UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMN

FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS, PECUARIAS Y FORESTALES

Dr. Martin Crdenas

MICROPROPAGACIN DE SEIS ACCESIONES DE PAPA RUNA

(solanum tuberosum spp. andigena ) EN VAS DE OBTENER
MICROTUBRCULOS PARA LA PRODUCCIN DE SEMILLA DE
PAPA

PERFIL DE TESIS PARA

OBTENER EL TTULO DE
INGENIERO AGRNOMO

Responsable: Jhonny Delgado Condori

Cochabamba - Bolivia
I. TITULO

MICROPROPAGACIN DE SEIS ACCESIONES DE PAPA RUNA (solanum

tuberosum spp. andigena ) EN VAS DE OBTENER MICROTUBRCULOS PARA LA
PRODUCCIN DE SEMILLA DE PAPA

Responsable: Jhonny Delgado Condori

Tutor: Dr. Jorge Antonio Rojas Beltrn

Asesora: Ing. MSc. Cecilia Ugarte

Asesor: Ing. Juan Villarroel Soliz

II. INTRODUCCIN

La papa es un cultivo bsico y de seguridad alimentaria para la poblacin boliviana. Para ms

de 200000 familias de pequeos agricultores que constituyen entre el 30 y 40% del total de
campesinos del pas, la papa constituye la principal de alimento e ingreso econmico (Zeballos,
1997).

El rendimiento promedio en los Andes Bolivianos de 5 a 6 t/ha, mientras que en el mundo es de

14 t/ha y de 26 t/ha en los pases desarrollados, la causa del rendimiento bajo es a diversos
factores limitantes las cuales son: factores abiticos (los ms adversos son: la sequa, heladas,
salinidad etc.) y factores biticos (los ms dainas son: hongos, bacterias nematodos, insectos
etc.) (Bojanic, 1995).

Uno de los daos causados es la mala calidad de la semilla debido a su degeneracin. La

utilizacin de tubrculos-semillas provenientes de plantas infectadas con virus en sucesivas
campaas de siembra produce menos tubrculos o estos son ms pequeos que los de las plantas
sanas. Ello conduce a la degeneracin del cultivar con prdidas en los rendimientos superiores
al 80%. El agricultor bajo estas condiciones no desea utilizar tubrculos-semillas de su propia
cosecha (semilla "cansada") y busca una fuente de semilla limpia, si sta no est disponible los
cultivares nativos degenerados son descartados por los agricultores y reemplazados por otros
cultivares o cultivos, perdindose la diversidad gentica nativa (Zeballos, 1997).
Para producir plantas libres de virus, el mtodo de propagacin clonal el cultivo in vitro de
meristemos, pices de papa y de micro tubrculos. Ya las plantas in vitro tienen la facilidad de
someter a tratamientos de limpieza viral. Una de las tcnicas es la termoterapia, consiste en la
aplicacin de calor al tejido vegetal en crecimiento, buscando mrgenes trmicos en los cuales
la planta se recupere, en tanto que el ARN del virus se desnaturaliza o se dificulta su replicacin
despus del tratamiento (Lozoya 1995).

El empleo de plantas in vitro y microtubrculos en la produccin de semilla de papa tiene

ventajas con respecto a la semilla convencional ya que estn libres de patgenos, se obtiene un
gran nmero en cortos periodos de tiempo, se reducen los costos de labores agronmicas en el
mantenimiento de germoplasma en campo, etc. Adems, pueden ser propagados en cualquier
poca del ao, se facilita el intercambio de material gentico y se reduce el riesgo de prdidas
genticas al evitar la mezcla del material vegetal por cruzamiento (Prez et al., 1998).

III. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Propagar mediante tcnicas de cultivo in vitro, seis accesiones papa Runa (Solanum.
tuberosum ssp. andigena).

2.2 Objetivo especficos

Establecer in vitro las accesiones de papa Runa, en los medios Murashige & skoog (MS)
y CIP, a partir de brotes desinfectados.
Multiplicar los explantes establecidos in vitro.
Inducir los explantes a producir microtubrculos.
IV. REVISIN DE LITERATURA

3.1. Mtodos de propagacin de papa

El tubrculo de la papa se considera como la semilla unitaria tradicional y su calidad refleja las
condiciones en que se ha desarrollado el cultivo, incluyendo su estado fitosanitario. En muchos
pases, la imposibilidad de producir semilla bsica de modo estable ha incrementado la
importacin de sta en cantidades significativas (Lago, 1991).

La papa se propaga vegetativamente por tubrculos-semillas, lo que asegura la conservacin de

caractersticas varietales durante generaciones sucesivas. Sin embargo, debido a su forma de
propagacin asexual est sometida a un alto riesgo de contaminacin por virus, hongos,
bacterias e insectos, durante el perodo de cultivo y almacenamiento. Tambin al emplear el
material vegetativo por ciclos repetidos puede ocasionar degeneracin del cultivo por la
acumulacin de enfermedades, especialmente virales (Scherwinski y Luces, 2004). Tambin
puede ser propagada por semilla botnica, pero esta va se emplea fundamente con fines de
mejoramiento gentico.

3.1.1. Propagacin por mtodos biotecnolgicos

La propagacin in vitro de papa es mediante el subcultivo de yemas axilares. Se pueden obtener

tanto plantas in vitro como microtubrculos (Salas, 1995; Agramonte, 1999; Borda et al., 2001;
Donnelly et al., 2003; Gopal et al., 2004; Caldern et al., 2008).

En el cultivo in vitro convencional, las plantas se cultivan en recipientes cerrados en un entorno

asptico y con la presencia de un medio de cultivo slido, semislido o lquido. El medio de
cultivo contiene, adems, altas concentraciones de sacarosa como fuente de carbono, sales
inorgnicas, vitaminas y otros aditivos en dependencia de la especie y de la tcnica de cultivo
(Aragn et al., 2009).

En la propagacin de papa han sido empleados medios de cultivos en estado lquido y en estado
semislido, este ltimo ha sido el ms empleado. Los primeros incluyen la facilidad de
preparacin, esterilizacin y manipulacin, pero en condiciones estticas provocan un efecto
depresivo sobre el crecimiento del tejido en el cultivo in vitro, ya sea por hipoxia o por
hiperhidricidad (Debergh, 1983; Alvard et al., 1993; Ziv et al., 1998).
3.1.2. Produccin de microtubrculos de papa

El primer informe sobre tuberizacin in vitro fue publicado por Baker (1953), quien utiliz
brotes etiolados para inducir tuberizacin en un medio de cultivo con 8.0 g l-1 (m/v) de sacarosa.
A partir de ah comenz la utilizacin de reguladores del crecimiento a favor de la tuberizacin,
lo que ha sido objeto de intensas investigaciones (Wang y Hu, 1982; Estrada et al., 1986; Leclere
et al., 1994; Gopal et al., 1998; Ebadi e Iranbakhsh, 2011).

3.2. Fase de laboratorio

3.2.1. La produccin moderna de tubrculos semilla sano de papa.

El cultivo in vitro de meristemos, yemas axilares y pices de papa es una tcnica ampliamente
utilizada en la obtencin de plantas libres de enfermedades, las cuales se mantienen in vitro para
la conservacin de germoplasma, para el cambio internacional de material gentico y como
apoyo en la propagacin masiva de tubrculo semilla de papa de alta calidad fitosanitaria y
gentica (Hawkins, 1992).

La produccin moderna de tubrculo semilla de papa libre de patgeno que se utiliza en la

produccin comercial de campo tiene tres fases: a) obtencin y multiplicacin rpida de plantas
in vitro libre de enfermedades, b) siembra invernadero de la planta sana in vitro para la obtencin
de micro tubrculos sanos y c) produccin en campo de tubrculo semilla sana en categora
certificada, para una distribucin en siembras comerciales la cual se logra, a partir del mini
tubrculo y siembras sucesivas para obtener semilla bsica, registrada (R) R1 R2 R3 y
certificada, esta ltima para produccin de tubrculo para consumo (Valds 1995).

3.2.2. Procedimiento general para la obtencin y multiplicacin para papa in vitro sana.

La obtencin y multiplicacin de papa sana in vitro en su primera fase de produccin de

tubrculo-semillla se lleva a cabo en el laboratorio y se inicia con la siembra con una seccin de
tejido vegetal de la papa, llamado explante, en un medio de cultivo artificial, el cual bajo
condiciones de esterilidad y los apropiados requerimientos de temperatura y luz, crece para dar
origen a una plntula in vitro en poco tiempo es seccionada en micro estacas las cuales son sub
cultivadas nuevamente y as sucesivamente hasta tener tantos miles de plantas in vitro como se
hayan planeado (Galvez y Lorence, 1997).

3.2.3. Medio de cultivo para la multiplicacin de papa in vitro.

El medio de cultivo semislido ms utilizado para la multiplicacin de explantes sencillos, se

denomina MS dado que fue desarrollado por Murashige & skoog 1962;

3.2.4. Establecimiento de papa in vitro.

Para la obtencin de las primeras plantas in vitro sanas se toman como explantes pices de
yemas apicales y axilares de una planta visualmente o de los brotes de un tubrculo de un
tubrculo visualmente sano los pices son cuidadosamente lavados y desinfectados en
hipoclorito de sodio al 2% para luego enjuagar con agua estril y sembrarlos en tubos de ensayo
u otros contenedores con el medio MS de cultivo, previamente esterilizado. Este trabajo se lleva
a cabo bajo condiciones aspticas, logrndose esto en un ambiente que ha sido previamente
aseado y desinfectado con hipoclorito de sodio (NaCIO) al (00.05%) o alcohol al 6%,
efectundose la siembra de los pices en el medio, en una campanada de flujo laminar (CIP,
1997)

3.3. Tcnicas de limpieza viral

3.3.1. Extraccin de meristemos

El meristemo es un tejido indiferenciado localizado dentro del pice de un brote o yema axilar
o apical en crecimiento generalmente observndose bajo el microscopio como una estructura
brillante en forma de domo, mide aproximadamente 0.1 mm de longitud y en constante divisin
celular, se asume que est libre de virus por carcter a uno de los vasos de floema bien
diferenciados, impidindose as la presencia de partculas virales en el meristemo al no
movilizarse del tejido infectado de una planta enferma, al tejido sano de formacin (Lizrraga,
1991).

3.3.2. Termoterapia

Consiste en la aplicacin de calor al tejido vegetal en crecimiento, buscando mrgenes trmicos

en la cuales las plantas se recuperen, en tanto que el ARN del virus se desnaturaliza o se dificulta
su replicacin despus del tratamiento.
Para un virus o fitoplasma, existen niveles de temperatura y tiempos de exposicin, los cuales
han dado mejor resultado en la eliminacin de estos Fito patgenos, excepto los viroides, en los
tejidos infectados (Lozoya, 1995).

3.3.3. Quimioterapia

Consiste en la aplicacin de viricidas o productos que eliminen los virus, tal el caso del
Ribavirin, el cual aplicado en medio de cultivo en cual crecen las plantas in vitro infectadas por
virus, interfiere en la replicacin viral permitiendo que los meristemos se toman como explantes
para la produccin de plantas in vitro libres de virus (Lozoya, 1995).

3.3.4. Electroterapia

Es la aplicacin de corriente elctrica la cual aumenta la temperatura del tejido vegetal por lo
que podra ser una alternativa para el saneamiento de material vegetal infectado con virus, esta
tcnica es combinada con el cultivo de tejido para multiplicar el material tratado (Lozoya, 1995).
V. MATERIALES Y MTODOS

La investigacin se realizar bajo condiciones de laboratorio de biotecnologa ALISO de la

escuela forestal (ESFOR) de la Facultad de Ciencias Agrcolas Pecuarias y forestales -UMSS.

Objetivo especfico 1. Establecer in vitro las accesiones de papa Runa, en los medios
Murashige & skoog (MS) y CIP, a partir de brotes desinfectados.

Materiales

a). Material vegetal

Tubrculo con rebrote

b). Material del laboratorio y equipo

Estereoscopio
Aguja
Cajas magenta
Medio de cultivo MS
Hipoclorito de sodio al 2%
Agua desmineralizada
Vaso precipitado
Pinza
Cmara de crecimiento

Procedimiento

El establecimiento in vitro a partir de brotes de tubrculos, constara de los siguientes pasos:

*Con la ayuda de estereoscopio se observar claramente y con aguja y pinza se extraer ex

plantes pices de las yemas apicales o axilares de los brotes de un tubrculo visualmente sano.

* Los pices cuidadosamente se lavar y desinfestar en recipientes de hipoclorito de sodio al

2%.
*Enjuagara con agua estril y sembrarlos en cajas magenta de ensaye con el medio MS de
cultivo, previamente esterilizado.

*Exponer alternativamente varios das a la oscuridad y varios das a la luz difusa, hasta que el
brote se torne verde y tanto su longitud como la distancia entre los nudos facilitan el corte de
los brotes.

*Este trabajo se lleva a cabo bajo condiciones aspticas, logrndose esto en un ambiente que ha
sido previamente aseado y desinfestado con hipoclorito de sodio (NaCIO) al (0.05%) o alcohol
al 6%.

Objetivo especfico 2 Multiplicar los explantes establecidos in vitro

Materiales

a). Material vegetal

Explantos establecidas

b). Material del laboratorio y equipo

Cajas magenta
Medio de cultivo MS preparado
Agua desmineralizada
Algodn
Escalpelos
Papel toalla
Vaso precipitado
Placas Petri
Pinza
Mechero bunsen
Cmara de flujo laminar
Cara de crecimiento
Procedimiento

Una vez establecido el explante, los pices inician rpidamente la brotacin y en dos a cuatro
semanas se obtiene una planta in vitro con seis o siete nudos. Del cual se proceder a multiplicar
en el rea de la cmara de flujo laminar.

*Se esterilizar el rea y los materiales de trabajo de trabajo con alcohol etanol al 70%

*Las plantas establecidas, se seleccionan las ms vigorosas y se seccionar en micro estacas con
una o dos yemas para ser transferidas nuevamente a recipientes con medio de cultivo MS estril
y as sucesivamente para incrementar la cantidad de plantas in vitro hasta obtener un total
preestablecido.

*En todo el material y equipo con la combinacin de hipoclorito de sodio al 2% y alcohol etlico
al 70% de trabajo se flameado con la ayuda de un mechero.

*Al cabo de tres a cinco semanas la microestacas sub cultivadas en medio de cultivo de
multiplicacin se han convertido en nuevas plntulas in vitro para un siguiente subcultivo.

Objetivo especfico 3 Inducir los explantes a producir microtubrculos

Materiales

a). Material vegetal

Vitroplantas establecidas en cajas magenta

b). Material del laboratorio y equipo

Cajas magenta
Medios de cultivos MS y CIP preparado para tuberizacin
Agua desmineralizada
Algodn
Escalpelos
Papel toalla
Vaso precipitado
Placas Petri
Pinza
 Mechero bunsen
Cmara de flujo laminar
Cara de crecimiento
Procedimiento

Los explantos se colocarn en un medio de tuberizacin con el incrento de sacarosa al 8 % a la

solucin nutritiva

Se analizar el porcentaje de microtubrculos por explanto

Croquis del experimento

Factor A.Accesiones de papa Runa (R, PR, YR, BR, yR y SR)

Factor B..Medios de cultivo (MS y CIP)

Doce tratamientos distribuidos dentro de la cmara de crecimiento

T6 T3 T5 T4 T7 T2 T8 T6 T5 T4

T8 T2 T12 T1 T10 T9 T11 T10 T3 T12

T7 T4 T11 T7 T9 T5 T1 T6 T7 T2

T9 T10 T9 T1 T12 T8 T3 T12 T10 T8

T6 T1 T11 T9 T11 T4 T12 T10 T1 T6

T2 T8 T5 T3 T5 T2 T7 T11 T3 T4

R = Runa BR= Bola runa

PR= Puka runa Yp= Yuraj runa

YR= Yana runa SR= Sani runa

Variables de respuesta

Las variables de respuesta que se evaluara son:

Porcentaje de contaminacin
Numero de nudos por explanto
Numero de microtubrculos por explanto
Peso fresco de microtubrculo
Dimetro de microtubrculo
Anlisis estadstico

Los datos de la variable de respuesta, previa verificacin de los supuestos de distribucin normal
y homogeneidad de varianzas, se analizaron de acuerdo al siguiente modelo estadstico:

Yij = + i + j + ij + k(ij)
i= 1, 2, 3, 4, 5, 6, accesiones de papa runa

j= MS, CIP medios de cultivo

k = 1, 2, 3, 4, 5 frascos magentas/ 9 explantos

Yijk= valor de la variable de la respuesta, observados en el k-esimo frasco magenta donde se

aplic el j-esimo medio de cultivo y la i-esima accesin de papa Runa

= Media general

i = Efecto fijo de la i-esima accesiones de papa Runa.

j = Efecto fijo de la j-esima medios de cultivo.

ij= efecto fijo de la interaccin entre la i-esima accesiones de papa Runa y j-esima medios de
cultivo.

ij= Efecto aleatorio de los residuales- NIID (02e)

VI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Abril Mayo Junio Julio Agosto Octubre

actividades Septiembre
s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4
perfil de tesis
Recoleccin de
variedades
Fase
Establecimiento
Fase
multiplicacin
Limpieza viral
Ts de ELISA
toma de datos
anlisis de
informacin
redaccin de
tesis
defensa de tesis
VII. PRESUPUESTO

Cuadro 1. Presupuesto para la ejecucin de tesis.

Unidad Cantidad Precio TOTAL

DESCRIPCIN unitario (Bs)
Mantenimiento del Global 1 4000 4000
laboratorio
Materiales del laboratorio
Cajas magenta Global 500 5 2500
Pinza Global 10 10 100
Escalpelos Cajas 5 35 175
Algodn Rollo 2 20 40
Jeringa Docena 2 20 40
Papel toalla Rollo 5 15 75
Tubos de ensayo Global 100 5 500
Otros imprevistos - 2000 2000
Materiales de reactivos
Medio de MS, AG3, BAP, Global - 3000 3000
ANA, Carbonato de calcio,
Sacarosa, Agar, Agua
Otros imprevistos - - 2000 2000
Materiales de escritorio
Fotocopias Hojas 500 0.2 100
Computadora Equipo 1 4000 4000
Marcador Global 2 5 10
Bolgrafo Global 4 8 32
Impresin Hojas 500 0.5 250
Empastado Pieza 10 45 450
Imprevistos () - - 1000 1000
TOTAL (Bs) 22272
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