m.o y de las condiciones de

f ermentacin. Las v elocidades especf icas de crecimiento () en
los m.o v aran entre 0.090 0.61 1/h.

Constante de saturacin (Ks) para un sustrato limitante

Sustr ato li mi tante: fuente de c arbono, nitr g eno, s al es, etc .

Concentracin del
sustrato limitante
0 (mg/l)
S

Ks mg /l 10Ks
Proximidad a fase Cambio en la actividad
estacionaria metablica
0 max 0

Ks , r epr es enta l a c onc entracin crti ca del s ustr ato li mitante en el medi o

Si; S s e ac erc a a Ks , entonc es l a fas e es tacionari a est pr xi ma a c omenz ar

Los v alores para Ks son generalmente muy bajos; en Escherichia

coli se han medido par a la glucosa v alores de Ks = 1.0 mg/L y
para triptf ano Ks = 1.1mg/L.

En f ermentaciones normales discontinuas dur ante la f ase

logartmica no se obtienen niv eles de substrato equiv alentes a los
v alores de Ks.

Los v alores tpicos de Ks para div ersas f uentes de carbono estn

comprendi dos entre 1 y 10 mg/L.

Las clulas puede n crecer a v elocidades prximas a max

cuando la f uente de carbono limitante no es may or que 10Ks 10
100 mg/L.

A may or concentracin de sustrato limitante (> 10Ks), puede

presentarse un cambio e n la activ idad metablica del m.o,
inhibici n del crecimiento por el sustrato.

5
 Ren dimiento d e b io masa

La c anti dad de mas a cel ul ar total for mada dur ante el cr eci mi ento c elul ar
es frec uentemente pr oporcional a la c anti dad de s ubstr ato cons umi do.

Xf Xo = Yx/s (So Sf)

Yx/s : C oefici ente de r endi mi ento de bi omas a por s us trato c ons umi do
So: Conc entr aci n de s ustr ato i nici al
Sf: C onc entracin de s ustr ato resi dual en el tiempo t
Xo: Conc entr aci n de bi omas a i nici al
Xf: Concentr aci n de bi omas a pr oduci da en el ti empo t

Xf Xo Biomasa producida (g)

Y x/s = =
So - Sf Substrato consumido (g)

Productividad total y productividad mxima

Productividad
mxima
Productividad

Productividad
total
Terminaci n

Formacin de
producto

Fase de latencia Fase de producc in Tiempo h

Limp ieza
Llenado

Para eval uar l a ec onoma de un pr oc es o deben s er c onsi derados

fac tores como: ti empo de pr oducci n, ti empo r eq ueri do para li mpi ar y
poner a punto el bi orr eactor, tiempo de esteriliz aci n y l a dur aci n de l a
fas e de latencia.

Fase estacionaria

La v elocidad de crecimiento celular esta en equi librio con la

v elocidad de lisis celular, la biomasa permanece constante.

Debido a la lisis se liberan nu ev os substratos (carbohidratos,

protenas) que sirv en como f uentes de energa para el crecimie nto
lento de los superv iv ientes.

Los distintos metabolitos f ormados en la f ase estacionaria son

f recuentemente de gran inters biotecnol gico.

6
Fase de muerte

En esta f ase las reserv as de energa de las clulas se agotan. Las

clulas mueren a un a v elocidad exponencia l.

En los procesos comerciales, la f ermentacin f recuentemente se

interrumpe al f inal de la f ase logartmica o antes de que comience
la f ase de muerte.

Cultiv o fed-batch alimentado

Xi =0 Xi =0 X
Si Si S
Fi Fi Fo

Xinicial
Sinicial
Fi Fo
dV/dt 0 (Variacin del volumen)

Ventaj as:

Permite controlar la in hibicin d el crecimiento y f ormacin de

producto por el sustrato

Mej ora el ren dimiento en bi omasa compara do al cultiv o batch

Permite llev ar a cabo la produccin de metab olitos en la f ase

estacionaria

La adicin de sustrato, reduce la v iscosidad del medio de

f ermentacin (produccin de po lisacridos extracelul ares)

Permite trabajar as pticamente y mejora la estabilidad gen tica

de las cepas, comparado al cultiv o continuo

7

Los procesos de cultiv o f ed batch se usan a niv el industrial y
estn adaptados a los procesos de f ermentacin en los que el
producto se f orma despus de la f ase de crecimiento exponencial
(ejem: penicilin a).

Es difcil medir la concentracin del substrato directa y

continuamente du rante la f ermentacin a f in de controlar el
proceso de alime ntacin, para esto se miden parm etros
indirectos (pH, pO2, CO2) que estn correlaciona dos con el
metabolismo del substrato crtico.

En la producci n de cidos org nicos el v alor del pH puede ser

utilizad o para d eterminar la v elocidad de alim entacin de gl ucosa

En f ermentaciones con v alores osmticos crticos la alimentacin

puede ser re gulad a controlan do el v alor de pO2 o el contenido de
CO2 en los gases que se liberan.

Cultiv o continuo

Xi = 0 X
Si S
Fi Fo

Xinicial
Sinicial
Fi = Fo
dV/dt = 0 (Variacin del
volumen)

Ventajas:

El objetiv o es prolongar la f ase exponencial adicio nand o medio

f resco al biorreactor

El crecimiento se encuentra limitado po r la concentracin d e un

sustrato limitante

Elimina los ef ectos de represin del crecimiento y produccin

causado por el sustrato

El suministro constante de medio, reduce la v iscosidad del

medio

El suministro constante de medio reduce el ef ecto de

constituy entes txicos

Se pued e prolo ngar po r el tiempo desea do la etapa de

f ormacin de producto

8
 Tipos de fermentaciones continuas

A. Biorreactor me zclado hom ogn eamente o de me zcla completa.-

Es utilizado como un quimiostato como un turbidostato.

Quimiostato (estado de equi librio q umico): el crecimiento de

las clulas se controla ajustando la concentraci n del
substrato.

Cualquie r azcar, compuesto nitrogen ado, sales, O2 puede

ser utilizad o como substrato limitante.

T urbido stato: el cr eci mi ento de l as c lul as s e manti ene c onstante

utiliz ando l a tur bidez par a c ontrol ar l a c oncentracin de bi omas a y l a
vel oci dad de ali mentacin de l a s olucin de nutri entes s e aj usta de
manera apr opiada.
Producto

Solucin
de nutrientes
Producto

Solucin
de nutrientes

Quimiost ato Turb ido st ato

B. Biorreactor de f lujo de tapn (de pistn).

El medio de cultiv o f luy e a trav s de un biorreactor tubula r sin

mezclad o.

La composicin del medio, la conc. celular, la transf erencia de

masa de O2 v aran en distintas posiciones del sistema.
Producto

A la entrada del biorreactor las clulas

deben aadirse continuamente junto
con la solucin de nutrientes.

Medio de cultivo
+
inculo

9
 Quimiostato

 La densida d celular y la v elocidad de crecimiento se controla

mediante la tasa de diluci n

 La v elocidad de dilucin se controla medi ante la concentraci n de

un sustrato limitante

 La producci n celular se controla medi ante la v ariacin en la

concentracin del n utriente limitante

 No requier e de un sistema complejo de control par a mantener el

estado de equili brio

Quimiostato sucede en un bio rreactor continu o de mezcl a

completa y es un estado estacionario en el que la f ormacin de
biomasa est en equili brio con la salida d e clulas del bio rreactor.

La v elocidad de dilucin D (1/h) repr esenta el f lujo del medio en el

quimiostato por unid ad de v olumen de lquido conten ido y se
def ine como:

D = F/ V
Donde:
D = v elocidad de f lujo v olumtrico que entra y sale a trav s
del v olumen del f ermentador: v elocidad de diluci n
F = v elocidad de f lujo (L/ h)
V = v olumen del medio contenid o en el biorr eactor (L)

La v ariacin acumulacin neta de biom asa con el tiempo (dx/dt)

se expresa como:

dx/dt = crecimiento produccin (salida )

dx/dt = .X D.X

En estado de equi librio, la concentraci n de clulas es cte., dx/dt

= 0, entonces:
.X = D.X  = D

En cultiv os continuos en quimiostato y a D constantes; la conc. de

sustrato, las reacciones bioqumicas dentro de la clula y la
v elocidad de f ormacin de producto son constantes.

10

El metabolismo celular v ara a una D constante dependie ndo del
tipo de substrato limitante.

La v elocidad especf ica de crecimiento () se controla mediante

la v elocidad de dilucin (D)

En estado de equi librio la p rdid a de clulas a la salida d el

biorre actor se balancea con el crecimiento del m.o

Cuando los nutrie ntes y otras condiciones celulares son

f av orables se cumple:

Velocidad de crecimiento (g/h)

= 1/X . dx/dt
Conc. de clulas en el biorreactor (g)

En estado es tacionari o de c ulti vo (qui mi os tato) puede deter mi nar se, el

rendi mi ento ( Yx/s ), l a c oncentracin c elul ar ( Xe) y la c onc entracin de
subs trato residual ( Sr):

Biomasa producida (g) Xe Xo

Yx/s = =
So Sr
Substrato consumido (g)

Yx/s (So S r) = Xe Xo Si; Xo = 0

Xe = Yx/s So Sr

Xe = Conc. biomasa en estado estacionario (g)

Xo = Conc. inicial de biomas a (inculo) (g)
So = Conc. de substrato en el medio que entra en estado estacionario (g)
Sr = Conc. de substrato residual que sale del biorreactor (g)

Usando la ecuacin de Mo nod pu ede calcularse la conce ntracin

de sustrato residual (Sr):

= max Sr Sr
Ks + Sr D = max
Ks + Sr

Sr = DKs Si; D < max

max D

La concentracin de biom asa en el estado estacionari o ( Xe):

DKs
Xe = Yx/s So
max D

Sr

11

Efec to de la vel oci dad de dil uci n (D) en l a c onc. de s ubstr ato, bi omas a y
produc ti vi dad en estado estaci onario:

Pr odu cci n d e biom asa

co nst an te

P
Cr ecim ie nt o cel ular
Productividad de biomasa (Pc)

m xim o

Concentracin de sustrato residua l (s r )

Xe

Tiempo de dupl icacin celular (t d)

Concentracin de b iomasa (x e)
Quimiostato td
(Estado de equilibrio)
So
D = cte.
V = cte.
Xe = cte.
Sr

0 1 0
Velocidad de dil ucin
pti ma Dm = m ax
Crecimiento cel ular Punto de lavado
en cult ivo batch
Velocidad o tasa de dilucin (D)

Cuando D 0,9 max, la v elocidad de crecimiento celula r est

equilib rada con la v elocidad de consumo de sustrato. En estado
estacionario: Xe = constante.

Cuando D << , el sustrato es casi completamente agotado por

las clulas, as: Sr = 0, entonces aqu:

Xe = Y x/s . So

Cuando Xe = 0, se alcanza el punto de lav ado (D m) y se produce

el colapso, siendo dx/dt negativ o.

So So
Dm = max 1 Dm = max
Ks + So Ks + So

Productiv idad de un cultiv o continuo (quimiostato)

P = D. Xe .................(g/l.h)

D. Ks
P = D. Y x/s So
max -D

En f ermentaciones continuas la productiv idad mxima es igual a

la productiv idad total y a que el tiempo de establecimiento y la
f ase de latencia pueden ser desprecia dos.

Los procesos industriales don de se aplican el cultiv o continuo

son el tratamiento de aguas resid uales, producci n de cerv eza,
glucosa-isomer asa y etanol.

12
Turbidostato

La concentracin de clu las en el cultiv o se mantiene constante

controland o el f lujo del medio

La turbide z se mantiene constante

La biomasa se monitore a mediante un a clula f otoelctrica

Aplicaciones del cultivo continuo

Produccin d e cido actico

Produccin d e protena de ori gen celul ar

Optimizaci n de medios de cultiv o

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