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Memorias
Cientficas
Especialistas en Bovinos, A.C.
Asociacin Mexicana de Mdicos Veterinarios
Memorias del XXXVIII Congreso Nacional de Buiatra
Acapulco, Guerrero. 2013
COMIT CIENTFICO
V
Memorias del XXXVIII Congreso Nacional de Buiatra
Acapulco, Guerrero. 2013
Contenido
RECONOCIMIENTOS 1
PONENCIAS MAGISTRALES 7
VII
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GENTICA 325
IX
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X
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NUTRICIN 457
XI
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XII
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REPRODUCCIN 706
XIII
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SOCIOECONMICAS 843
XIV
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XV
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VIDEOS 1002
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Yunlong, C. and B. Smith. 1994. Sustainability in agriculture: a general review. Agriculture, Ecosystems and
Environment. 49:299-307.
*
Lagunes Q R E, Domnguez G D I, Quiroz R E, Martnez V M, Rosario C R.
RESUMEN
El presente estudio tuvo como objetivo la obtencin de un pptido recombinante, mediante el anlisis in silico de
la secuencia del gen subolesin con el fin de predecir la regin ms inmunognica de la secuencia del gen
previamente publicado en el GenBank. Una vez que se determin la regin de inters se procedi a disear un par
de oligonucletidos, con el fin de amplificar el fragmento del gen mediante PCR. Se amplific un segmento de 303
bp, El producto de amplificacin fue diseado con una etiqueta de histidinas en la regin carboxilo terminal, y fue
clonado en un vector Topo TA, se llevo a cabo la secuenciacin del fragmento del gen de inters y se confirm la
secuencia del gen mediante la utilera del BLAST, encontrndose un 99.99% de homologa. Se obtuvo el plsmido
recombinante y se transform una colonia de bacterias Bl21, con el fin de expresar el pptido recombinante
mediante la induccin con IPTG, el pptido fue sometido a diferentes tiempos de induccin en medio lquido a 37
o
C y analizado mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y Western Blot, detectndose un pptido de
aproximadamente 11Kd, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la etiqueta de histidinas.
INTRODUCCIN
Las infestaciones con R. microplus, impactan econmicamente la produccin de Ganado bovino, debido a la
reduccin en la ganancia de peso y la produccin de leche, adems de que son transmisoras de los patgenos que
causan la babesiosis y anaplasmosis bovina (de la Fuente y Kocan, 2006; Ghosh et al., 2007). Se estima que el
impacto economico producido por las garrapatas a nivel mundial alcanza los 10,000 millones de dlares anuales
(Grisi et al., 2002).
Los mtodos convencionales para el control de garrapatas han sido basados principalmente en el uso de
acaricidas; sin embargo la rpida aparicin de la resistencia en las poblaciones de garrapatas, y la presencia de
residuos qumicos en la leche y en la carne, son aspectos que enfatizan la necesidad de nuevos mtodos de control
como las vacunas (Willadsen et al., 1996) y el control biolgico (Gindin et al., 2002). Aunque una vacuna contra las
garrapatas podran ser uno de los ms prometedores mtodos de control, an depende de de los procedimientos
de identificacin y purificacin de uno ms antgenos protectivos (Imamura et al., 2005).
Las vacunas se comenzaron a comercializar a principios de los noventa como una alternativa viable en trminos del
costo y de la eficiencia para combatir a las garrapatas, reducir el uso de los ixodicidas, as como la contaminacin
ambiental y la contaminacin de carne y leche producidas para consumo humano (de la Fuente y Kocan, 2003,
2006; de la Fuente et al., 2007; Willadsen, 2006). Las vacunas derivadas del gen Bm86, Gavac y Tick- GARD, tienen
un efecto sobre las hembras repletas de la garrapata Boophilus microplus, reducen el nmero de garrapatas, el
peso y su capacidad reproductiva, lo que resulta en un incremento en la efectividad de la vacuna y la reduccin en
la prevalencia de algunos patgenos transmitidos por garrapatas (de la Fuente et al., 1998, 2007; de la Fuente y
Kocan, 2003).
*
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Avenida Universidad 3000, CP 04510. Mxico, D.F
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Los adelantos en el rea de la bioinformtica nos han permitido avanzar ms rpidamente en el anlisis y la
identificacin de protenas a partir de la minera de datos, ya que los algoritmos disponibles nos permiten
caracterizar un gen, de acuerdo con su funcin putativa, localizacin y el potencial inmunognico de la secuencia
de un gen.
El gen subolesin fu descubierto en la garrapata Ixodes scapularis mediante el uso de la inmunizacin con una
geneteca de expresin en combinacin con el anlisis de las secuencias de etiquetas de expresin en un modelo de
ratn con infestaciones por garrapatas (Almazn et al, 2003a, Almazn et al., 2005a; de la Fuente et al., 2006a), y
se sabe que el subolesin est involucrado en la modulacin de los procesos de alimentacin de acuerdo con
experimentos de interferencia por ARN (RNAi) (de la Fuente et al. 2005, 2006ac). Posteriormente se descubri
que la protena recombinante codificada por el subolesin, era protectiva cuando se utiliz en experimentos de
inmunizacin (Almazn et al., 2003a,b; 2005a,b; 2010). Por lo anterior el presente trabajo tiene como objetivo,
localizar mediante el anlisis in silico, la regin del gen ms inmunodominante para identificar y producir un
pptido recombinante que en el futuro pueda funcionar como una vacuna mejorada contra las infestaciones por
garrapatas.
MATERIAL Y MTODOS
Cepas de Garrapatas
Se utiliz la cepa de garrapatas Media Joya, perteneciente al germoplasma del CENID-PAVET del INIFAP, y
mantenida en condiciones controladas. Esta cepa fu aislada en el municipio de Tapalpa, Jalisco, Mxico.
Se utiliz una secuencia obtenida del GenBank (DQ159965.1), de la cepa de garrapatas Santa Luisa, obtenida de la
pgina web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y se analiz mediante el algoritmo disponible
en el software CLC Main Work Bench 5, con el fin de predecir la secuencia del gen con una mayor capacidad
inmunognica (Kolaskar-Tongaonkar, 1990; Saha and Raghava, 2006) e hidrofobicidad (Kyte and Doolittle, 1982).
Una vez localizada la secuencia se procedi al diseo de los oligonucletidos, para su sntesis.
El DNA y RNA fu extrado a partir de la cepa susceptible susceptible Media Joya. 100-150 larvas de garrapatas
sin alimentar fueron usadas en este experimento. El RNA fu extrado a partir de larvas de garrapatas
homogeneizadas en un mortero congelado a -80 oC con el reactivo de TRIZOL (Life Technologies, Maryland, USA)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La sntesis de cDNA se llev a cabo a partir de 5 g de RNA total de
larvas de garrapatas, utilizando el kit de RACE cDNA (Invitrogen, Carlsbad CA), el cual se utiliz como plantilla en las
reacciones de amplificacin por PCR. Los primers especficos se disearon mediante el uso del programa Primer 3,
considerando las regiones conservadas y antignicas del gen subolesin. Las secuencias de los primers fueron las
siguientes: FW 5CACCATGAAGCGACGCCGATGTATG-3 and RV 5CTCCTCCCGTATCTTGCTCTC-3. La reaccin de PCR
fu llevada a cabo en un termociclador Biometra, (Gottingen, Germany) utilizando volmenes de reaccin de 25 l,
y 40 ciclos de amplificacin de 30s a 96C, 1 min, una temperatura de alineamiento y extensin de 72C
respectivamente. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 1% con el fin de corroborar el
tamao del producto de amplificacin, por comparacin con una escalera de marcadores de DNA de una Kb (DNA
Ladder, Invitrogen).
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Los fragmentos amplificados, fueron clonados en el plsmido pET101/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA),
utilizando 4 l del producto de PCR, 1 l de solucin alta concentracin salina y 1 l del vector Topo vector,
posteriormente se transformaron clulas competentes E. coli One Shot Top 10. Se utilizaron 3 l de la reaccin de
clonacin TOPO para transformar un vial de clulas qumicamente competentes TOP10. Se analizaron por PCR
usando los primers especficos con el fin de identificar las clonas que tuvieran el tamao apropiado del inserto en
geles de agarosa al 1%. La purificacin del plasmido se llev a cabo mediante el mtodo de lisis alcalina utilizando
el kit de Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System, de acuerdo con las instrucciones del productor.
RESULTADOS
Prediccin de la secuencia del pptido antignico del gen subolesin utilizando el algoritmo de Kolaskar and
Tongaonkar del software CLC Main Workbench 5.7.
Se analiz el gen subolesin mediante el algoritmo Kolaskar and Tongaonkar (fig. 1) y se determin la secuencia de
un fragmento de 303 pb el cual se utiliz para el diseo de los oligonucletidos, para su amplificacin por PCR a
partir del cDNA de la cepa de garrapatas denominada Media Joya, cuyo tamao fue corroborado mediante una
segunda amplificacin por PCR (fig 2) y por la secuenciacin del fragmento. El alineamiento de los fragmentos
secuenciados tuvo una homologa de 99.9%. El producto de expresin identificado mediante un anticuerpo
monoclonal dirigido contra la etiqueta de histidinas nos permiti identificar mediante la tcnica de Western Blot
un pptido recombinante de aproximadamente 11 Kd (fig. 3).
DISCUSIN Y CONCLUSIONES
El control de garrapatas a partir de vacunas que contengan antgenos especficos pueden ser de gran utilidad
porque el efecto de inmungenos protectivos se refleja en la reduccin de las funciones vitales de las garrapatas.
Actualmente el uso de las herramientas de bioinformtica protemica y de biologa molecular, pueden utilizarse
de manera conjunta para predecir las propiedades bioqumicas, y antignicas del gen que codifica para una
protena de inters potencialmente til para el desarrollo de vacunas contra cualquier parsito. De la misma
manera se pueden identificar regiones que contienen epitopos B T cuyas secuencias son conservadas,
antignicas e hidroflicas (Mosqueda et al., 2012).
El ejemplo de una vacuna exitosa ha sido la que se desarroll a partir del antigen Bm86 antigen, aislado de las
clulas del epitelio intestinal y clonado por tecnologas de DNA recombinante y expresado en E. coli in Australia
(Willadsen and McKenna, 1991, de la Fuente et al., 1999) y posteriormente expresado en Pichia pastoris (Canales
et al., 1997).
El pptido recombinante, derivado del anlisis in silico del gen subolesin, corresponde con una protena que est
asociada con la interrupcin de la reproduccin de la garrapata y se sabe que protege a los bovinos contra las
infestaciones por garrapatas.
El uso de pptidos sintticos, ha sido reportado como una herramienta para incrementar la capacidad
inmunolgica de una vacuna, en el caso del Bm86, por lo tanto la prediccin de la regin mas inmunognica de
este gen, nos va a permitir dirigir la respuesta immune contra los eptopos contenidos en esta parte de la
secuencia y de esta manera incrementar el potencial protectivo si se utiliza como inmungeno, para el desarrollo
de una vacuna ms efectiva.
AGRADECIMIENTOS
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Agradecemos a la Fundacin Produce Guerrero por el apoyo otorgado a la Dra. Delia Ins Domnguez Garca, a
travs del convenio No. 002160 y Al Programa de Fondos Mixtos del Estado de Guerrero por el financiamiento
otorgado al Dr. Rodrigo Rosario-Cruz al travs del convenio No.92367.
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Figura 1. Prediccin de la secuencia del pptido antignico del gen subolesin utilizando el algoritmo de Kolaskar
and Tongaonkar del software CLC Main Workbench 5.7.
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$5.5-$2.89
Figura 2. Amplificacin por PCR de las clonas recombinantes de inters, analizadas en un gel de agarosa, el
producto de amplificacin es de 303 bp.
303bp
12000
PVU-CVU 5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Figura 3. Purificacin por cromatografa de afinidad e identificacin por Western blot utilizando un anticuerpo
monoclonal dirigido contra la etiqueta de histidinas del pptido recombinante derivado del gen subolesin que
corresponde con un peso molecular de 11Kd aproximadamente.
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