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CAMPUS II
PROTOCOLO DE TESIS:
PRESENTA
Samantha
DIRECTOR:
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Introduccin.
Se tiene conocimiento de que los reptiles pueden ser portadores asintomticos de Salmonelosis
(Monsalve et al, 2009); las tortugas, iguanas y serpientes son algunos ejemplos de ellos.
Adems, la salmonelosis no slo representa un peligro potencial para la salud de los humanos,
sino que tambin pueden afectar a los reptiles que interactan entre ellos mismos. Se tiene
conocimiento de que los reptiles son reservorios de enterobacterias tales como Escherichia coli,
Klebsiella spp, Pseudomonas, Shigella spp y Salmonella spp (Monsalve et al 2009, Nelson et
al 2010, Velsquez 2010, Chitty & Raftery 2013). sta ltimo es de inters por su virulencia y
patogenicidad hacia los humanos y animales. La salmonelosis es una enfermedad producida
por microorganismos del gnero Salmonella, y es la zoonosis de mayor riesgo para las
personas que mantienen reptiles en cautiverio (Duque & Giraldo, 2008). Las fuentes de
infeccin de Salmonella spp., provienen frecuentemente de aguas contaminadas, alimentos,
medio ambiente y portadores asintomticos; reptiles principalmente (Parra M., Durango M.,
Mttar 2002, Nelson et al 2010).
En regiones tropicales especies de tortugas pueden contaminar cisternas de agua potable, las
tortugas no son extraas como juguete infantil y podran representar una amenaza en la salud
humana. A comienzos de la dcada de 1970, pequeas tortugas mascotas fueron una
importante fuente de infecciones por Salmonella en estados unidos. Desde 1986 la popularidad
de reptiles que pueden transmitir la infeccin a seres humanos ha dado lugar a un aumento de
la incidencia de infecciones por Salmonella causada por serotipos asociados a reptiles (Beer,
1981).
La presente tesis de licenciatura tiene como objetivo aislar e identificar especies de Salmonella
en tortuga blanda (Dermatemys mawii), tortuga de sienes rojas (Trachemys scripta elegans) y
tortuga mojina (Rhinoclemmys areolata) residentes del zoolgico regional Miguel lvarez del
Toro. Estas especies de tortuga son de un gran valor cultural, econmico y social, la tortuga
blanda (Dermatemys mawii) es la nica especie viva de la familia Dermatemidae y de acuerdo
a la SEMARNAT 2012 se encuentra en peligro de extincin, tambin es usada para consumo
humano por lo que es muy perseguida, la tortuga japonesa o de sienes rojas (Trachemys scripta
elegans) es comercializada como animal de compaa y se ha convertido en una especie
invasora. Adicionalmente, esta investigacin busca responder la pregunta de si las tortugas que
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se encuentran resguardadas por el rea de Anfibios y Reptiles del zoolgico son reservorios
de Salmonella spp, que podran representar una fuente de contagio para las personas, ya sea
visitantes o personal del zoolgico, as como con los animales con los que conviven.
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MORCO TEORICO
2.1 ENTEROBACTERIAS
De acuerdo a una lista publicada permanente de la NCBI (2016) esta familia est compuesta
por alrededor de 80 gneros, siendo esta lista actualizada constantemente.
Poseen una estructura antignica compleja; se distinguen tres tipos de antgenos: Antgeno O
o somtico constituido por el lipopolisacrido (LPS) de la membrana externa; Antgenos K
(termolbiles) o capsulares (protenas o polisacridos) y Antgenos o protenas H (flagelares)
(UFMG, s.f.).
Poseen fimbrias que las ayudan a adherirse a superficies o mucosas. Los pili sexuales permiten
el intercambio de la informacin gentica entre las clulas, que incluye la resistencia a los
antibiticos. Tambin producen protenas denominadas bacteriocinas que causan la lisis de
especies estrechamente relacionadas y pueden colaborar para mantener el equilibrio ecolgico
de diversas bacterias en el intestino (Tortora, Funke y Case, 2007).
Enterobacterias patgenas oportunistas: Aquellas especies que forman parte de la flora normal
del hombre y los animales, presentes en suelo, agua y plantas. Producen infeccin cuando
salen de su hbitat o hay alteraciones de las defensas locales. Incluye los gneros: Escherichia,
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Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, etc. (Merino y
Lsch, 2008).
En un estudio realizado con muestras orales y cloacales de anfibios y reptiles, se lograron aislar
bacterias gramnegativas tales Aeromonas sp., Plesiomonas sp., Vibrio sp., Citrobacter sp.,
Enterobacter sp., Escherichia sp., Klebsiella sp., Edwardsiella sp, Hafnia sp., Proteus sp.,
Providencia sp. Y Pseudomonas sp. Determinando que stos forman parte de la flora
microbiana en dichos organismos (Hacioglu y Tosunoglu, 2014).
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En los reptiles, Salmonella sp. es un microorganismo natural de la flora intestinal, sin embargo,
estos animales son catalogados como portadores asintomticos de la bacteria. (Pachn, 2009).
De acuerdo con Palacios (s.f.), plantea que algunas especies de bacterias que menciona la
literatura y conforman parte de la microbiota normal en reptiles son: Bacillus spp.,
Campylobacter spp., Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp.,
Hafnia alvei, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp. y Salmonella sp.
Otro estudio realizado con Dermatemys mawii arroj en sus resultados bacteriolgicos la
presencia de microorganismos potencialmente patgenos en lesiones, incluyendo
Staphylococcus aureus, Candida spp, y enterobacterias como Escherichia coli, Proteus
vulgaris, Serratia spp. y Klebsiella spp. (Rangel-Mendoza, Snchez-Gonzlez, Lpez-Luna y
Weber, 2014).
La presencia de Salmonella spp. en rganos internos de reptiles que muestran signos clnicos
est generalmente asociada con factores predisponentes, tales como estados de estrs, carga
parasitaria, traumas, tumores, enfermedades infecciosas (Pasmans et al., 2000).
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Los serovares de Salmonella enterica muestran una adaptacin a los reptiles pero conservando
su patogenicidad para animales de sangre caliente; sin embargo, tambin existen cepas
invasivas de Salmonella enterica subespecie Enterica que han sido aisladas de cocodrilos
(Pasmans et al., 2000; Corrente et al., 2004).
Dado que la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de los animales, la ruta de infeccin
puede ser por contacto directo con las heces del animal o directamente con la piel contaminada
con el excremento. En los reptiles, la transmisin puede darse perinatalmente, por ingestin de
presas contaminadas o por contacto directo con la materia fecal de otros reptiles; las altas tasas
de ejemplares portadores de Salmonella spp. se relacionan con el comportamiento de
coprofagia por parte de las cras, lo que asegura la transmisin prematura de dichos
microorganismos. (Pachn, 2009)
Estudios previos realizados en otros pases, indican que las tortugas que conviven como
mascotas con los humanos, pueden ser reservorios de Salmonella spp., bacteria que produce
cuadros clnicos severos en los humanos y en las tortugas inmunosuprimidas. (Duque, 2007)
Estos animales son reservorios naturales, y adems se ha reportado que algunos serotipos de
Salmonella spp. especficos de tortugas como S. Java, S. Urbana y S. Hartford y otros serotipos
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como S. Arizonae, S. Enteritidis y S. Typhimurium son potencialmente patgenos para animales
y humanos (Duque, 2007)
La funcin de las clulas rojas de los reptiles es similar a los de los mamferos. Los halterfilos
de los reptiles componen entre el 30 y el 45% de los leucocitos en la sangre perifrica. Estudios
citoqumicos y ultra estructurales han demostrado que la funcin de estas clulas es similar a
la de los neutrfilos de los mamferos, que consiste principalmente en la fagocitosis de bacterias
y material extrao. Su aumento est asociado a procesos inflamatorios o infecciosos. (Carrascal
et al., 2014)
La morfologa celular de los reptiles es variable en tamao, lo cual muchas veces dificulta su
diferenciacin. Por ejemplo, los linfocitos ms pequeos en algunas tortugas pueden ser muy
similares morfolgicamente a los trombocitos. La morfologa de las clulas encontradas en este
estudio concuerda con las descritas por diferentes autores para reptiles y en especial para
quelonios. (Carrascal et al., 2014)
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Las salmonellas pertenecen a la familia de las enterobacterias, que estn formadas por
especies o tipos gram-negativas, no esporulados, casi todos con flagelos peritricos y algunos
inmviles. Las Salmonellas crecen en medios sencillos, reducen nitratos a nitritos, son oxidasa
negativa y fermentan los hidratos de carbono. (Beer, 1981)
La salmonelosis ha sido asociada tambin con el contacto directo o indirecto con reptiles. A
comienzos de la dcada de 1970, pequeas tortugas mascotas fueron una importante fuente
de infecciones por Salmonella en estados unidos (Beer, 1981)
Desde 1986 la popularidad de las iguanas y de otros reptiles que pueden transmitir la infeccin
a seres humanos ha dado lugar a un aumento de la incidencia de infecciones por Salmonella
causada por serotipos asociados a reptiles. (Beer, 1981)
2.3.2. PATOGENIA
Segn la concepcin tradicional, los grmenes tomados por va oral son muertos en el
estmago, liberndose en el intestino endotoxinas termolbiles y absorbindose por va linftica
y sangunea. Estas daan el organismo y permiten la multiplicacin en el intestino de los
grmenes supervivientes. Por ltimo, la pared intestinal, daada tambin se vuelve permeable
para las bacterias supervivientes. Junto con esto tambin parece posible la reaccin atreves
del anillo linftico farngeo. Casi siempre se producen manifestaciones de los distintos rganos
con alteraciones patolgicas tras la diseminacin por el organismo. (Joachim Beer, 1981)
2.3.3. DIAGNOSTICO
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2.3.3.1. AGAR TETRATIONATO
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y adsorbe metabolitos txicos. La selectividad
est dada por la presencia de sales biliares y tetrationato (compuesto generado en el medio de
cultivo al reaccionar el tiosulfato de sodio con la solucin iodo-iodurada) que inhiben el
desarrollo de microorganismos Gram positivos y algunas enterobacterias. Salmonella spp.,
contiene la enzima tetrationato reductasa y puede crecer satisfactoriamente en el medio de
cultivo debido a que no la afecta la toxicidad del tetrationato. Para evitar la proliferacin de
especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina previo al agregado
de la solucin iodo iodurada. (MacFaddin, 1985)
El agar Salmonella-Shigella es una modificacin del agar citrato desoxicolato descrito por
Leifson. Se le considera un medio moderadamente selectivo segn el nivel de inhibicin de los
microorganismos Gram positivos y Enterobacteriaceae diferentes de Salmonella y Shigella, que
inhibe por contenido de sales biliares, verde brillante y citratos.
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Extender las muestras tan pronto como sea posible despus de recibirlas en el laboratorio. La
placa de extensin se utiliza principalmente para aislar los cultivos puros de las muestras con
flora mixta. Si, por el contrario, el material se cultiva directamente empleando una torunda,
hacerla girar en una seccin pequea cercana al borde, extendiendo luego a partir de esta rea
inoculada. Incubar las placas, protegidas de la luz, a una temperatura de 35 2 C durante un
perodo de 18 a 24 h o durante ms tiempo si es necesario. (MacFaddin, 1985)
2.3.4.2 SIEMBRA
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, con aguja de inoculacin inocular el
medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del mismo. (Ewing, 1985)
2.3.4.3 INCUBACIN
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Observar el color del medio de cultivo y la produccin de gas.
2.3.5.1 SIEMBRA
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2.3.5.2 INCUBACIN
En aerobios, a 35-37C durante 24-72 horas. Algunos microorganismos pueden requerir hasta
7 das de incubacin. (Murray, 1999)
- Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de cultivo.
(Murray, 1999)
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y
dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del
amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa,
acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la
urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella (Nicolet, 1986)
2.3.6.1 SIEMBRA
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos
microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin.
2.3.6.2 INCUBACIN
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2.3 TORTUGAS
Las tortugas (Testudines y Chelonios) forman un orden de reptiles caracterizados por tener
un tronco ancho y corto, con un caparazn o envoltura que protege los rganos internos de
su cuerpo. Como otros reptiles, son ectotermos que varan su temperatura interna en
funcin del entorno ambiental. Al igual que otros amniotas respiran aire y no ponen huevos bajo
el agua, aunque muchas especies viven en o cerca del agua (Velsquez-Reyes, 2010).
Actualmente, las poblaciones de tortuga blanca son tan bajas en Mxico que la recuperacin
quiz no sea posible en la mayor parte de su rea de distribucin. Las nicas poblaciones
viables de D. mawii existen actualmente en reas prcticamente inaccesibles para la mayora
de las personas (SEMARNAT, 2012).
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Hbitat: En Mxico se distribuye en los estados de Veracruz, Tabasco, Campeche, norte de
Oaxaca, norte de Chiapas y sur de Quintana Roo. Habita en ros, lagos y lagunas permanentes
con abundantes plantas acuticas emergentes, alrededor y dentro de las cuencas hidrolgicas
del Papaloapan, Coatzacoalcos, Grijalva - Usumacinta; as como en selvas inundables en la
poca de lluvias. (Urea-Aranda, 2007)
Reproduccin: De acuerdo con lvarez del Toro (1982), anidan dos veces en el ao (abril y
diciembre en Chiapas, Mxico) y segn Urea-Aranda (2007) la cpula se realiza cuando la
hembra permite la monta y permanece con poco movimiento y dura de 120 a 240 minutos
aproximadamente.
Acorde a la SERMARNAT (2012), Dermatemys mawii est legalmente protegida por diversas
leyes y acuerdos internacionales y est listada en la categora de en Peligro de Extincin (P) en
la NOM-059-SEMARNAT-2010.
Rhinoclemmys areolata es una tortuga de tamao medio con un alto caparazn de color marrn
oscuro con puntos de sutura y puntos amarillos moteados, llega a 207 mm de longitud de
caparazn. Su cabeza es estrecha, con un hocico ligeramente puntada y el maxilar superior
con muescas. La cabeza y el cuello son de color verde o marrn claro con un patrn muy
variable de rayas rojas y amarillas. (Vogt et al, 2009)
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Esta especie est considerada por la Norma Oficial Mexicana en la categora de Proteccin
Especial, lo que determina la necesidad de promover su recuperacin y conservacin.
(ZOOMAT, 2014)
Tortuga de tamao medio a grande (20-60 cm) de agua dulce, caracterizada por el rojo
prominente de manchas en cada lado de la cabeza. Trachemys scripta elegans es la
subespecie de mayor comercializacin. Cuando son juveniles su dieta es altamente y se vuelve
omnvora cuando adultos (Scalera, 2006).
El rea de distribucin natural de la tortuga de orejas rojas es en el valle del Mississippi (Burger
2009).
La principal amenaza que tiene esta especie es la sobre explotacin que est haciendo el
hombre, ya que no solamente aprovecha los individuos adultos sino que tambin trafica con las
cras de esta especie y extrae sus huevos o destruye sus nidos. (CONABIO, 2002)
MATERIAL Y METODOS.
Poblacin muestral
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Se realizar un muestreo al azar en una poblacin de 5132 iguanas distribuidas en 105
criaderos juveniles y 86 criaderos de adultos. Las muestras recolectadas sern: heces fecales
cloacales.
Toma de muestras
Las heces cloacales sern recolectadas por hisopado cloacal, para ello se introducir a travs
de la cloaca un hisopo estril haciendo movimientos de rotacin contra las paredes cloacales
garantizando suficiente muestra, todos los procedimientos de muestreo sern de acuerdo a la
gua Americam Society of Icthyologists and Herpetologists (HACC, 2014), que garantiza las
buenas practicas durante el muestreo de reptiles. Los hisopos sern transportados en caldo
tetrationato (compuesto generado en el medio de cultivo al reaccionar el tiosulfato de sodio con
la solucin iodo-iodurada).
Todas las colonias sern subcultivadas en agar de infusin cerebro y corazn (BHI, BD-BBL)
para garantizar su pureza, se observar su morfologa microscpica usando la tincin de Gram,
posteriormente se proceder inocularlas en una serie de pruebas bioqumicas especficas para
la identificacin de enterobacterias. Las pruebas usadas sern Agar sangre, Agar de Hierro y
Triple Azcar (TSI, BD-BBL), Indol, Caldo Urea, Voges-Proskauer, Agar citrato de Simmons
(BD-BBL), Agar de Hierro y lisina (LIA).
Identificacin molecular
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Para la obtencin de ADN genmico las colonias puras sern inoculadas en caldo BHI e
incubadas a 37 C durante 24 h. La suspensin bacteriana se centrifugar a 13 000 rpm durante
1 min y se recolectar la biomasa bacteriana. Se proceder a preparar una suspensin
bacteriana con 100 l de buffer TEN (30 mM TRIS-HCl pH 8; 5 mM EDTA pH 8; 100 mM NaCl),
30 l de SDS al 10 %, 100 l de NaCl 5 M y 20 l de Proteinasa K (20 mg/mL 10 mM Tris-HCl
pH 8), la suspensin ser incubada a 55C durante 2 horas. El producto obtenido ser purificado
con solucin de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) saturado con Tris-HCl 0.1 M pH 8, la
suspensin se centrifugar a 12 000 rpm durante 10 min con posterior recuperacin del
sobrenadante. La purificacin se realizar con Isopropanol y etanol helado al 70 %. El producto
de ADN obtenido ser suspendido en buffer de Tris-HCl 1M (pH 8) y EDTA 0.5 M para su
conservacin (Fitzgerald y col., 1997).
Para determinar la identidad bacteriana se realizar la amplificacin de gen rrs 16S rRNA. La
amplificacin se realizar en un termociclador C1000 marca BioRad, la polimerizacin se llevar
a cabo bajo las siguientes condiciones: un ciclo a 95 durante 4 min, seguido de 32 ciclos a 95
por 30 s, la temperatura de alineamiento fue de 60C por 45 s y la temperatura de extensin
fue de 72 C por 1 min. Se completar la reaccin con una extensin final a 72C durante 7 min.
Los oligonucletidos utilizados sern: fD2 5 AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3 y rP1 5 ACG
GTT ACC TTG TTA CGA CTT 3 (Weisburg y col., 1991). Los productos amplificados sern
analizados por electroforesis en gel de agarosa (2 %) a 80 V durante 1 h. Los geles obtenidos
se teirn con SyberGreen (Invitrogen) y las bandas sern visualizadas en un
fotoducumentador modelo Molecular Imager Gel Doc XR System marca BioRad. Se utilizar
marcador de peso molecular lambda 1 kb (Invitrogen, USA). La determinacin del ndice de
similitud de la bacteria se llevar a cabo con el algoritmo BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) del National Center for Biotechnology Information
(NCBI).
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